知覚の変化で過去と未来の学びをつなぐ回路メカニズム 後編
Sep 28, 2023
知覚の変化を引き起こす制御回路を解明
次に、この学習誘発性の知覚の変化を媒介する回路メカニズムを特徴付けるために、大脳腹側 1a (CV1a) とパターン反転ニューロン (PRN) という 2 つの高次介在ニューロンの活動を測定しました。 これらの細胞は、それぞれ摂取回路と排出回路のコマンドのようなニューロンであり、アクティブな場合、それぞれの運動プログラムを駆動するのに十分です (16、31)。 細胞内記録により、ナイーブ動物と比較して、強力なトレーニング後 4 時間で CV1a 活性が有意に上方制御される一方、PRN 活性は大幅に下方制御されることが示されました (図 3、A ～ E)。
知覚の変化とは、考え方の変化と精神の調整です。 これには、周囲の環境の認識、自己アイデンティティの認識、個人の経験の理解、目標と願望の追求が含まれます。 知覚の変化は、人々が人生に対してより前向きなアプローチを取り、課題にうまく対処することを促すことができます。 そして、この前向きな姿勢と考え方は人々の記憶力を向上させることができます。
まず、認識の変化により、人々は自分の人生のポジティブなことにもっと集中できるようになります。 「楽観的な顔を探して」にもあるように、人生にはポジティブな要素がたくさんあるのに、それを見つけられないことがよくあります。 そして、認識の変化を通じて、私たちはこれらのポジティブな要素をより鋭く認識し、それらに十分な注意と重要性を与えることができます。 これらの楽観的な要素は、私たちの幸福を蓄積するだけでなく、人生の情報をよりよく把握することを促進し、それによって記憶力を向上させます。
第二に、認識の変化は、人々が自分の長所、短所、価値観などを含む自分自身をより深く理解するのにも役立ちます。この自己認識の深化により、人々は自分の感情やストレスをより適切に管理できるようになり、目標や願望を追求する意欲が高まるようになります。 この種の野心とモチベーションは、人々の脳を刺激して創造性と思考力を高め、記憶力をさらに向上させることができます。
最後に、知覚の変化により、人々は自分自身の経験や成長にもっと注意を払うようになります。 成功でも挫折でも、すべての経験は貴重な財産です。 認識の変化を通じて、私たちはよりよく振り返り、要約することができ、自分の成長点や欠点をよりよく発見できるだけでなく、経験や教訓をよりよく吸収して記憶することができます。
つまり、認識の変化は、単なる精神的な調整ではありますが、私たちの生活と学習に非常に良い影響を与える可能性があります。 前向きで晴れやかな態度があれば、課題にうまく対処し、成長を追求し、情報をよりよく習得し、内容を記憶することができます。 認識の変革に積極的に投資し、成長と品質を継続的に向上させましょう。 記憶力を向上させる必要があることがわかります。 カンクサにはアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。 これらの物質は記憶と学習にとって非常に重要です。 さらに、肉は血流を改善し、酸素の供給を促進するため、脳に十分な栄養素とエネルギーが確実に供給され、脳の活力と持久力が向上します。
我々は、この学習駆動型の拮抗活動の関係は、共通の回路モチーフ、つまり競合する回路間の抑制によって説明できると推論しました (32)。 このシナリオでは、1 つのネットワークでの活動の上方制御が、敵対的なネットワークでの抑制を促進する役割を果たします。 これを裏付けるように、CV1a は自発的および PRN 駆動の両方の排泄サイクル中の延長期を通じて大きな抑制入力を受け取ります (図 3F)。 これらの抑制入力は PRN から直接生じたものではなく、下流のニューロンが動員されたことを示唆しています。
Fig. 2. Previous learning alters the perception of future training by shifting the feeding network state. (A) Example frames showing mouth movements during ingestion or egestion. Frames are color-matched to (B) (red: ingestion, blue: egestion). White dots indicate the distal tip of the radula tracked during bite classification. Scale bar, 0.5 mm. (B) Heat plots of radula movements during the first 15 bites in response to the CS + US during weak training in animals receiving weak training only versus animals receiving vital training 4 hours earlier. Red-white-blue lookup table represents radula movements. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (C) Statistical summary of (B) shows a significant change in the mean difference in radula movements between conditions (two-tailed t-test, P < 0.01, t = 3.1). (D) The plot of the fraction of ingestion/egestion bites produced during weak training shows a significant difference between conditions(Fisher's exact test, P < 0.01). (E) The plot of fraction of animals performing no egestion bites versus >{{0}} の排出バイトは、条件間で有意な差を示します (フィッシャーの直接確率検定、P < 0.001)。 (F) 摂取および排出サイクル中の in vitro 調製物における B11 および N2v 活性。 B11 は、摂取中の収縮期と摂取中の前進期で主に活性です。
