二価の弱毒化生インフルエンザウイルスワクチンは、ブタの漂流した H1N2 および H3N2 臨床分離株を防御します パート 1
Aug 02, 2023
概要：
インフルエンザ A ウイルス (IAV) は、多くの哺乳類種に伝染性の高い呼吸器疾患を引き起こす可能性があります。 豚では、IAV は感染しやすい集団に高罹患率かつ低死亡率の疾患を引き起こし、経済的および生産に重大な影響を与える可能性があります。 また、突然変異や遺伝子再集合の機会を与え、パンデミックの可能性のあるインフルエンザ株を生み出す可能性もあります。 したがって、豚のインフルエンザ感染を予防および制御することは非常に重要であり、そのための主な方法はワクチン接種です。
インフルエンザ A ウイルスは一般的な呼吸器感染症であり、感染力が非常に高く、幅広い人々に感染しやすいものです。 特に免疫力が低下している人にとって、A 型インフルエンザウイルスはより深刻な健康上の問題を引き起こす可能性があります。 したがって、A型インフルエンザウイルスの感染を防ぐために十分な免疫を維持することが非常に重要です。
私たちの体の免疫システムは、ウイルスや細菌の体内への侵入に対する防御の最前線です。 免疫系の基本的な機能は、白血球、リンパ球、抗体を通じて病原体の侵入に抵抗し、体の健康を維持することです。 したがって、良好な免疫機能は、さまざまな感染症から私たちを守るための重要な防御手段となります。
同時に、健康的な生活習慣も免疫力の強化に役立ちます。 十分な睡眠、適度な運動、バランスの取れた食事、ストレスの軽減などです。 これらの生活習慣は体内のホルモンや免疫因子の生成を促進し、免疫システムを強化します。
積極的な行動に加えて、ワクチン接種を受けることで体の免疫力を高めることもできます。 現在、A型インフルエンザウイルスに対するワクチンがあり、ワクチン接種によってインフルエンザウイルス感染を効果的に予防し、病気のリスクを軽減できます。 特に、高齢者、子供、妊婦などの感染しやすいグループでは、ワクチン接種にさらに注意を払う必要があります。
私たちの体の免疫力は静的なものではなく、年齢や環境などの要因によって変化することに注意してください。 したがって、私たちは常に注意を払い、免疫力を維持するために生活習慣を調整する必要があります。
要約すると、適切な免疫は、A 型インフルエンザウイルス感染を防ぐ重要な手段です。 睡眠、運動、食事などの健康管理やワクチン接種を調整することで、私たちの体をより健康にし、ウイルスの攻撃に対する抵抗力を高めることができます。 免疫力を高める必要があることがわかります。 シスタンシュは免疫力を大幅に向上させることができます。 肉に含まれる多糖類は、人間の免疫系の免疫反応を調節し、免疫細胞のストレス能力を改善し、免疫細胞の殺菌効果を高めることができます。
世界中のブタで最も蔓延している IAV のサブタイプは、H1N1、H1N2、および H3N2 です。 ただし、これらのウイルスの遺伝的多様性は地域によって大きく異なる場合があります。 当社は以前、2 つのカナダ豚インフルエンザ A ウイルス (swIAV) 分離株、A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] および A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2) を使用してエラスターゼ依存性二価弱毒生ワクチンを開発しました。 ) [SD69]、相同株から保護します。 この研究では、このワクチンがブタの防御をより最新のドリフト非相同 H1N2 および H3N2 株、A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] および A/Swine/AB/SD0435/ まで拡張することを実証します。 2019 (H3N2) [SD435]。
このワクチンは、血清と肺で強力な免疫応答を誘発し、ウイルスの複製とこれらの株に関連する肺の病理を減少させました。 したがって、この二価ワクチンは依然として北米の豚インフルエンザワクチン市場にとって有益となる強力な候補です。
キーワード:
インフルエンザ; ワクチン; 豚。
1. はじめに
インフルエンザ A ウイルス (IAV) は、ブタを含む多くの種にとって重要な病原体です。 感染は豚に伝染性の高い呼吸器疾患を引き起こす可能性があります[1]。 ブタのインフルエンザ感染は軽症で死亡率は非常に低いですが、群れ内の罹患率は 100% に達することがあります [2]。
