外因性Wnt1は、急性腎障害とその後の慢性腎疾患への進行を予防します

連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†、ヤニー周^2†、Dedong Wang^3†、フーピンリュウ⁴、Tianjun Guan³、Youhua Liu^1,5と梁翔暁^3*

¹臓器不全研究の国家主要研究所、腎臓病の国立臨床研究センター、腎臓内科、南方病院、南部医科大学、広州、中国、²中国厦門市北京中医薬大学付属のXiamenHospital腎臓内科³中国厦門市厦門大学付属の中山病院腎臓内科⁴内分泌学および糖尿病学科、厦門大学の最初の付属病院、厦門、中国、⁵米国ペンシルバニア州ピッツバーグのピッツバーグ大学医学部病理学科

研究は、Wnt/-カテニンアゴニストが急性腎障害（AKI）; ただし、AKIの予防と慢性腎臓病（CKD）への進行におけるその役割についてはとらえどころのないままです。 この研究では、腎臓のWnt /-カテニンシグナル伝達は、外因性Wnt1の過剰発現によって活性化されるか、-カテニンシグナル伝達の小分子阻害剤であるICG -001の投与によって阻害され、その後、マウスは虚血/再灌流傷害（IRI）を受けて誘発されました。 AKIとその後のCKD。 我々の結果は、AKIに対してIR保護されたマウスの前の外因性Wnt1のインビボ発現が、血液生化学的分析および腎臓組織学的分析の両方によって証明される、マウスにおけるAKIからCKDへの進行を妨げることを示した。 対照的に、IR前のICG -001の前処理は、腎臓のWnt/-カテニンシグナル伝達またはAKIからCKDへの進行に影響を与えませんでした。 機械論的に、IR前の外因性Wnt1のin vivo発現は、AKIマウスのアポトーシス促進タンパク質の発現を抑制し、AKIマウスとCKDマウスの両方で炎症反応を抑制しました。 さらに、外因性Wnt1は、in vitroでの低酸素再酸素化（H / R）処理によって誘導される尿細管細胞のアポトーシスを阻害しました。 結論として、本研究は、IR関連AKIおよびその後のCKDへの進行に対するWnt/-カテニン活性化の予防効果を支持する証拠を提供します。

キーワード：急性腎障害、慢性腎疾患、Wnt1、-カテニン、虚血再灌流傷害

の治療急性腎障害（AKI）：シスタンチェ

前書き

急性腎障害（AKI）は、薬物、虚血、敗血症、毒素などのさまざまな損傷による腎機能の急速な喪失による臨床症状です（Chawla and Kimmel、2012; Scholz et al。、2021）。死亡率。世界中で毎年約200万人が死亡しています（Belayev and Palevsky、2014）。 特に、AKIは、慢性腎臓病（CKD）または末期腎疾患（ESRD）の発症について広く認識されている独立した予測因子であり、医療システムに多大な経済的負担をかけています（Leung et al。、2013; Belayev and Palevsky、2014; Kurzhagenet al。、2020）。 残念ながら、AKIの予防と治療に効果的な薬はありません。

Wnt /-カテニンシグナル伝達は、器官形成、組織恒常性、および腎臓病を含むさまざまな疾患の発症に基本的な役割を果たします（Soni、2021）。 -カテニンは、構造タンパク質と転写調節因子の両方として機能することにより、二重の役割を果たします（MacDonald et al。、2009）。 膜結合型カテニンは接着接合複合体の一部であり、細胞間相互作用に寄与しますが、細胞質ゾルのカテニンはグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3（GSK -3）によってリン酸化され、ユビキチン化とプロテアソーム分解の標的となります。 しかし、このような-カテニンの分解は、多様な生物学的活性を持つ分泌型糖タンパク質のファミリーであるWntリガンドによって救済される可能性があります.Wntの結合は、核に移行し、遺伝子調節の転写因子として機能する-カテニンを安定化します。 特に、Wnt /-カテニンシグナル伝達は、損傷していない成人の腎臓では比較的抑制されていますが、急性および慢性腎損傷時に再活性化されます（Huffstater et al。、2020）。AKIの初期段階でのWnt /-カテニンの活性化は、腎臓の損傷を軽減し、回復を促進します。持続的なWnt/-カテニン活性化がAKIからCKDへの進行を促進する可能性があるのに対し、腎機能の低下（Xiao et al。、2016; Huffstater et al。、2020）。 したがって、Wnt /-カテニンシグナル伝達は腎障害における両刃の剣であり、より良い理解が必要です。特に、AKIとその後のAKI-CKDの進行の予防におけるWnt/-カテニン活性化の役割についてはとらえどころのないままです。