N2v activity does not change during ingestion and egestion cycles. B11 is therefore a readout of ingestion versus egestion. Gray lines represent the retraction phase onset. (G) Heat plots of B11 activity during fictive feeding cycles. Lookup table colors are normalized B11 spike differences. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (H) Statistical summary of (G) shows a significant change in the 11 spike difference between conditions (Mann-Whitney test, P < 0.01, U = 70). (I) The plotof fraction of ingestion/egestion cycles shows a significant difference between conditions (Fisher's exact test, P < 0.001). (J) The plot of the fraction of preparations producing no egestion cycles versus >{{0}} の排出サイクルは、条件間で有意な差を示します (フィッシャーの直接確率検定、P < 0.001)。 ああ、何時間も。
次に、これらの入力のソースを特定するために、次の基準を満たすニューロン タイプの広範な検索を実行しました: (i) 活性時に CV1a を阻害する必要がある、(ii) 摂取の延長期中に活性である必要がある(iii) PRN 活動によって励起される必要があります。 蛍光標識アプローチを使用して、ほとんどの栄養回路が収容されている頬神経節から突出するニューロンを明らかにし(33)、我々は、3つの基準をすべて満たす単一の候補ニューロンタイプ、パターンスイッチ1(PS1)を同定した(図4A)。 。 まず、PS1 を人為的に刺激すると、同側の CV1a が単シナプス的に阻害されました (図 4、B および C)。 第二に、このニューロンは、CV1aが阻害された場合、PRN駆動型および刺激駆動型の両方の排泄サイクルの延長期中に強く活性でした（図4Dおよびf図S9A）。 第三に、PRN 活動は PS1 を単シナプス的に興奮させ、1:1 の興奮性シナプス後電位 (EPSP) として観察されました (図 4、E および F)。 PS1が、摂食行動中のCV1a阻害の唯一の原因であるかどうかを確認するために、PRN駆動サイクル中のPS1の活性を人為的に操作しました。 過分極すると、CV1a 活性が大幅に増加しました (図 4、G、および H)。通常受け取る相性抑制性シナプス入力の証拠はありません。 さらに、PS1の過分極は、感覚主導の摂取サイクル中にCV1a活性を増加させるのに十分でした（図S9B）。 したがって、この極めて重要な抑制性ニューロン タイプは、行動選択中のスイッチとして機能し、摂取中の摂取指令中枢の破壊的な活性化を防ぎます。
CV1a は PRN と単シナプス結合を持たないため、CV1a が活性化しているときにどのようにして確実に排出を抑制するのでしょうか? 我々は、制御回路の2番目の構成要素である頬側介在ニューロンタイプであるPS2を特定することで、この質問に答えることができました。これはPRNと強く電気的に結合しており、強力な排出サイクルを駆動するのに十分です（図S9、C、およびD）。 それはCV1aから強い促進阻害を受けるため、摂取サイクルが生成されると排出の抑制につながります（図S9、E、およびF）。 さらに、PS2の人為的活性化は、PS1への単シナプス興奮性結合を通じて生じるCV1aへの多シナプス抑制性入力を引き起こした(図S9、G、およびH)。 まとめると、これらの結果は、相互阻害が競合回路の活性化を防ぐために使用され、この回路モチーフが可塑性が作用する制御点を提供することを示しています（fFigS9I）。 次に、学習事象の認識にバイアスをかける際に、排出回路の抑制が果たす可能性のある役割を調査しました。
知覚制御回路の操作により生体内での新たな学習が可能になる