これにより、感染した豚の体重増加が減少し、生産能力が低下し、雌豚の生殖障害が発生するため、農家は経済的損失を被ることになります[3、4]。
インフルエンザと他のブタ呼吸器病原体との同時感染は、ブタ呼吸器疾患複合体の発症につながり、その結果、死亡率と経済的損失の増加につながる可能性があります[5]。
さらに、ブタは気道に鳥類と哺乳類の両方のシアル酸ガラクトース結合が存在するため、鳥類とヒトの IAV、さらにはブタ IAV (swIAV) にも感染しやすいです [6]。
これにより、複数の株に同時感染した場合に再集合が起こる可能性があり、パンデミックの可能性のある新しい株の生産につながる可能性があります[4、7]。 ヒトは気道全体に同様のシアル酸ガラクトース結合分布を持っているため、ヒトとブタの間で双方向の波及事象が発生する可能性があります。
この現象が最初に知られているのは、1918 年のインフルエンザのパンデミックの際であり、このとき IAV がヒトからブタに導入されました [8]。 この系統は、ヒトおよび鳥類の H3N2 系統が循環している H1N1 系統と再集合して、H1N1、H1N2、および H3N2 サブタイプの二重および三重再集合系統を生成する 1990 年代まで、ブタ集団内で安定していました [8,9]。
新しく開発された三重再集合体遺伝子 (TRIG) カセットは、北米のブタにおける IAV の急速な多様化の時期をもたらしました [10]。 この TRIG カセットは非常に安定しており、さまざまな HA と NA の組み合わせの置換が容易になります [5]。
2005 年以来、ヒト HA および NA 遺伝子と対になったこの内部 TRIG カセットを持つ多くの系統が、米国の豚群全体に広がりました [9]。 次に注目すべき波及事象は 2009 年に発生し、ブタ由来の H1N1 株 (H1N1pdm2009) がヒトに広がり、2009 年のインフルエンザのパンデミックにつながりました [11]。 ヒトのパンデミックH1N1 IAV（H1pdm）のヒトからブタへの感染（逆人獣共通感染症）が北米のブタで複数回記録され、これが新たな系統と新たな再集合体swIAVの確立につながった[8、10、12]。
合計で、抗原的に異なる 7 つのクレードの H1 ウイルスと 4 つの異なるクレードの H3 ウイルスが北米のブタで記録されています [5]。 最近、アジアの swIAV 監視プログラムにより、H1pdm および三重再集合体内部遺伝子を持つ、優勢なユーラシア鳥様 (EA) 再集合体遺伝子型 4 (G4) ウイルスが同定されました。
この G4 ウイルスは検査を受けた養豚労働者の 10.4 パーセントで測定され、ヒトに感染する能力と、現在流行しているヒトウイルスとは異なる抗原性を備え、パンデミックの可能性を示すマーカーを示しています [7]。 したがって、養豚産業と公衆衛生の両方の観点から、豚のインフルエンザ感染を予防および制御することが非常に重要であり、そのための主な方法はワクチン接種です[4]。
米国では、最も一般的なタイプのワクチンは全不活化ウイルス（WIV）ですが、HA と NS を発現する RNA ベクター ワクチン{0}}切断型弱毒化生インフルエンザ ウイルス ワクチン（LAIV）も承認されています [4] 。 北米を含む世界中のブタで最も蔓延している IAV のサブタイプは、H1N1、H1N2、および H3N2 です [13]。
ただし、これらのウイルスの遺伝的多様性は地域によって大きく異なる可能性があり、カナダと米国では、特に H1 サブタイプ ウイルスにおいて swIAV の遺伝的進化に違いがあります [12]。 2009 年から 2016 年にかけてカナダで行われた監視では、米国で優勢だった H1 の遺伝クレード、H1g (1A.3.3.3) および H1d-1 (1B.2.2) がカナダでは検出されなかったことが示されました。カナダの H1 ウイルスは米国の H1 ウイルスとは大きく異なっていました [12]。
新しい H1 クレード (H1a-3) がカナダで確認されました。H1a-3 はマニトバ州で始まり、急速に成長し、その後カナダ全土および米国に広がりました。 H3 ウイルスに関しては、6 つの H3 系統がアメリカの豚 (IV-A から IV-F) で記録され、そのうち 3 系統がカナダの豚 (IV-B、IV-C、IV-E) で見つかりました [12] ]。