腎虚血再灌流傷害（IRI）は、AKIの主な原因と考えられています。 したがって、腎IRI動物モデルは、AKIおよびAKI-CKDprogressionの研究に一般的に使用されています（Bonventre and Yang、2011）。 AKIおよびCKDのIRIモデルにおけるWnt/-カテニン活性化の役割をそれぞれ解明するために、薬理学的アプローチと遺伝的アプローチの両方が使用されてきました。 リチウムおよびGSK-3阻害剤は、前臨床AKIモデルでWnt /-カテニンシグナル伝達を薬理学的に活性化するために一般的に使用されますが、それらの-カテニン非依存性効果について注意する必要があります（Bao et al。、2014）。GSKの遺伝子改変{{9 }}、-カテニン、またはWntリガンド（Wnt1およびWnt9a）は、AKIおよびCKDにおけるWnt /-カテニン活性化の役割を解明するために使用されています（Bonventre andYang、2011; Bao et al。、2014; Zhou et al。、2013、 2018; Liuet al。、2020）。 それにもかかわらず、AKIの予防におけるWnt/-カテニンシグナル伝達の役割に関する研究は非常に限られています。 本研究は、AKIの予防とその後のCKDへの進行におけるWnt/-カテニンシグナル伝達の役割を解明することを目的とした。

図1| IR前の外因性Wnt1のinvivo発現はAKIを防ぎ、マウスの腎カテニンを活性化します

(A)マウス治療グループ。 マウスは、BIRIの2日前に流体力学的尾静脈注射を介してpcDNA3（IRIとpcDNA3）またはPHA-Wnt1（IRIとPHA-Wnt1）プラスミドのいずれかで治療されました。 血清クレアチニンレベル(B)および血中尿素窒素（BUN）レベル(C) 測定されました。 (D) BIRIの1日後の腎臓形態の代表的な顕微鏡写真。 腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ染色にかけた。 ボックス領域が拡大されます。 矢印は尿細管を示しています。 スケールバー、200 µm。(E, F)マウスの腎臓における活性カテニンのウエスタンブロット分析。 * P<0。05対偽のコントロール（n=5）。><>

Cistancheは腎臓機能を改善します

材料および方法

動物実験

体重約22〜25gのオスのC57BL/ 6マウスは、Vital River Laboratory Animal Technology（北京、中国）から購入し、動物施設で飼育しました（温度：22±2°C、湿度：60±5％、12時間の暗/明サイクル）Southern Medical University（中国、広州）で、水と食べ物を自由に摂取できます。 動物実験は、南部医科大学の動物倫理福祉委員会によって承認されました。 すべての動物は、実験動物の世話と使用に関するガイドに従って治療された。

マウスにおけるAKIおよびCKDの誘発は、以前の研究で説明されています（Xiao et al。、2016; Zhou et al。、2018）。 両側腎虚血/再灌流傷害（BIRI）は、マウスでAKIを誘発するために広く使用されていますが、AKItoCKDの進行中の死亡率を増加させます。 したがって、片側性腎虚血/再灌流障害（UIRI）は、AKIからCKDへの進行に関する研究に使用されます。 簡単に説明すると、全身麻酔下でマウスに正中腹部切開を行い、微小動脈瘤クランプ（アイテム番号18051-35; Fine ScienceTools、Cambridge、United Kingdom）を使用して両側または左腎茎を30分間クリップしました。 手術中、体温は温度制御された加熱システムを使用して約37〜38℃に維持されました。