摂食行動の発現に有利であることを考えると、PRN → PS1 活性の低下は、弱いトレーニングに対する動物の認識を変え、それによって記憶獲得を強化するのに十分である可能性があると推論しました。 これを調査するために、我々は PRN 出力経路を操作できる薬理学的戦略を開発しました。 我々は以前、このニューロンがドーパミン作動性であり、D2受容体遮断薬であるスルピリドが後続運動ニューロンに対するその作用を阻害するのに非常に効果的であることを示した(16)。 ここで、PRN → PS1 接続もスルピリドの影響を受けやすく (図 5、A および B)、PRN → PS1 EPSP の振幅が大幅に減少することが確認されました。 次に、この接続をブロックすることで、強力なトレーニングの 4 時間後に観察された CV1a 活性の増加を模倣できるかどうかをテストしました。 我々は、スルピリドが治療前と比較してCV1aサイクル活性の強力な上昇を引き起こすことを発見しました（図5、C、およびD）。これは、スルピリドの適用が摂取イベントに対して活性を偏らせることを示した以前の研究と一致しています（16）。 したがって、スルピリドはネットワーク状態を強力に変更し、強力なトレーニングの効果を置き換えることができます。 したがって、この薬剤は、この経路が弱い訓練に対する動物の認識の変化の基礎となっているかどうかを生体内でテストする機会を提供する。 動物にはスルピリドまたは生理食塩水のいずれかを注射し、図 2 (A および B) にあるように摂食反応を測定しながら弱いトレーニング プロトコールを受けました。 我々は、スルピリドを注射した動物は、生理食塩水を注射した動物よりも弱い訓練に応じて有意に多くの摂取事象を実行し（図5、EからG）、有意に多くのスルピリドを注射した動物は全く摂取反応を示さなかった（図5）ことを発見した。 .5H）。 さらに、スルピリド注射後の状態間の遷移確率は大幅に減少しました（図S10、AからD）。 したがって、激しいトレーニングとスルピリド注射の両方が、in vitro でネットワーク状態を変化させ、in vivo で弱いトレーニングの認識を安定させます。
次に、強いトレーニングの場合に示したように、スルピリドによって引き起こされる知覚の変化が、弱いトレーニング後のLTMの獲得に十分であるかどうかをテストしました。 動物にスルピリドまたは生理食塩水を注射し、1日後にLTMテストによる弱いトレーニングを受けました。 強い訓練の効果と一致して、弱い訓練の前にスルピリドを注射された動物は、ナイーブまたは生理食塩水を注射された訓練された動物と比較して、GNLに対して有意に大きな反応を示したことがわかりました（図5I）。 さらに、弱いトレーニングを行わなかった場合のスルピリド注射は、1日後にテストした場合、GNLに対する摂食反応を増加させませんでした（図5I）。 したがって、ネットワーク状態を薬理学的に操作すると、動物が記憶を獲得して完全に固定化するのに十分な弱い訓練に対する認識の変化が引き起こされます。
次に、重要なトレーニング後のネットワーク状態における特定された学習誘発性の変化が、元の強力な記憶の発現に関与しているのか、それともこれが将来の学習イベントを強化するという目的を果たす並行プロセスであるのかを調べました。 これをテストするために、動物にスルピリドまたは生理食塩水を注射し、事前のバイタルトレーニングを行わなかった場合の強力なトレーニング CS (AA) に対する反応を記録しました。 私たちは、学習によって引き起こされるネットワーク状態の変化が元の記憶の発現に関与している場合、同じ変化をネットワークに人為的に誘発することによって、激しいトレーニングに使用される CS (AA) に応じた摂食行動が増加するのではないかと仮説を立てました。スルピリドを使用した状態だが、事前の重要なトレーニングを受けていない場合。 しかし、本発明者らは、スルピリド注射は、ナイーブ動物または生理食塩水を注射した動物と比較して、AAに対する応答の増加を引き起こさないことを発見した(図5J)。 したがって、バイタルトレーニングはネットワーク状態の変化を引き起こしますが、この学習誘発性の変化は強力な記憶自体の発現には積極的に関与しておらず、異なるメカニズムが関与していることが示唆されています。 まとめると、これらの結果は、強力な学習が神経活動に並行した変化を引き起こすことを示しています。1 つは記憶そのものの表現であり、もう 1 つは将来の意欲的な学習の認識の変化です。
記憶に関連した認識の変化は、代替トレーニングパラダイムに一般化します
ここで特定されたメカニズムはどのような役割を果たすのでしょうか? 時間的に密接に関連する強い学習イベントと弱い学習イベントを結び付ける能力は、リムナエアがこの能力を利用して、たとえば動物が豊かな環境に到着した時期と一致する「学習が豊富な」期間を特定できることを示唆している。 そうであれば、強いトレーニングと弱いトレーニングの両方で同じ米国に依存するのではなく、学習が一般化されるべきであることが期待されます。 この重要なアイデアをテストするために、我々は、弱いトレーニングプロトコルで使用されるスクロース US を、Lymnaea の代替食欲刺激として知られている L-セリン (図 6A) に置き換える実験を実施しました (29)。 したがって、CS と US は両方とも、2 つの異なるトレーニング パラダイムにわたって異なります。 我々は、GNL + L-セリンのペアリングだけでは条件反応をもたらさない一方で、強力なトレーニングを先行させると、GNLに対する強力な1-日記憶発現が見られることを発見しました（図6B）。 したがって、記憶の発現は 1 つの US に限定されるのではなく、さまざまな関連付けの形成を可能にし、新しい記憶を形成するための閾値を一般的に低下させるのに非常に適していることを示唆しています。
議論
新しい関連付けを学習する能力は、予測不可能な環境で生き残るために重要です。 記憶の獲得と固定化がエネルギー的にコストのかかるプロセスであることを考えると (1、2、34)、何をいつ学習するかの決定に役立つ戦略を使用することには重要な潜在的な利点があります。 ここでは、過去の出来事が認識を偏らせるために利用されるリムナエアの単純なメカニズムを特定します。 特に、このメカニズムが将来の学習を導き、以前は無視されていた関連性の記憶獲得を促進できることも実証し、その原因となる神経回路を解明しました。 私たちは、これが動物に資源を効率的に新しい学習に向けるよう警告するのに役立つと提案します。最近の経験では、肯定的な関連付けを形成することに特別な利点がある可能性があることが示唆されています。
