新規ネトリン-1-由来ペプチドはマウスの神経細胞死に対する保護を強化し、脳内出血を軽減しますパート 2
Aug 19, 2024
さらに、ペプチド E1 が FAK および SFK シグナル伝達経路を特異的に活性化することも発見しました。したがって、ペプチド E1 は非常に特異的な効果を持ち、ICH 後の回復プロセスに効果的である可能性があります。
高い特異性と記憶の間には関係があります。高い特異性とは、人々がタスクを実行しているときに脳の特定の領域でより強い活動が行われることを指します。記憶とは、情報を学習し記憶する人々の能力を指します。高い特異性を使ってタスクを実行することを学ぶと、記憶力も向上します。
研究によると、私たちが特定のタスクにおいて専門的なスキルと経験を身につけると、脳は徐々に特殊な神経回路と記憶パターンを構築するようになることがわかっています。これらの回路とパターンはタスクへの応答に特定の影響を及ぼし、それによってタスクの効率が向上します。同時に、将来同様のタスクを実行するときに、これらの回路とパターンもアクティブになり、タスクをよりよく覚えて実行できるようになります。
特異性の高いタスクには、音楽、言語、スポーツなどが含まれ、これらのスキルを学ぶことで記憶力を高めることができます。たとえば、ピアニストが演奏を練習すると、脳はピアノの特定のスキルを学習し、練習プロセス中にこれらの回路を強化し続けます。これらの回路の確立と強化は、ピアニストの音楽の理解と記憶も改善します。
したがって、高い特異性と記憶の間には正の関係があります。特定のスキルや経験を学ぶことで、実行効率が向上するだけでなく、記憶力も強化され、さまざまな情報をよりよく学び、記憶するのに役立ちます。私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。シスタンシュには抗酸化作用、抗炎症作用、および老化防止効果があり、脳内の酸化や炎症反応を軽減し、それによって健康を守ることができるため、記憶力を大幅に向上させることができます。神経系。さらに、Cistanche は神経細胞の成長と修復を促進し、それによって神経ネットワークの接続と機能を強化します。これらの効果は、記憶力、学習能力、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発生を防ぐこともできます。
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ペプチド E1 とは異なり、ペプチド E2 は ERK シグナル伝達を活性化することができ、これによりニューロン死が促進されます。これは、ERK シグナル伝達経路を活性化できる E2 の Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G モチーフによって引き起こされる可能性があります [28]。
これは、異なるネトリン-1-由来のペプチドが異なる機能を実行することを示しています。ネトリン-1の主な受容体は、DCC および UNC5 ファミリーのメンバーです [50]。 ICH における DCC と UNC5H2 の役割は依然として議論の余地がある [51,52]。
私たちが特定した Netrin-1 の配列は、Netrin-1 と DCC の相互作用にとって重要です [19]。これらの結果は、DCC が ICH 後のネトリン-1-誘発の機能回復に関与している可能性があることを示唆しています。
これらのプロセスの根底にあるメカニズムと関連するシグナル伝達経路を調査するには、さらなる研究が必要です。今後の実験では、ペプチド E1 の生物学的特性を評価し、臨床応用に向けてその毒性と半減期を調査する予定です。
4. 材料と方法
4.1.動物
検査室は特定病原体除去 (SPF) 検査室でした。すべてのマウスを、午前6時から午後6時まで点灯する12-時間の明暗サイクル下で飼育し、食物を自由に摂取できるようにした。 DCC+/- マウスは以前に記載されているように生成されました [53]。
DCC+/- マウスの胚を皮質神経細胞培養に使用した。遺伝子型決定は、以前に記載されているようにポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって実行されました [53]。 C57BL/6Jマウスは、Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd.（北京、中国）から購入した。
4.2.構築物
ヒト DCC (HGNC: 2701)、ヒト Netrin-1 (HGNC:8029)、およびヒト UNC5A (HGNC:12567) をコードする発現構築物は、我々の研究室で生成されました [14,32,45]。
pcDNA 3.1-hNetrin-1 (Δ407–443)-myc-His は、Seamless AssemblyCloning Kit (Clone Smarter、C5891、USA) を使用して生成されました。 hNetrin-1 (Δ407-443) の cDNA 配列は補足表 S2 に見られます。
DCC の FN5 ドメインおよびネトリン-1 のアミノ酸 407 ～ 443 に対応する cDNA 配列を、pGEX-5x-1 ベクターへのライゲーションによって構築し、GST 融合タンパク質を生成しました。
4.3.ネトリン-1条件培地のコレクション
ネトリン馴化培地は、以前のレポート [13、14] で説明したように収集され、検証されました。{0}簡単に言うと、Myc-Hisタグ付きヒトネトリン-1がHEK293T細胞で発現されました。
24 時間後、細胞を Opti-MEM (Invitrogen、31985070、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) で 3 回洗浄し、その後、無血清 Opti-MEM 中で 3 日間インキュベートしました。