AKIに対するWnt/-カテニン活性化の予防効果を評価するために、流体力学を使用して、BIRIの2日前に1 mg / kgの血球凝集素（HA）タグ付きWnt1発現ベクター（PHA-Wnt1、UpstateBiotechnology）または空のベクター（pcDNA3）をマウスに注射しました。以前に報告されたベースの遺伝子導入技術（Xiao et al。、2016）。 血液および腎臓組織は、腎BIRIの1日後に収集されました。

AKIからCKDへの進行に対する初期のWnt/-カテニン活性化の効果を評価するために、マウスに1 mg /kgのWnt1発現プラスミドの毎日の流体力学的尾静脈注射またはICGの毎日の腹腔内注射のいずれかを行いました-001（{{4 }}、Chembest、上海、中国）UIRIの3日前に5 mg/kgで。 UIRIの11日後に血液と腎臓の組織を採取しました。 私たちの予備研究では、2日間のWnt1注射により、AKIマウスでWnt1の発現が誘導される可能性があります（データは示していません）。 AKIからCKDへの進行中にWnt1の発現を確実にし、延長するために、3日間のWnt1注射が選択されたことに注意する必要があります。

急性腎障害（AKI）は、腎機能の急速な喪失による臨床症状です。

細胞培養と治療

ヒト近位尿細管上皮細胞株（HKC -8）は、ジョンズホプキンス大学（米国メリーランド州ボルチモア）のL.Racusen博士から提供されました。 細胞培養は以前に記載されたように実施された（Zhou et al。、2013）。 HKC -8細胞を、100 ng /mLのヒト組換えWnt1（SRP4754; Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、United States）またはICG -001（847591-62-2、Chembest、Shanghai）で処理しました。 、中国）10 µMで4時間。 次に、細胞を低酸素ワークステーション（X 3- CK、Biospherix）で1％pO2で48時間インキュベートしました。 次に、細胞を2時間再酸素化した後、さまざまな分析のために収集しました。

図2| IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、AKIマウスの尿細管細胞アポトーシスとNF-κB活性化を低下させます

(A) 代表的な顕微鏡写真は、示されているように、異なるグループのTUNEL陽性細胞を示しています。 矢印は陽性染色を示します。 スケールバー、100 µm。(B)グラフィック表示は、示されているように、さまざまなグループの高倍率視野（HPF）あたりのTUNEL陽性細胞を示しています。(C–F)代表的なウエスタンブロット分析は、示されているように、異なるグループにおけるFasL、p53、およびBaxの腎発現を示しています。 *P<0。05対偽のコントロール。><0.05対pcdnaプラスミドを注入したiri（n=5 –="">(G) 示されているように、異なるグループのp65およびp-p65タンパク質の代表的なウエスタンブロット。

アポトーシスアッセイ

細胞をトリプシン処理し、収集し、PBSで洗浄しました。PEアネキシンV染色は、メーカーのプロトコルに従って実行しました。 フローサイトメーター（BD FACSCanto II、カリフォルニア州サンノゼ、米国）を使用してサイトメトリー分析を行い、PEアネキシンV陽性細胞と7-AAD陰性細胞の相対量を検出してアポトーシス率を測定しました。 各アッセイは3回行った。

クレアチニンと血中尿素窒素アッセイ

血清および尿中のクレアチニンレベル、ならびに血中尿素窒素（BUN）レベルは、自動生化学分析装置（AU480、Beckman-Coulter Inc.、米国カリフォルニア州ブレア）を使用して測定されました。

組織学および免疫組織化学的染色

腎臓切片および免疫組織化学的染色は、以前に記載されたように実施された（Liu et al。、2020）。一次抗体には、ウサギポリクローナル抗Wnt1（ab15251; Abcam、Inc.）、ウサギポリクローナル抗- -カテニン（ab15180; Abcam、Inc.）が含まれた。 。）、およびウサギポリクローナル抗フィブロネクチン（F3648; Sigma-Aldrich）。