これは、効果的なワクチンプログラムを知らせるための地域的な監視と循環株の認識の重要性を強調しており、アメリカの豚で循環している IAV に基づいて設計されたワクチンがカナダの豚を保護できない可能性があることを示しています [12]。
以前は、2 つのカナダの swIAV 分離株、A/豚/アルバータ/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] および A/豚/サスカチュワン/SD0069/2015 (H3N2) を使用して二価ワクチンが作成されました。これらは H{{ 9}} 抗原グループとカナダ西部からの新しい H3 抗原グループ (ブタ クラスター IV-E) です [14]。 この新規ワクチンは、エラスターゼ依存型の SD191 および SD69、SD191-R342V、および SD69-K345V を使用して作られた弱毒化生ウイルスワクチンです。 研究では、SD191 と SD69 の両方、さらには同じくカナダ西部から分離された異種 H1N2 株 A/豚/サスカチュワン/SD0142/2015 (H1N2) に対して保護的であることが示されました [14]。
それ以来、循環する swIAV 株は漂流し続けています。 カナダ西部のブタからのより最近の臨床分離株は、カナダ、サウスカロライナ州サスカトゥーンのサスカチュワン大学ウェスタン獣医学部で野外サンプルから収集および分離されました。 A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] は H -3 抗原グループのメンバーですが、SD191 と比較して、54 の主要な H1 抗原部位のうち 5 つのアミノ酸置換があります [10,15, 16]。
A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] は IV-E クラスターのメンバーですが、6 つの主要な H3 抗原部位のうち 2 つのアミノ酸置換を含むように変動しています [17]。
この研究では、二価エラスターゼ依存性 LAIV が新たな臨床分離株に対して耐えられるかどうかを評価し、現在流行している swIAV 株 SD467 (H1N2) および SD435 (H3N2) で感染させた場合にブタを保護したと報告できます。
2。材料と方法
2.1. 細胞とウイルス
Madin-Darby 犬腎臓 (MDCK) (ATCC、#CRL-2936) 細胞は、10% ウシ胎児血清を含む最小必須培地 (MEM) (Sigma-Aldrich、M4655、セントルイス、ミズーリ州、米国) で維持されました。 (FBS) (Thermo Fisher Scientific、オタワ、オンタリオ州、カナダ 16000-044) を使用し、37 °C の加湿 5% CO2 インキュベーター内で保管しました。 A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] および A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV は、サスカトゥーンのサスカチュワン大学西部獣医学部の野外サンプルから分離されました。 、SK、カナダ。
ワクチンウイルス SD191-R342V および SD69- K345V は、以前に記載されているようにレスキューされました [14]。 すべてのウイルスは、1 μg/mL L-[(トルエン{ {11}}スルホンアミド)-2-フェニル]エチル クロロメチル ケトン (TPCK)- トリプシン (WT ウイルス) または 0.5 μg/mL ヒト好中球エラスターゼ (エラスターゼ依存性ウイルス) (Sigma-Aldrich、E8140)。
2.2. 動物実験のデザイン
24 頭の 4 週齢の swIAV 陰性ブタをプレーリー豚センター社 (サスカトゥーン、サウスカロライナ州、カナダ) から入手しました。 これらのブタをランダムに選択し、ワクチン接種グループあたり 7 頭、模擬ワクチン接種グループあたり 5 頭の 4 つのグループに分けました。
グループの割り当てを図 1A に示します。
