腎代替療法を必要とする患者における酸化ストレス指標としての、多血小板血漿中のキサンチンオキシドレダクターゼ活性

抽象的な背景: キサンチン酸化還元酵素(XOR) は、プリンの代謝に関与するヒドロキシラーゼ酵素です。 XOR 活性はさまざまです。ホモ二量体タンパク質は、2 つの異なるアイソフォーム XD (抗酸化剤) と XO (酸化促進剤) に変換されます。 酸化ストレスとそれに伴う炎症慢性腎臓病(CKD)、透析、腎臓移植により、血小板が活性化されました。 本研究は、適用された腎代替療法がキサンチン酸化還元酵素とそのアイソフォーム活性に及ぼす影響を判定することを目的とした。

材料と方法: 研究グループは 117 人の患者で構成され、血液透析患者 - 30、腹膜透析患者 - 30、腎移植患者 - 27、保存的治療 {{5}) の 4 つのグループに分けられました。 } 患者。 対照グループは 30 人の健康なボランティアで構成されました。 結果: 研究したグループ内で、乏血小板血漿 (PPP) の XOR 活性に有意な差が見つかりました (p=0.001)。 PPP におけるすべての酸化還元酵素アイソフォームの腎代替療法の種類との間には相関関係があった (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. The慢性腎臓病の原因は、PPP における XD および XO 活性の違いにも反映されました。

結論: CKD 患者に使用される腎代替療法の種類、患者の年齢、透析期間、CKD の原因、および進行段階は、XOR およびそのアイソフォームの活性に大きく影響します。

キーワード：キサンチンオキシドレダクターゼ、血小板、腎代替療法、慢性腎臓病、抗酸化酵素

シスタンシェが機能するまでどのくらい時間がかかりますか?

背景

キサンチン酸化還元酵素 (XOR) は、プリンの代謝に関与するヒドロキシラーゼ酵素です。 これは、ヒポキサンチンからキサンチンへの酸化、およびキサンチンから尿酸 (UA) への酸化を触媒します。 XOR 活性は変化する可能性があり、ホモ二量体タンパク質は 2 つの異なるアイソフォームに変換される可能性があります。 キサンチンデヒドロゲナーゼ (XD) は主に健康な組織で発現され、キサンチンオキシダーゼ (XO) は翻訳後 XD 修飾、システイン残基の酸化、および限定的なタンパク質分解によって生成され、損傷時の細胞および組織で主要な役割を果たします [1-3] ]。 言及されたアイソフォームの活性は互いに反対です[4]。 XOR は、NAD+ の存在下ではデヒドロゲナーゼとして作用し、酸素分子とともにオキシダーゼとして作用します。 さまざまなタイプの組織損傷において、抗酸化物質から酸化物質に迅速に変換する XOR の能力は、迅速な自然免疫応答にとって不可欠な要素であり、細菌または真菌感染症などに有益です [5]。

キサンチンデヒドロゲナーゼ (XDO) と酸素の反応中間体は NAD+ と O2 の両方と反応できますが、NAD+ に対してより高い親和性を示します [6]。 この中間アイソフォームは単離されていませんが、その活性を測定することで、XD から XO への変換の追跡が容易になります [7]。

さまざまな疾患における血清 XOR 活性は広く研究されています。 この酵素が注目される理由は、その作用の二重性、つまり抗酸化物質を生成する能力と、その一方で活性酸素種を生成する能力にあります。 XOR 活性の増加は、ウイルス性肝炎、感染性単核球症、自己免疫疾患、肺炎、統合失調症、II 型糖尿病などの病的状態で発生します。 XOR 活性の増加は、腎臓または肝臓移植後の患者の血清でも観察されます [8]。 XOR をコードする遺伝子は腎臓の成熟と腎臓における脂肪生成に関与している可能性があり、上皮細胞の間葉組織への形質転換を妨げる可能性があることが示されています [9]。 しかし、我々の知る限りでは、腎代替療法を受けている患者の貧血小板血漿（PPP）および多血小板血漿（PRP）におけるXOR活性を調査した報告は公表されていません。 このグループの患者における XOR 活性の重要性は、慢性腎臓病 (CKD)、透析、腎移植に伴う酸化ストレスや炎症によって引き起こされる血小板活性化の増加に関連しています。 さらに、透析や臓器移植中に組織や血管は損傷しますが、血小板は組織損傷部位に最初に到達する細胞であり、炎症プロセスと治癒の初期段階に積極的に関与します[10]。