ウエスタンブロット分析

以前に記載されたようにウエスタンブロット分析を行った（Zhou et al。、2019）。 一次抗体には、ウサギポリクローナル抗フィブロネクチン（F3648; Sigma-Aldrich）、マウスモノクローナル抗- -カテニン抗体（610154; BD TransductionLaboratories）、マウスモノクローナル抗- - SMA抗体（A2547; Sigma-Aldrich）、ウサギが含まれます。ポリクローナル抗Wnt1（ab15251; Abcam）、マウス抗- -チューブリン（T9026; Sigma-Aldrich）、マウス抗PAI -1抗体（AF3828; R＆D Systems）、抗活性-カテニン（＃05 –665; EMD Millipore）、抗Fasリガンド（FasL）（SC -6237; Santa Cruz、CA、United States）、p53（＃2524S; CST）、Bax（SC 20067; Santa Cruz）、p65（ ＃8242S; CST）、p-p65（＃3033S; CST）、PCNA（＃2586S; CST）。

RNA抽出とqPCR分析

全RNAの単離とqPCRは前述のように実施されました。 様々な遺伝子のmRNAレベルは-アクチンで正規化されました。 遺伝子のプライマー配列は補足表1に記載されています。

図3| IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、マウスにおけるAKIからCKDへの進行を防ぎます

(A)マウス治療グループ。 マウスは、UIRIの3日前に1mg / kgのpcDNA3（IRIとpcDNA3）またはPHA-Wnt1（IRIとPHA-Wnt1）プラスミドの流体力学的尾静脈注射、または5mg/kgのICG-001の腹腔内注射を受けました。 。 UIRIの11日後に血液と組織を採取しました。 血清クレアチニンレベル(B) および血中尿素窒素（BUN）レベル(C) 測定されました。(D) UIRI後11日目の腎臓形態の代表的な顕微鏡写真。 腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ染色にかけた。 ボックス領域が拡大されています。 矢印は尿細管を示しています。 スケールバー、1 0 0 µm。 * P <0.05;><0.01。 n="">

統計分析

すべてのデータは平均±SEMとして表されました。 データは、Sigma Statソフトウェア（Jandel ScientificSoftware、米国カリフォルニア州サンラファエル）を使用して統計的に分析されました。 グループ間の比較は、一元配置分散分析とそれに続くスチューデント-ニューマン-クールス法を使用して行われました。 P<>

CISTANCHE HERB BENEFITKIDNEY

結果

IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は急性腎障害を予防し、マウスの腎カテニンを活性化する

AKI予防におけるWnt/-カテニン活性化の役割を決定するために、BIRIの2日前に流体力学的尾静脈注射を介してマウスにHAタグ付きWnt1発現ベクター（PHA-Wnt1）または空のベクター（pcDNA3）を投与しました。（図1A）。 腎障害の2つのバイオマーカーであるクレアチニンとBUNの血清レベルは、BIRIの1日後にマウスで有意に増加し、AKIの存在を示唆しました（図1B、C）。 AKIマウスで観察（図1D）。 特に、AKIマウスの血清腎障害バイオマーカーと形態学的病変のこれらの変化は、外因性Wnt1によって著しく弱められました。 ウエスタンブロット分析は、外因性Wnt1がAKIマウスにおける腎カテニンの発現を促進することを明らかにしました（図1E、F）。 まとめると、これらの発見は、外因性Wnt1の前処理が腎カテニンを活性化し、マウスのAKIを予防することを示唆しています。

IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、尿細管細胞アポトーシスを減少させ、NuclearFactor-KappaBの活性化を阻害します