培地を遠心濾過 (Millipore、UFC903096、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国) によって濃縮し、-80 °C で保存しました。濃縮ネトリン-1を抗Hisで免疫ブロットし、ローディングコントロールとしてのBSAとの比較により定量しました。
次に、ネトリン{{0}}の効果をFAKのリン酸化によって評価しました。通常、0.1 mg/mL の Netrin-1 が FAK リン酸化を効果的に誘導し、この濃度を研究で使用しました。ネトリン-1刺激の継続時間は、特に指定がない限り、すべての実験で 20 分でした。
4.4.ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロッティングは以前に記載されているように実行されました[54]。サンプルを溶解バッファー (1% Nonidet P-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム 0.1% SDS、1 mM EDTA、1 mM EGTA、150 mM NaCl、 10% グリセロール、1% Triton X-100、100 mM NaF、1 mM バナジン酸塩、プロテアーゼ阻害剤) を使用して細胞と新鮮な脳組織を溶解します。
使用した一次抗体は次のとおりです: マウス抗 DCC (1:500、#554223、BD、サンノゼ、カリフォルニア州、米国)、マウス抗 His(1:1000、TA-02、ZSGB-BIO、北京、中国) )、マウス抗 myc (1:1000、22E8、Sungene Biotech、天津、中国)、マウス抗 Netrin-1 (1:1000、ALX804838、Enzo Life Sciences、ファーミングデール、ニューヨーク、米国)、マウスアンチフラッグ (1:1000、F3165、Sigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)、ウサギ抗リン酸 FAK(pTyr861) (1:1000、F9176、Sigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)、ウサギ抗 FAK (1:200、sc-557、サンタクルーズ、サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国)、ウサギ抗リン酸 SRC (Tyr418)(1:1000、Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) 、ウサギ抗 SRC ファミリー (1:1000、#2123、CST、米国マサチューセッツ州ダンバース)、マウス抗 GAPDH (1:5000、TransGene Biotech、北京、中国)、マウス抗ベータ アクチン (1:3000、 A5441、Sigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)、ウサギ抗リン酸 ERK(Thr202/Tyr204) (1:1000、#9101、CST、ダンバース、マサチューセッツ州、米国)、ウサギ抗 ERK (1:1000、# ４６９５、ＣＳＴ、ダンバーズ、マサチューセッツ州、米国）、マウス、ヤギ、またはウサギに対するＨＲＰ結合二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）から購入した。
4.5.細胞表面結合
カバースリップ上に播種した HEK293 細胞を、以前に記載されたリン酸カルシウム法を使用して Flag-DCC プラスミドでトランスフェクトしました [55]。トランスフェクションから約 40 時間後、細胞を 100 µg/mL myc-Netrin-1 または myc-Netrin-1 (Δ407–443) とともに 30 分間インキュベートしました。 １分前にＨＢＨＡ（ＨＢＳＳ中２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、および０．５ｍｇ／ｍＬＢＳＡ）で５分間洗浄し、１×ＰＢＳですすぎ、続いてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。使用した一次抗体は、ウサギ抗 myc (1:200、Abcam、ab9106、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国) およびマウス抗 Flag 抗体 (1:100、Sigma Aldrich、F3165) でした。
使用した二次抗体は、Alexa Fluor 488-結合ロバ抗ウサギ (1:1000; Invitrogen、A21206) および Alexa Fluor 546- 結合ヤギ抗マウス (1:1000; Invitrogen、A10036) 抗体でした。 。核は 40,6-ジアミノ-2-フェニルインドール (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) で染色されました。すべての画像は Zeiss LSM 880 共焦点顕微鏡で取得されました。
4.6. GST プルダウン
ＧＳＴ−ＤＣＣ融合タンパク質を、グルタチオン−セファロース（商標）４Ｂビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国バッキンガムシャー州リトルチャルフォント）を用いて製造者のプロトコールに従って精製した。