PRP と PPP は、異なる血小板濃度を含む血漿の画分です。 PRPおよびPPPの血小板含有量は、それぞれ血小板/mlおよび血小板/mlである。 PPP および PRP は、ヒトの全血を異なる遠心速度で繰り返し遠心分離および洗浄することによって得られます [11、12]。

PPP は、抗凝固処理された血液の遠心分離副産物として、正常な血液よりも血小板濃度が低くなります。 PPP の主成分はフィブリノーゲン、フィブロネクチン、トロンビンです。 PPP の生物学的効果は、止血と凝固に関与し、細胞接着ベクターとして機能し、線維芽細胞と上皮細胞の有糸分裂を促進します [13]。 PPP は PRP ほど血小板に集中していませんが、PPP も細胞の成長と生存を維持できることが実証されています。 PPP は、創傷治癒に関連する細胞機能を促進し、細胞の遊走と線維芽細胞の増殖を加速します [14、15]。 多血小板血漿には、通常の血漿よりも濃縮された血小板が含まれています (約 150 ～ 400 × 103 細胞/dL)。 これは、文献における PRP の最も一般的な定義の 1 つです [16]。 現在までのところ、慢性腎臓病患者の多血小板血漿または血小板血小板血漿における XOR とそのアイソフォーム活性を特徴づけた研究は限られています。 タンら。 は、活性酸素種 (ROS) によって損傷を受けた細胞 (慢性腎代替療法の場合) XOR アイソフォームが「漏出」し、血漿中の酵素レベルの増加につながることを示しました [17]。 このメカニズムは、PPP と比較して血小板における XOR およびそのアイソフォームの活性が低いことを説明します。 したがって、PPP および PRP におけるオキシドレダクターゼの活性は、日常的に発生する細胞プロセスを明らかにするのに役立つ可能性があるため、非常に興味深いものです。 このような調査は、このグループの患者における酸化ストレスの重症度を間接的に浮き彫りにする可能性もあります。

ベリーら。 また、キサンチン酸化還元酵素が肝臓、小腸、乳腺、および内皮細胞に分布していることも記載されている。 細胞内局在化法により、細胞質および細胞膜上の両方にキサンチン酸化還元酵素が存在することが実証されています。 彼らはまた、血漿キサンチンオキシドレダクターゼが細胞膜からのキサンチンオキシドレダクターゼの陰影、または細胞質からの漏出に起因する可能性があることを示しています。 これが、血小板と血漿に含まれる他の血球の酵素活性を区別するために PPP と PRP の XOR 活性をテストする理由の 1 つです [18]。 抗酸化酵素の活性に基づいて、どのタイプの腎代替療法が患者を酸化ストレスにさらす可能性が低いかを判断することもできます。 XOR には二重の性質があるため、腎代替療法の種類と XOR アイソフォームの活性の関係を理解することは非常に興味深く、腎代替療法の種類を選択する際に役立ちます。

材料と方法

倫理的な承認と同意

シュチェチンのポメラニアン医科大学の生命倫理委員会は、実施された研究を承認しました (KB-0012/36/11 なし)。 対照群の健康なボランティアを含むすべての参加者は、研究の目的と範囲について知らされ、サンプルの提供と結果のデータの公開に同意しました。

研究グループ

参加者は 147 名で、対照群は健康なボランティア (NK) 30 名、およびシュチェチンのポメラニアン医科大学の腎臓学、惑星間学、および内科クリニックに通う慢性腎臓病 (CKD) 患者 117 名でした。 患者は、受けた治療に基づいて 4 つのグループに分けられました。 血液透析前後の患者 30 名 (HD A および HD B): 腹膜透析 (PD) を受けた患者 30 名。 腎移植前後（手術後5～7日）の患者27名（TE、TE A）。 30人の患者が保存的治療（CT）を受けた（CKDステージ2～5）。 性別、年齢、透析期間、慢性腎臓病の原因と段階、および試験群と対照群のクレアチニン濃度を表 1 および 2 に示します。