アポトーシスの調節がAKIに対する外因性Wnt1の保護効果の根底にあるメカニズムであるかどうかを調べるために、AKIマウスの腎臓組織におけるアポトーシスを同定するためにTUNEL染色を実施しました。 偽のマウスと比較して、IRIはアポトーシス率と、マウスの腎臓であるFasL、p53、Baxなどのアポトーシス関連タンパク質のレベルを著しく増加させました。（図2A–F）。 AKIマウスの腎臓におけるそのような変化は、IR前の外因性Wnt1のinvivo発現によって著しく減少しました。 核因子カッパB（NFκB）、特にそのヘテロダイマー型p65 / p50は、AKIマウスの腎臓における炎症反応の調節に重要な役割を果たします。 ウエスタンブロット分析は、p65とそのリン酸化型（p-p65）の両方が、IRI後のマウスの腎臓で著しく増加したのに対し、そのような変化は外因性Wnt1によって防止されたことを示しました。（図2G）。 これらの発見は、外因性Wnt1beforeIRのinvivo発現がアポトーシスを防ぎ、AKIマウスの腎臓におけるNF-κB活性化を阻害することを示唆しています。

図4| IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、AKI-CKD進行後のマウスの腎臓における内因性Wnt1および-カテニンをダウンレギュレートします

(A)代表的な顕微鏡写真は、示されているように、異なるグループでのWntおよび-カテニンタンパク質の発現を示しています。 スケールバー、50 µm。(B–E)示されているように、異なるグループにおけるWnt1、-カテニン、および活性-カテニンタンパク質レベルの代表的なウエスタンブロット分析。(F) 示されているように、異なるグループでのTGF-のmRNA発現。*P<0。05;><0.01。 n="">

IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は慢性腎疾患への急性腎障害の進行を防ぎます

次に、IRの前にWnt /-カテニンを活性化することで、AKIからCKDへの進行を防ぐことができるかどうかを調べました。 に示すように図3A、マウスは、UIRIの3日前にWnt1発現プラスミド（PHA-Wnt1）の流体力学的尾静脈注射またはICG-001の腹腔内注射のいずれかを受けた。 UIRIの11日後にマウスの血清クレアチニンとBUNの両方のレベルが上昇しました（図3B、C）。 さらに、マッソントリクローム染色により、UIRIの11日後のマウスにおける顕著な腎コラーゲン沈着および線維性病変が明らかになった。（図3D）。 これらの観察結果は、UIRI後のマウスにおけるAKIからCKDへの進行を示しています。 特に、CKDマウスで観察された血清腎損傷バイオマーカーと腎線維化の変化は、外因性Wnt1の前処理によってほぼ完全に防止されましたが、ICG-001では防止されませんでした。 したがって、IR前の外因性Wnt1のin vivo発現は、マウスにおけるAKIからCKDへの進行を防ぎます。

IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は腎臓の内因性Wnt1と-カテニンをダウンレギュレートします

さらに、CKDマウスの腎臓における内因性Wnt /-カテニンシグナル伝達に対する外因性Wnt1の影響を調査しました。図4Aに示すように、免疫組織化学的染色により、IRI後11日で内因性Wnt1と-カテニンの両方がマウスの腎臓で著しくアップレギュレートされたことが明らかになりました。 それらのタンパク質レベルは、外因性Wnt1の前処理によって大幅に減少しましたが、ICG-001では減少しませんでした。 ウエスタンブロット分析により、外因性Wnt1の阻害効果が確認されましたが、CKDマウスのWnt1、-カテニン、および活性-カテニン腎臓の内因性発現に対するICG -001は確認されませんでした（図4B–E）。 Wnt /-カテニニンおよびTGF-シグナル伝達経路は腎線維化でクロストークします。TGF-のmRNA発現はCKDマウスの腎臓で誘導され、そのような誘導は外因性Wnt1によって減少しましたが、ICG -001では減少しませんでした（図4F）。 したがって、外因性Wnt1の前処理は、CKDマウスの内因性腎Wnt/-カテニンシグナル伝達を阻害します。

図5| IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、AKI-CKD進行後のマウスの腎Wnt/-カテニン標的遺伝子をダウンレギュレートします