私たちが解明したメカニズムの重要な特徴は、強力な学習が脳内で並行プロセスを開始することです。1 つは元の記憶の発現のため、もう 1 つは将来の学習イベントの認識を変更し、新しい記憶の獲得を促進するためです。 ネットワーク状態が薬理学的に変化したときに誤った記憶が存在しないことからわかるように、強力なトレーニング後に測定されたニューラルネットワーク状態の変化は元の記憶の発現には十分ではないため、これらは独立しているように見えます。 同様の並行経路がマウスの条件付け実験で確認されています。 たとえば、嗅覚識別課題では、広範なトレーニングにより梨状皮質の錐体ニューロンの興奮性が変化し、同時に新しい課題を学習する能力（ルール学習）が強化されましたが、これは元の記憶の発現とは相関しませんでした（35）。 、36）。 したがって、これらの学習誘発性の変化は、記憶を表現する「エングラム」の一部ではありませんが、それでも動物の重要な適応機能を果たし、過去の経験を将来の行動の指針として利用できるようにします。このプロセスは、おそらく思い出すことと同じくらい重要です。記憶そのものの。
私たちが特定したメカニズムは、重要なタイミング特性を示しています。 これにより、強力なトレーニング後 30 分から最大 4 時間まで学習能力が強化され、重要な時間枠で新しい記憶の獲得が促進されることが示唆されます。 私たちの以前の研究からわかるように、この時間枠は強力なトレーニングのための中期記憶の出現と一致しており、LTM の出現まで続きます (17)。 この時間枠にわたるこの記憶の発現はタンパク質合成に依存しますが、より短い 10- 分の時点で記録された記憶トレースはそうではありません (17)。 これは、今回の研究で特定されたネットワーク状態の変化もタンパク質合成に依存していることを強く示唆しており、強力なトレーニング後10分では効果が存在しないことを説明しています。 さらに、強化された学習能力は、より長い時点では維持されません。弱い学習記憶の形成は、約 6 時間以降は消失しますが、元の強力な記憶は依然として存在し、表現可能です。 したがって、学習によって引き起こされるネットワーク状態の変化は一時的に引き起こされ、強力なトレーニング後の最初の 6 時間の元の記憶の固定化に必要であることが知られている分子機構を超えて持続することはありません (37)。 私たちは、過去の学習による知覚の永続的な変化は動物にとって有害であり、エネルギー的にコストがかかり、潜在的に不適応な記憶につながる可能性があると仮説を立てています。 また、強力なトレーニングの後に弱いトレーニングを行うという厳密な時間的順序も必要です。 これは、シナプスのタグとキャプチャに基づいて記憶の相互作用と強化を促進する、以前に特定されたプロセスである行動タグ付け (38、39) とは異なります (40、41)。 行動タグ付け中、弱い学習イベントによって動き始めたタグは、2 つの学習イベントの時間的順序に関係なく、強い学習イベントによってターゲット化され、強化されます (42、43)。
行動タグ付けのこの重要な特徴は、学習イベント自体ではなく、イベントの記憶の変更につながります。 対照的に、ここで私たちが特定した学習によって引き起こされる認識の変化は、動物が最近獲得したどの記憶をさらに強化する必要があるかではなく、将来のどの出来事について学ぶべきかを決定するように導きます。 このように、2 つのメカニズムにはいくつかの類似点があり、どちらも統合された長期記憶の数を増やす役割を果たしますが、異なる状況下で機能し、異なる回路メカニズムを使用します。 また、2 番目のタイプの弱い食欲トレーニングも過去の強い学習によって強化される可能性があるため、学習によって引き起こされる認識の変化が他の形態の食欲学習にも一般化することを示します。 同様の全般的な学習能力の強化がマウスでも発見されており、海馬に依存した嗅覚識別学習が海馬のネットワークを「学習モード」に切り替え、空間学習などの他のタイプの海馬に依存した教育を強化すると考えられている(44)。 ）。 Lymnaea で確認されたメカニズムの時間経過と非特異的性質は、動物に「学習が豊富な」時期を警告する役割を果たし、単独で遭遇した場合には無視される可能性が高い合図と積極的な関連付けを可能にする可能性があります。
強いトレーニングの後に弱いトレーニングが促進されるメカニズムは何ですか? 我々は、ナイーブな動物が摂取行動と排出行動の間の弱い訓練「フリップフロップ」、または移行にさらされたことに注目し、これは動物が訓練中にCS + US刺激の双安定な知覚を持っていることを示唆しており、これは曖昧な期間を表しています（ 45）。 特に、強い訓練は摂取行動を有利にするように弱い訓練に対する動物の認識を偏らせ、安定させることもわかりました。 我々は、外部刺激がない場合でも同じスイッチングがインビトロで持続するため、弱いトレーニング中の双安定知覚は摂取回路と排出回路の相対的な活動の創発的な特性であることを示唆しています。 2 つの回路間の接続性を特徴付けることで、競合相互作用が相互阻害回路モチーフによるものであることを示し (32, 46)、行動選択が勝者総取りモデルによって生成される可能性が高いことを示唆しています。 排出回路からのフィードフォワード抑制は、摂取回路（PRN + PS2 → PS1 → CV1a）の同時活性化を防ぎますが、摂取回路は電気的に結合された排出回路の一部（CV1a → PS2）を直接抑制します（図6Cおよび図S9I）。