これらのグループは、ワクチン接種グループに基づいて別の部屋に収容され（グループ A と B および C と D が一緒に収容）、感染前に 7 日間順応させました。 5 週齢 (0 日) と 8 週齢 (21 日) の時点で、A 群と B 群の豚には 4 mL の MEM を気管内に模擬ワクチン接種し、C 群と D 群にはワクチン接種を行いました。 4 mL MEM 中に各 SD191-R342V および SD69-K345V を 1 × 106 PFU 含む二価ワクチンを使用します。
10日後（31日目）、ブタにMEM（モック）または1×106 PFUのSD435-WT（H3N2）またはSD467-WT（H1N2）のいずれかを投与しました。 ブタは攻撃後 5 日間監視され、毎日直腸温度が測定され、1 日目、3 日目、および 5 日目に両方の鼻孔から鼻腔スワブが採取されました。血清ウイルス中和（SVN）アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）。
攻撃後 5 日目に、すべてのブタを人道的に安楽死させ、肺を摘出し、swIAV に特徴的な肉眼的病変の存在を評価しました。 ウイルス分離のために肺組織サンプルも収集されました (図 1B)。
2.3. 倫理声明
すべての動物手順は、サスカチュワン大学の大学動物管理委員会 (UACC) および動物研究倫理委員会 (AREB) によって承認されました。 このプロトコルは、2021 年 11 月 12 日に承認されました (動物使用プロトコル #20190064)。 すべての手順は、カナダ、サスカトゥーン、サスカトゥーンのサスカチュワン大学ワクチン感染症機構 (VIDO) のカナダ動物管理評議会 (CCAC) によって要求される基準に従って実行されました。
2.4. サンプリング
各鼻孔からの鼻腔スワブを、1×抗生物質抗真菌剤（Thermo Fisher Scientific、オタワ、オンタリオ州、カナダ、15240-062）を含む1 mLのMEMに入れ、qRT-PCRが実行されるまで-80℃で凍結しました。 すべてのブタは、エタノール (240 mg/mL ペントバルビタール ナトリウム; 4.5 kg あたり 2 mL) の静脈内投与により人道的に安楽死させられました。 安楽死の際、肺を完全に摘出し、赤紫色の硬い病変の割合と肺炎の両方を測定した。
パーセンテージは、肺葉の重量と肺全体の容積に基づいて決定されました [18]。 ウイルス力価測定のために、右心葉、心臓葉、横隔膜葉からも肺サンプルを採取しました。 これらの肺サンプルを、滴定のために、1×抗生物質-抗真菌薬を含む10パーセントw/v MEMと等量混合した。
図 1. 新しい臨床分離株に対する二価 LAIV の防御効果を評価するためのブタのグループ分けと試験デザイン。 豚（MEM/MEM グループの場合は n=5、二価/二価グループの場合は n=7）に、4 mL の MEM または 1 × 106 PFU で構成される二価ワクチンを気管内ワクチン接種しました。 0 日目と 21 日目の各 SD191-R342V および SD69-K345V。
31日目に、ブタにMEMまたは1×106 PFUのSD435 (H3N2)またはSD467 (H1N2)のいずれかを気管内投与した。 (A) この動物試験の免疫化、攻撃、およびサンプル採取のスケジュール。 24 頭の生後 4 週齢の swIAV 陰性ブタを感染前に 7 日間順応させた。 5週齢（0日目）および8週齢（21日目）の時点で、グループAおよびBのブタには4mLのMEMを気管内に模擬ワクチン接種し、グループCおよびDには二価ワクチンを接種した。 4 mL MEM に SD191−R342V および SD69-K345V のそれぞれ 1 × 106 PFU が含まれています。
10日後（31日目）、ブタにMEM（モック）または1×106 PFUのSD435-WT（H3N2）またはSD467-WT（H1N2）のいずれかを投与しました。 ブタは攻撃後 5 日間監視され、毎日直腸温度が測定され、1 日目、3 日目、5 日目には両方の鼻孔から鼻腔スワブが採取されました。
１回目（２０日目）および２回目（３０日目）のワクチン接種後に血清を採取した。 攻撃後５日目（３６日目）に、すべてのブタを人道的に安楽死させ、評価のために肺を摘出した。 (B) BioRender.com で作成。
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