(A, B) 示されているように、異なるグループでのPAI-1およびMMP-7のmRNA発現。(C–E)PAI-1およびKlothoタンパク質レベルの代表的なウエスタンブロット分析。(F)KlothoのmRNA発現。 *P<{{0}}。05;><0.01。 n="">

IRがマウスのRenalWnt/-カテニン標的遺伝子をダウンレギュレートする前の外因性Wnt1のinvivo発現

偽のマウスと比較して、PAI-1とMMP-7のmRNA発現は、Wnt /-カテニンシグナル伝達の2つの直接下流標的であり、UIRIの11日後にマウスの腎臓で有意にアップレギュレーションされました。（図5A、B）。 ICG -001ではなく外因性Wnt1の前処理は、CKDマウスにおけるPAI-1およびMMP-7mRNA発現を阻害しました。 ウエスタンブロット分析は、PAI -1タンパク質レベルがCKDマウスの腎臓で増加したことを示しました。CKDマウスでは、外因性Wnt1の前処理によって廃止されましたが、ICG-001では廃止されませんでした。（図5C、D）。 Klothoは、Wntリガンドを結合および隔離することによる内因性Wntアンタゴニストです。 偽のマウスと比較して、クロトーのmRNAとタンパク質の両方のレベルは、UIRの11日後にマウスの腎臓で減少しました（図5E、F）。 ICG -001ではなく外因性Wnt1の前処理により、CKDマウスの腎臓におけるKlothomRNAおよびタンパク質の発現がほぼ完全に回復しました。 これらの発見はさらに、CKDマウスの内因性Wnt/-カテニンシグナル伝達腎臓に対する外因性Wnt1の阻害効果を示唆している。

IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、急性腎障害後のマウスの腎線維化を減少させる-慢性腎疾患の進行

次に、IR前のWnt /-カテニン活性化がCKDマウスの腎マトリックス遺伝子および線維性病変に及ぼす影響を調査しました。偽マウスと比較して、フィブロネクチン（FN）、コラーゲンI、コラーゲンIII、および-SMAのmRNA発現はUIRの11日後のマウスの腎臓（図6A–D）。このような変化は、外因性Wnt1の前処理によって減少しましたが、ICG-001では減少しませんでした。 ウエスタンブロット分析は、FNおよび-SMAのタンパク質レベルがCKDマウスの腎臓で有意に増加し、そのような変化は外因性Wnt1の前処理によって廃止されたが、ICGでは廃止されなかったことを示した-001（図6E–G）。 CKDマウスのFNタンパク質発現に対する外因性Wnt1およびICG-001の効果は、FN抗体を用いた腎臓免疫染色によって検証されました。（図6H）。 これらの発見は、外因性Wnt1の前処理が、IR誘発性CKDマウスの腎線維形成を予防することを示唆している。

図6| IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、AKI-CKD進行後のマウスの腎線維化を軽減します

(A–D)フィブロネクチン、コラーゲンI、コラーゲンIII、および-SMAのmRNA発現。(E–G)フィブロネクチンおよび-SMA-SMAタンパ​​ク質レベルの代表的なウエスタンブロット分析。(H)腎臓切片のフィブロネクチンの免疫染色。 *P<{{0}}。05; **="" p=""><0.01;><0.05。 n="5。">

IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、急性腎障害後の腎炎症を軽減します-慢性腎疾患の進行

偽のマウスと比較して、IL -1、IL -6、TNF-などの炎症性遺伝子のmRNA発現は、UIR後11日でマウスの腎臓で有意にアップレギュレーションされました。（図7A–C）。 このような変化は、外因性Wnt1の前処理によってほぼ完全に無効になりましたが、ICG -001ではありませんでした。ウエスタンブロット分析では、P65とそのリン酸化型（p-p65）の両方のタンパク質レベルが11日でマウスの腎臓で著しく増加したことが示されました。 UIRI後、CKDマウスにおけるNF-κBシグナル伝達の活性化を示す（図7D–F）。 特に、外因性Wnt1の前処理は、ICG -001ではなく、CKDマウスの腎臓のp65およびp-p65タンパク質レベルを有意に低下させました。これらの所見は、外因性Wnt1の前処理がCKDマウスの腎臓の炎症反応を予防することを示しています。