両方の回路は中央パターン発生器 (16、31) を供給する同じコアによって神経支配されているため、サイクル表現は最初の回路によって決定され、もう一方を抑制するのに十分なスパイク レートしきい値に達すると提案します。 強力なトレーニングの後、2 つの回路の相対的な活動に変化があり、そのため摂取サイクルの発現が支配的になります (図 6C)。 マウスの恐怖条件付けの際にも同様の回路モチーフが見られ、逃避またはすくみという 2 つの相容れない行動のうちの 1 つが生成される可能性があります。 学習により、扁桃体中央部にある相互に抑制する 2 つのクラスのニューロンのバランスが変化し、どちらか一方の行動に発現が偏ります (47)。 しかし、Lymnaea では、学習によって引き起こされる活動の変化は記憶の発現には使用されず、むしろ新しい学習の促進に使用されます (図 6C)。 我々は、摂取回路からのフィードフォワード阻害をブロックすることによって摂取回路を薬理学的に安定化することが、生体内での弱い訓練中に動物のCS + USの認識を変えるのに十分であることを示す。 さらに、これが強力な記憶の獲得の代わりとなり、ネットワークの状態を変化させて新たなポジティブな関連付けを可能にすることを示し、学習イベント中のあいまいさを減らすことで記憶の形成が促進される可能性があることを示唆しています。 人間を対象としたこれまでの研究では、事前の学習によって知覚の感度を調整する注意の制御が変化する可能性があることが実証されており (3-5)、注意は知覚の多重安定性に役割があることも示されています (45, 48)。
この研究では動物の知覚読み出しのみが測定されましたが、ここで特定されたメカニズムには、弱い訓練の知覚を調節する可能性のある注意の変化も含まれている可能性があります。 弱いトレーニングにさらされる前にネットワーク状態の変化が存在するという事実は、将来の学習イベントの認識を調整する予期的注意メカニズムが存在することを示唆している可能性があります。 しかし、そのような注意の変化が関与している場合、それは知覚を調整することしかできないため、強力なトレーニングの約30分後から新しい記憶の形成が強化されます。
摂取イベントに向けてネットワークが安定すると、なぜ弱いトレーニングが容易になるのでしょうか? 簡単な説明の 1 つは、摂取中に動物が CS と US を積極的に口腔に引き込み、次に食道に引き込み、それぞれを飲み込めるようにするということです。 これは、内容物が口腔から効率的に排出される排出とは対照的です。 これまでの研究では、in vitro コンディショニングの成功は、US が食道に到達し (17)、食道ニューロンを活性化する (49) かどうかに依存し、食道ニューロンが後続ニューロンの D1 受容体活性化を介して CS を強化することが証明されています (50-52)。 したがって、摂取サイクルを促進すると、これらのニューロンに到達して活性化する US が増加し、CS + US が強化されます。
今回、我々は、特定の条件と時間枠の下で、認識の変化が以前の学習と新しい学習を結びつけ得る、これまで報告されていないメカニズムを明らかにしました。 私たちは、これが一般的な状態設定メカニズムとして機能し、動物が単独では記憶を誘発するには不十分である刺激の新しい組み合わせ間の関連付けを形成できるようにする可能性があると提案します。 人間を含む高等動物では、学習と知覚の変化との関連性が十分に確立されているため、学習→知覚→学習の経路は、学習研究においてさらなる注目に値する広範に保存された特徴である可能性があると考えられます。 LTM の形成がエネルギーコストの増加、特に記憶固定のための分子機構の関与と動員に関連していることを考えると、学習を指示するメカニズムは生存可能性にとって潜在的に重要な価値を持っています。 リムナエアのような採食動物の場合、厳しいエネルギー予算で活動している (53) 、さまざまな関連性を学習することは非常に有益であり、環境内の潜在的な食料源や潜在的な危険を警告しますが、これはエネルギー的要因とバランスを取る必要があります。それらの記憶を統合するコスト。 したがって、このメカニズムにより、新しい関連付けを学習するために必要な閾値を効果的に下げることにより、過去の学習の成功に合わせて将来の学習を調整することができます。
材料と方法
動物の飼育
動物は、銅を含まない水が入った大きな貯水タンクにグループで入れられ、20 度で 12- 時間明/12- 時間暗の体制で飼育されました。 動物には週に 3 回レタスを与え、植物ベースの魚の餌 (Tetra-Phyll; TETRA Werke、ドイツ、メレ) を週に 2 回与えました。 動物をより小さな貯蔵タンクに移し、実験前２日間絶食させた。 すべての実験では、成体（生後 3 ～ 4 か月）のカタツムリ (Lymnaea stagnalis) を使用しました。 Lymnaea は、1986 年動物法 (科学的手順) (英国) に該当しない下等無脊椎動物 (軟体動物) です。 したがって、これらの実験には倫理的な承認や指導は必要ありませんでした。
単回試行の食欲トレーニングおよびテスト手順
単一試行の強力な食欲条件付けは、CS として AA (0.004%) とスクロース ({{10}}.33%) を組み合わせることで実施されました。 ）以前によく説明された方法（23、24）を使用して米国と同様に。 弱い単試行の食欲条件付けは、CS として GNL (0.004%) と US としてスクロース (0.11%) または L-セリン (0.11%) を組み合わせることによって実行されました。 カウンターバランス対照実験では、CS として GNL と US としてスクロース (0.33%) を組み合わせて強いコンディショニングを実行し、CS として AA と US としてスクロース (0.11%) を組み合わせて弱いコンディショニングを実行しました。 簡単に説明すると、トレーニング手順を開始する前に、動物を個別に 90 ml の銅を含まない水が入ったペトリ皿に 10 分間入れて、新しい環境に順応させました。 5 ミリリットルの CS を水に加え、30 秒後に 5 ml の US を適用しました。 動物をCSとUSを含む溶液中に2分間放置し、その後銅を含まない水ですすぎ、ホームタンクに戻しました。 馴化から 1 日後に CS 反応をテストするために、訓練を受けたグループとナイーブなグループの動物をホームタンクから 90 ml の銅を含まない水で満たされたペトリ皿に移し、10 分間馴化させました。