サンプル

血液サンプル (K2EDTA (8 ml)、3.8% クエン酸三ナトリウム (9:1; v/v)、および血清 (8 ml)) を研究参加者全員から採取しました。 血液透析を受けた患者の血液は動静脈瘻から採取されました。 他のすべての参加者には末梢静脈穿刺が使用されました。 ポンプ停止前（HD A）とポンプ停止約 10 分後（HD B）に血液透析患者からサンプルを採取しました。 移植患者の血液は、移植前 (TE) と手術後 5 ～ 7 日後 (TE A) に採取されました。 TE グループに集められた患者は、この研究の血液透析患者または腹膜透析患者のグループには属していませんでした。 彼らはポーランド全土から集まった移植の資格のある患者たちだった。 腎移植患者の大多数は事前にモード分析を受けていました。 Ｋ２ＥＤＴＡおよび凝固血液サンプルを２０度、２６００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、それぞれ血漿および血清を得た。 多血小板血漿 (PRP) と貧血小板血漿 (PPP) を得るために、クエン酸塩を加えて採取した血液を 1100 rpm、10 分間、20 度の条件で遠心分離しました。 得られた PRP を新しいチューブに移し、6000 rpm、20 度で 10 分間遠心分離しました。少血小板血漿 (PPP) を別のチューブに移しました。 血小板ペレットを２回洗浄し、Ｔｙｒｏｄａ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁した。 血漿、血清、PPP、および PRP は、アッセイが実行されるまで -80 度で凍結されました。 血液透析患者では、XOR 活性に対するヘパリンの影響を排除するために、ヘパリン投与前と平均 4 ～ 5 時間続く透析後 (ヘパリン半減期 - 4 時間) に血液を採取しました。

乏血小板血漿および血小板におけるキサンチン酸化還元酵素活性

測定は、Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P 分光光度計を使用して実行されました。 吸光変化は、340nm (XD) および 302nm (XDO、XO) で 30 度で 5 分間記録されました。 酵素活性は尿酸と NADH の生成 (A340 と A302 の増加) として測定され、mU × mL-1 (ミリ単位/ミリリットル) で表されました。 反応の初期速度を考慮して、酵素活性を計算しました。 尿酸生成は 302nm (アイソフォーム XDO および XO) で測定されました。これは、NAD+ 濃度の変化が寄与しない一方で、その吸光度が依然として高いためです。 NADH+ H+ の吸光係数 ε340=6.22× 103 [L・mol−1 cm−1 ] を使用して、キサンチン酸化還元酵素 NADH+ H+ のアイソフォームの活性を計算しました: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22]。

表1 研究に参加した血液透析患者（HD）、保存的治療を受けた腹膜透析（PD）（CKD）、腎移植（TE）、および対照群（C）の一般的特徴（平均値±SD）

P * - HD、PD、CKD グループ間の差異に関する統計的有意性、質的変数の TE および C の正確なフィッシャー検定。 量的変数の場合 - 一元配置分散分析および; P ** - HD、PD、および CKD グループ間の差異に関する統計的有意性、および量的変数に対する定性的変数に対する TE の正確なフィッシャー検定、一元配置分散分析、または; DM - 糖尿病性腎症。 HA - 高血圧。 GIK - 糸球体炎症腎臓。 ADPKD - 常染色体優性遺伝性多発性嚢胞腎。 NS - 統計的に有意な差はありません。

表 2 血液透析患者（B - HD 前、A - 後）、腎移植前後に保存的治療を受けた腹膜透析（PD）（CKD）（TE B および TE A）、および腎移植に参加した対照群（NK）の一般的特徴研究 (平均±SD)

P * - HD A、HD B、PD、CKD グループ間の差異の統計的有意性、量的変数の TE および C - クラスカル ウォリス分散分析、一元配置分散分析、またはスチューデントの t 検定 P ** - HD A 間の差異の統計的有意性、クラスカル ウォリスの ANOVA 量的変数または ANOVA 一元配置分析の HD B、PD および CKD および TE グループ Kt / V - 透析指数 (時間 t におけるクリアランス K によって精製された体積分率 V) NS 統計的に有意な関係は見つかりませんでした。

統計分析 分布を評価するために、KS テスト (コルモゴロフ-スミルノフ) が使用されました。これは、いくつかの変数 (PRP における XD および XDO アイソフォームの活性) の場合、パラメーターの非正規分布を示しました。 定量的データの分析には、正確なフィッシャー検定とカイ二乗検定が使用されました。 単変量系のスチューデントの t 検定と ANOVA 分析を使用して、正規分布を持つ変数の場合、関連する (ペアのある) 変数と無関係な (ペアでない) 変数間の差異が評価されました。 非正規分布の変数の場合、クラスカル・ウォリス ANOVA 分析を実行してパラメーター間の差異を評価したほか、不対データのマン・ホイットニー U ノンパラメトリック検定または対のあるデータのウィルコクソン検定を実行しました。 線形重回帰モデルを使用して、調査したパラメータ間の関係の多要素評価を決定しました。 結果の統計分析は、Statistica 12 (StatSoft) を使用して実行されました。