図7| IR前の外因性Wnt1のinvivo発現は、AKI-CKD進行後のマウスの腎炎症を軽減します

(A–C) マウスの腎臓におけるIL-1、IL -6、およびTNF-のmRNA発現。 (D–F)p65およびp-p65タンパク質レベルの代表的なウエスタンブロット分析。 *P<0。05;><0.01。 n="5">

外因性Wnt1はinvitroでの低酸素-再酸素化傷害によって誘発されるアポトーシスから管状細胞を保護します

AKIにおけるWnt1の役割をさらに特定するために、低酸素再酸素化（H / R）治療を使用してAKIのHKC-8管状細胞モデルを確立しました。 フローサイトメトリーを使用してアポトーシスを検出し、H/R処理後のHCK8細胞のアポトーシス率の上昇を明らかにしました（図8A、B）。 外因性Wnt1は、H /R処理後にHCK-8細胞のアポトーシスを著しく減少させました。ウエスタンブロット分析では、H / R処理により、FasL、p54、Bax、Parp{{4}などのアポトーシス関連タンパク質のレベルが大幅に増加したことが示されました。 }HCK-8セル内（図8C–G）。 このような変化は、外因性のWnt1によって減少しました。 これらのデータは、外因性Wnt1が尿細管細胞のH/R誘発性アポトーシスから保護することを示唆しています。

図8| 外因性Wnt1は、in vitroでの低酸素再酸素化（H / R）損傷によって誘発されるアポトーシスから尿細管細胞を保護します

(A)代表的なFACS分析は、Wnt1が低酸素/再酸素化（H / R）によって誘導される細胞アポトーシスを阻害したことを示しています。 HKC -8細胞を外因性Wnt1で前発現させた後、低酸素状態で48時間培養し、その後2時間再酸素化した。（B）グラフィックプレゼンテーションは、示されているように、さまざまなグループのアポトーシス細胞の割合を示しています。 PE標識アネキシンV陽性細胞をフローサイトメトリーでカウントしました。 *P<0。05対コントロール;><0.05対h （n="">(C) 代表的なウエスタンブロット分析は、HKC -8細胞におけるFasL、p53、Bax、およびParp-1のタンパク質発現を示しています。(D–G)グラフィック表示は、HKC -8細胞におけるFasL、p53、Bax、およびParp-1の相対的な存在量を示しています。 *P<0。05対コントロール;><0.05対h （n="">

討論

AKIの発生率は増加しており、CKDに進行する主なリスク要因ですが、AKIの予防と治療に効果的な治療法はありません。 心臓手術、尿細管内沈着、腎毒性薬の投与などの多くの状況が、AKIの発症につながる可能性があります（Mas-Font et al。、2017）。 これは、AKIの予防策の必要性を浮き彫りにします。

多くの研究がAKIの病因におけるWnt/-カテニン活性化の有益な効果を支持していますが、それはAKIのWnt/-カテニンアゴニストの予防効果についてはとらえどころのないままです。 本研究における1つの新しい発見は、IR前の外因性Wnt1のin vivo発現が、マウスをAKIから保護し、AKIからCKDへの進行を防ぐことができるということです。 腎両側IRの2日前の外因性Wnt1のinvivo発現は腎カテニンを活性化することができ、AKIマウスの腎アポトーシスと炎症の減少をもたらしました（IRの1日後）さらに、腎片側IRの3日前の外因性Wnt1のinvivo発現は阻害されました内因性Wnt/-カテニンシグナル伝達およびCKDマウスにおける腎線維化の発症の予防（IRの11日後）。 対照的に、腎IR後5日での外因性Wnt1のインビボ発現は、-カテニン活性化を誘導し、AKIからCKDへの進行を加速することが示された（Xiao et al。、2016）。 これらの研究は、Wnt /-カテニンアゴニストがAKIの予防と治療に使用される場合、それらのタイミングが重要な要因であることを示唆しています。