次いで、５ミリリットルの水を皿に加え、次の２分間の摂食反応（噛みつき）の数を数えた。 次に、5 ml の CS をディッシュに加え、その後 2 分間の摂食反応の数を数えました。 次に、CS 反応を「差分スコア」(Δ咬合数) を使用して評価しました。 これは、CS 適用後 2 分間の給餌サイクル数から、水適用後 2 分間に観察された給餌サイクル数を差し引くことによって得られました。 二重条件付け実験中、結果に記載されているように、動物は時間間隔を隔てて強い食欲的条件付けと弱い食欲的条件付けの両方を受けました。 激しいトレーニング中に使用される米国への事前曝露（0.33％スクロース）が弱いトレーニング学習を強化するかどうかをテストするために、CS（AA）の提示がない場合に、上記のように激しいトレーニングを実行しました。 動物は、4 時間後に GNL とスクロース (0.11%) の弱い訓練を受け、1 日後に GNL に対する反応を検査されました。
弱いトレーニング中の知覚の測定
弱いトレーニングに対する動物の認識に対する過去の学習の影響は、上記と同様にバイタルトレーニングを行い、その後4時間後に弱いトレーニングを行うことによってテストされました。 弱い CS + US プレゼンテーション中に、動物の摂食反応を下からビデオ撮影しました (33 フレーム/秒)。 歯舌およびその下にある象牙質構造の移動方向は、(16) と同様に、最初の 15 回の摂食反応中に測定されました。 簡単に言うと、ImageJ ソフトウェアを使用して、各咬合中に歯口が見える最初のフレームに先行するフレームで、下顎背側の位置を最初にマークしました。 次に、咬合全体にわたって歯舌を追跡し、下顎背側の最初の位置からの距離を計算しました。 次に、フレーム間で移動した平均差が測定されました。 したがって、負のスコアは、咬合の開始時に歯舌と下顎骨背側が離れており、咬合中に歯舌が下顎背側に向かって移動することを表し、一方、正のスコアは、咬合の開始時に下顎骨と下顎骨が接近していることを表します。そして咬合が進むにつれて歯舌は遠ざかっていきます。 反応が摂取であるか排出であるかを定義する基準は、動きの違いが負（摂取）であるか正（排出）であるかに基づいていました。 事前のバイタルトレーニングが弱いトレーニングで使用されるCS + USの知覚の安定性をどのように変化させるかを測定するために、連続する咬合のペアを分析しました。 安定した咬傷のペアは、同じ連続する 2 つの咬傷 (摂取-摂取または摂取-摂取) として分類されました。 スイッチングバイトペアは、2 つの異なる連続バイト (インジェスト、エジェスト、またはエジェスト-インジェスト) として分類されました。
次に、バイトペアの総数の一部として表されるスイッチングバイトの数をカウントすることによって、移行確率を計算しました。 激しいトレーニング中に使用される米国（{{0}}.33％スクロース）への事前曝露が弱いトレーニングの認識を変えるかどうかをテストするために、CSの提示がない状態で上記のような激しいトレーニングを実行しました。 (AA) 上記と同様に摂取/排出行動を測定しました。 事前の弱いトレーニングがその後の弱いトレーニングの認識を変えるかどうかをテストするために、まず動物に 0.11% スクロースと組み合わせた AA を投与し、次に GNL および 0.11% スクロースに対する摂取/排出反応を調べました。 4時間後に測定。 弱いトレーニング中に使用されるCSまたはUSのいずれかに対する動物の反応性に対する強いトレーニングの影響をテストするために、動物は上記のような激しいトレーニングを受けました。 4時間後、動物を90mlの銅を含まない水の入ったペトリ皿に入れ、10分間順応させた。 次に、彼らに 5 ml の水を与え、摂食反応をカウントしました。 その後、彼らに 5 ml の GNL または 0.11% スクロースのいずれかを与え、摂食反応をカウントして、Δ咬合数を上記のように計算できるようにしました。
準備と電気生理学的方法
(16) で以前に説明した手順に従って、単離された CNS 調製物を使用して in vitro 実験を実行しました。 前食道の小さな領域は、背側頬神経によってCNSに付着したままでした。 調製物を、50 mM NaCl、1.6 mM KCl、2 mM MgCl2、3.5 mM CaCl2、および 10 mM Hepes 緩衝液を含む生理食塩水で灌流しました。 単シナプス接続は、調製物を高二価（HiDi）生理食塩水に浸すことによってテストされました。これにより、活動電位閾値が増加し、多シナプス接続が減少します。 HiDi 生理食塩水は、35.0 mM NaCl、2 mM KCl、8.0 mM MgCl2、14.0 mM CaCl2、および 10 mM Hepes 緩衝液の水溶液で構成されていました。 細胞内記録は、3 M KAc および 0.5 mM KCl を充填した鋭利な電極 (10 ～ 40 メグオーム) を使用して行われました。 NL 102 (Digitimer Ltd.) および Axoclamp 2B (Axon Instrument、Molecular Device) アンプを使用してシグナルを収集し、micro 1401 Mk II インターフェイスを使用してデータを取得し、Spike2 ソフトウェア (Cambridge Electronic Design、ケンブリッジ、英国) を使用して分析しました。
ニューロンの識別
相切り替え運動ニューロン B11 は頬神経節に位置し、その位置、スパイクの形状、PRN からのシナプス入力、摂取および排出サイクル中に活動パターンを切り替える能力に基づいて同定されました (16)。 摂取コマンド様介在ニューロン CV1a は大脳神経節に位置し、その電気的特性、特徴的な位置、および人工的に脱分極させてスパイクを発射したときに架空の摂食サイクルを駆動する能力によって同定されました (31)。 排出指令様介在ニューロン PRN は頬神経節に位置しており、その位置と B11 への単シナプス興奮性結合によって同定されました。 N2v ニューロンは、頬神経節の腹側表面に位置する中枢パターン生成介在ニューロンです。 これは、周期の収縮期における特徴的なプラトーによって識別でき、人工的な活性化により、多くの頬側ニューロンに広範な収縮期の活動が引き起こされます(25)。 B9 は、頬神経節に位置する収縮期の運動ニューロンです。 CGC は大脳神経節に位置する大きなセロトニン作動性介在ニューロンであり、そのサイズ、位置、および強直性スパイク活動によって識別できます (30)。 これまで特徴づけられていなかった排出ネットワークのメンバー候補を同定するために、脳頬結合部 (CBC) を蛍光色素 5(6)-カルボキシフルオレセイン (5-CF) で埋め戻しました。 投射介在ニューロンは、Lymnaea のパターン化された活動の駆動に影響を与えることが知られており (30、31)、排出駆動ニューロンは頬神経節で同定されています (16)。 CBC を埋め戻すと、頬側投射介在ニューロンの集団が明らかになり、他の標本で再同定して電気生理学的に検査することができました。 対象のニューロンを突き刺し、摂取および排出コマンド様ニューロンとともに記録しました。
インビトロサイクルの分析と分類
Ｎ２ｖプラトーまたは退縮期介在ニューロンＢ９上の大きな興奮によって決定されるように、退縮期の開始に関してＢ１１に対する活性を測定した。 サイクルにおける B11 の相対活性を分析するために、収縮期開始の 4 秒前と 4 秒後に測定しました。 退縮期開始後の B11 スパイクの数を、退縮期開始前の B11 スパイクの数から減算し、8- 秒期間内のスパイクの総数で割って、正規化された差分スコアを取得しました。 このスコアを使用すると、正の値は収縮期の開始前に発生するより多くの活動を表すため、排泄サイクルとして分類されます。 負のスコアは、収縮期の開始後により多くの活動が発生していることを表すため、摂取サイクルとして分類されます。 in vitro での架空の摂食サイクルに対する強力なトレーニングの効果を比較するために、最初の 10 回の自発サイクルを 19 個のナイーブ サンプルと 19 個のトレーニング済みサンプルから分析しました。 トレーニングがサイクル発現の安定性をどのように変化させるかを測定するために、連続するサイクルのペアを分析しました。 安定したサイクルのペアは、同じ連続する 2 つのサイクル (摂取-摂取または摂取-摂取) として分類されました。
スイッチング サイクルのペアは、2 つの異なる連続サイクル (インジェスト-エジェストまたはエジェスト インジェスト) として分類されました。 次に、サイクル ペアの総数の一部として表されるスイッチング サイクルの数をカウントすることにより、遷移確率が計算されました。 バイタルトレーニングが食欲の合図に対する準備の反応性を変えるかどうかをテストするために、我々は、バイタルの架空摂食を促進することができる主要な化学感覚経路であるMLN (28)を刺激した(29)。 MLNは、ガラス吸引電極を使用し、0.5-ms持続時間、1Hzで120秒間、4Vの二相パルスで刺激されました。 Δ仮想摂食サイクル数は、B9 などの摂食運動ニューロンの活動を記録し、MLN 刺激に先立つ 120- 秒間に発生したサイクル数を数え、これを刺激に応答したサイクル数から引くことによって計算されました。 MLN刺激。 CGC 活性は、MLN 刺激前の 120 秒間と刺激中の 120 秒間測定されました。 インビトロで感覚主導の排泄を誘発するために、1- の触覚刺激が食道に適用されました。これにより、食道内に詰まった食べられない物体による腸の過度の伸長に反応して、摂食ネットワークに嫌悪感信号を送る機械感覚ニューロンが活性化されます。食道（16）。 触覚刺激は、micro 1401 Mk II (CED) からのトランジスタ - トランジスタ ロジック パルスによって制御される機械的プローブを使用して適用されました。
イオン導入によるニューロンの色素充填
Following procedures previously described in (16), we filled target neurons with a fluorescent dye (5-CF) using a microelectrode. This was achieved iontophoretically using a pulse generator to apply regular interval negative square current pulses into the neuron for >30分。 次いで、調製物を４℃で一晩放置した。 ニューロンの画像は、Leica 実体顕微鏡に取り付けられたデジタル カメラ (Andor Ixon 電子増倍電荷結合素子) を使用して撮影されました。
D2 受容体遮断薬の in vitro および in vivo での応用
スルピリドは、リムネアにおける効果的なドーパミン拮抗薬であり、ドーパミン作動性介在ニューロンのフォロワーニューロンへの影響や、ドーパミンの局所的な適用をブロックします(16、54)。 PRN → PS1 接続に対するスルピリド (±) (Sigma-Aldrich) の効果をテストするために、調製物を最初に HiDi 生理食塩水に浸しました (上記を参照)。 HiDi 生理食塩水中の 10-4 M スルピリドを浴に 10 分間灌流する前に、ベースライン EPSP 振幅を記録し、その後 EPSP 振幅を再度記録しました。 ナイーブ製剤におけるインビトロサイクル生成に対するスルピリドの効果を試験するために、生成された最初の 10 自発サイクルを記録し、次に生理食塩水中の 10-4 M スルピリドを製剤上に灌流しました。 10 分間の灌流後に生成された最初の 10 自発サイクルを分析しました。 弱いトレーニングの知覚および記憶獲得/想起に対するスルピリドの効果を試験するために、生理食塩水中の10-3 Mスルピリド100μlを動物に注射した。 注射された薬物の濃度は動物の体液によって〜10-倍に希釈されることが以前に示されています(55)。 対照動物には、100μlの生理食塩水のみを注射した。 動物は行動試験が行われる前に 2 時間放置されました。