研究は、Wnt/-カテニンシグナル伝達の持続的な活性化がAKIからCKDへの進行を促進する可能性があることを示唆しています。 ICG 001は、Wnt/-カテニン/CREB結合タンパク質（CBP）シグナル伝達を選択的に阻害し、現在、さまざまな癌の臨床試験が行われています。 以前、IRの5日後にICG -011を投与すると腎機能が回復し、腎線維症の減少から明らかなように、AKIのCKDへの進行が妨げられることを示しました（Xiao et al。、2016）。 さらに、片側尿管閉塞（UUO）の3日後に開始するICG -001投与は、CKDmiceのUUOモデルの腎線維性病変を軽減することができました（Hao et al。、2011）。 しかし、本研究は、IRの3日前のICG -001の前処理は、腎臓のWnt/-カテニンシグナル伝達またはAKItoCKDの進行に影響を及ぼさなかったことを示しました。 Wnt /-カテニンシグナル伝達は無傷の成人の腎臓で非常に低レベルで発現されるため、これは驚くべきことではありません（Tanet al。、2014）。 それにもかかわらず、私たちの調査結果は、ICG-001投与のタイミングと期間がその治療結果を決定するために重要であることを示唆しています。

Wnt /-カテニンの保護効果の根底にあるメカニズムは、アポトーシスと生存経路の調節を伴う可能性があります。尿細管-カテニンの遺伝子除去は、IRIまたは葉酸治療後の尿細管アポトーシスを促進しますが、Wnt /-カテニンの活性化はアポトーシス促進タンパク質を抑制します（Wangetal。 、2009; Zhou et al。、2012）。 本研究では、外因性Wnt1は、AKIのIRImouseモデルとAKIのH / R誘導細胞モデルの両方で尿細管細胞アポトーシスを著しく阻害しました。これは、アポトーシスが、AKIおよびAKIからCKDへの進行に対する外因性Wnt1の予防効果の根底にある潜在的なメカニズムである可能性を示唆しています。 本研究はまた、AKIとCKDの両方におけるNF-κB活性化に対する外因性Wnt1の阻害効果を示し、炎症反応の抑制を示しています。 ただし、炎症の減少が保護の二次的効果であるのか、外因性Wnt1によって媒介される保護のメカニズムであるのかはまだ決定されていないことに注意する必要があります。 AKIに対する外因性Wnt1-を介した保護と、AKIからCKDへの進行の予防の正確なメカニズムを解明するには、さらなる研究が必要です。

Wnt /-カテニンモジュレーターを使用して、AKIおよびCKDを予防および治療します

結論

結論として、本研究は、IR関連のAKIおよびCKDに対するWnt /-カテニン活性化の予防効果を裏付ける証拠を提供しますが、外因性Wnt1がAKIおよびCKDから保護する正確なメカニズムを解明するにはさらに多くの研究が必要です。 AKIとCKDにおけるWnt/-カテニンシグナル伝達の二重の役割を考えると、本研究は、AKIの予防と治療にWnt/-カテニンモジュレーターを使用する場合のタイミングの重要性を強調しています。 より薬理学的および遺伝学的アプローチ、ならびに最適な治療のタイミングおよび期間を使用する将来の研究は、AKIの予防および治療におけるWnt/-カテニナゴニストの効果を調査するために保証されています。

FROM：外因性Wnt1は、急性腎障害とその後の慢性腎疾患への進行を予防します, Xue Hong^1†、ヤニー周^2†、Dedong Wang^3†、フーピンリュウ⁴、Tianjun Guan³、Youhua Liu^1,5と梁翔暁^{3 *}

フロント。 Physiol。、2021年11月8日| https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816