データ分析
データは古生物統計 (PAST バージョン 4.1) (56) を使用して分析され、雨雲プロットとして表現されました (57)。 すべての場合において、個々の点はドットとしてプロットされ、影付きの領域 (雲) は最小値から最大値までの分布の全体的な形状を示します。 内部箱ひげ図には、中央値 (黒線) 四分位範囲 (第 1 四分位数と第 3 四分位数) および平均値 (灰色の線) が表示されます。 各「n」は個々の動物/製剤を表します。 正規性は Shapiro-Wilk 検定を使用して検定されました。 2 グループの統計比較は、両側 t 検定統計 (本文で説明されているように対応または対応のない)、またはノンパラメトリック データのマン-ホイットニー検定またはウィルコクソンの符号付き順位検定を使用して実行されました。 3 つ以上のグループのデータは、最初に一元配置分散分析 (ANOVA) またはクラスカル-ウォリス検定を使用して分析されました。 その後の比較は、ボンフェローニ逐次補正を備えた Tukey または Dunn の事後テストを使用して実行されました。 摂取または排出として分類された咬傷/サイクルの割合と、ゼロまたはゼロを超える摂取サイクルを実行した動物/製剤の数との間の比較は、フィッシャーの直接確率検定を使用して行われました。 有意水準は P < 0.05 に設定されました。
参考文献とメモ
1. F. Mery、TJ Kawecki、ショウジョウバエの長期記憶のコスト。 サイエンス 308、1148 (2005)。
2.P.-Y. Plaçais、T. Preat、食糧不足下で生き残るために、脳は高価な記憶を無効にします。 サイエンス 339、440–442 (2013)。
3. AC Nobre、MG Stokes、事前記憶体験: 積極的な注意を払うための時間スケールの階層。 ニューロン 104、132–146 (2019)。
4. ML Rosen、CE Stern、SW Michalka、KJ Devaney、DC Somers、認知制御ネットワークによる記憶誘導視覚的注意への貢献。 セレブ。 コーテックス 26、2059 ～ 2073 (2016)。
5. MG Stokes、K. Atherton、EZ Patai、AC Nobre、長期記憶は知覚のための神経活動を準備します。 手順 国立 アカド。 科学。 USA 109、E360–E367 (2011)。
6. YL Chew、Y. 谷沢、Y. Cho、B. Zhao、AJ Yu、EL Ardiel、I. Rabinowitch、J. Bai、CH Rankin、H. Lu、I. Beets、WR Schafer、求心性神経ペプチドシステムは、 C.エレガンスの感作と覚醒を引き起こす機械感覚シグナル。 ニューロン 99、1233–1246.e6 (2018)。
7. J. フェルゼンベルグ、PF ジェイコブ、T. ウォーカー、O. バーンシュテット、A.J. エドモンソン＝ステイト、M.W. プレイツィアー、N. オットー、P. シュレーゲル、N. シャリフィ、E. ペリッセ、CS スミス、JS ラウリッツェン、M. コスタ、G. Jefferis、DD Bock、S. Waddell、並行して対立する記憶の統合が記憶の消滅の根底にあります。 セル 175、709–722.e15 (2018)。
8. J. Huang、Z. Zhang、W. Feng、Y. Zhao、A. Aldanondo、MG de Brito Sanchez、M. Paoli、A. Rolland、Z. Li、H. Nie、Y. Lin、S. Zhang 、M. Giurfa、S. Su、食物の欲求は、ミツバチの脳におけるドーパミン作動性シグナル伝達の一時的な活性化によって媒介されます。 サイエンス 376、508–512 (2022)。
9. PF Jacob、S. Waddell、間隔をあけたトレーニングは、ショウジョウバエにおいて反対の価数の相補的な長期記憶を形成します。 ニューロン 106、977–991.e4 (2020)。
10. S. セイン、J.-F. デ・バッカー、KP シジュ、ME ウォズニアック、LP ルイス、L.-M. Frisch、B. Gansen、P. Schlegel、A. Edmondson-Stait、N. Sharifi、CB Fisher、SA Calle-Schuler、JS Lauritzen、DD Bock、M. Costa、GSXE Jefferis、J. Gjorgjieva、IC Grunwald Kadow、A神経回路は、空腹のショウジョウバエの持続と撤退の間を調停します。 ニューロン 104、544–558.e6 (2019)。
11. B. セナパティ、C.-H. ツァオ、Y.-A. フアン、T.-H. チウ、C.-L. Wu、S. Waddell、S. Lin、ショウジョウバエにおける関連記憶の剥奪状態特異的発現の神経機構。 ナット。 神経科学。 22、2029 ～ 2039 年 (2019 年)。
12. K. Steck、SJ Walker、PM Itskov、C. Baltazar、JM Moreira、C. Ribeiro、内部アミノ酸状態は酵母の味覚ニューロンを調節し、ショウジョウバエのタンパク質恒常性をサポートします。 eLife 7、e31625 (2018)
For more information:1950477648nn@gmail.com