示されたプラスミドでトランスフェクトされた HEK293T 細胞からの細胞溶解物約 500 μg を、RIPA 緩衝液中の 2 ～ 5 μg の GST-DCC-FN5 融合タンパク質とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 Glutathi-one-SepharoseTM 4B ビーズを使用して、GST-DCC-FN5 融合タンパク質およびその相互作用タンパク質を捕捉しました。結合したタンパク質は、熱変性によってタンパク質ローディングバッファー中に放出されました。
4.7.一次皮質ニューロン培養
一次皮質ニューロンは、以前に記載されているように培養されました[56]。簡単に説明すると、麻酔をかけた妊娠マウスから胚 (E17) を取り出しました。大脳皮質を分離し、細かく切り刻んだ。
{{0}}.125% トリプシン プラス、0.05% DNase を含む HBSS 中で 37 °C で 20 分間インキュベートした後、細胞を火研磨ガラスのパスツール ピペットで粉砕し、40 μm フィルターで濾過しました。
解離した細胞を 10% FBS を含む DMEM に懸濁し、5% CO2 雰囲気下、37 °C でポリ-D-リジンでコーティングされた皿またはカバーガラス上にプレーティングしました。 4時間後、培地をB27およびGlutaMAXを補充した神経基礎培地と交換した。
4.8. NLT 細胞培養および治療プロトコル
マウス GnRH 発現神経細胞 (NLT) は、私たちの研究室によって維持されました。 NLT細胞は、10％FBS（BiologicalIndustries、キブツベイトヘメック、イスラエル）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Thermo FisherScientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を含むDMEM（Sigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）中で37℃で増殖させました。 95% 空気と 5% CO2 の加湿雰囲気。
ヘミンの神経毒性を調べるために、さまざまな濃度 (0、10、30、60、90、および 120 μM) のヘミン (Sigma-Aldrich) を NLT 細胞に添加し、6 時間処理しました。これらの濃度のうち、60 μM (LD50) が選択され、その後の実験で使用されました。
対照群はビヒクル(DMSO)のみで処理した。細胞生存率および生/死染色を処理の 6 時間後に実行しました。各グループに 3 つのウェルを使用しました。実験は少なくとも 3 回繰り返しました。
4.9.ヘミン誘発細胞死の in vitro モデル
以前に記載されているように、初代皮質ニューロンとNLT細胞では、それぞれ50μMと60μMのヘミンでの処理によって細胞死が誘導されました[57,58]。ヘミンを0.1 M NaOHに溶解してストック溶液を生成しました。神経保護の研究では、指定された薬剤または再蒸留水に溶解した亜セレン酸ナトリウムの存在下で、細胞をヘミンで6時間処理しました。
4.10. CCK-8 アッセイ
細胞生存率は、以前に記載されているように、CCK-8 アッセイ (CK04、同仁堂、熊本、日本) によって測定されました [59]。簡単に説明すると、ニューロンを、100 μL の培地中 6000 細胞/ウェルの密度で 96- ウェル プレートに播種し、インキュベーター内で一晩培養しました。
細胞をヘミンで6時間処理した。神経細胞を各ウェルで予熱した PBS (37 °C) および CCK-8 試薬 (培地 100 μL あたり 10 μL) で洗浄しました。
その後、プレートを 5% CO2 雰囲気下で 2 時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを使用して 450 nm の吸光度を測定しました。細胞生存率は、対照（未処理細胞）のパーセントとして表されました。
4.11。ライブ/デッドステイン
生存率を測定するCCK-8アッセイの能力は、製造者の指示に従って、PBS中のカルセインAM/PIで染色することによって検証した(Live/Dead Assay、KeyGEN BioTECH、南京、中国)。
染色溶液は、PBS に混合された 2 μM カルセイン AM 試薬と 8 μM PI 試薬から構成されていました。サンプルを 30 分間インキュベートし、蛍光顕微鏡 (Olympus FSX100、東京、日本) の 20 倍の対物レンズを使用して画像化しました。ヘミン誘発性細胞死のインビトロモデルには、少なくとも 3 つの独立した細胞培養物を使用しました。
4.12.ペプチドの合成と投与
Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2)、Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2)、Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2)、Tat (NH{{11}) }YGRKKRRQRRR-CONH2)、TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2)、FITC ラベル付き TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2)、FITC ラベル付き Pep EGF3 (NH{{ 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2)、Pep Ctrl(NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2)というラベルの付いたフラグ、Pep E1 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-HPVGA)というラベルの付いたフラグAGKTCNQTTGQ-CONH2) とラベルの付いたフラグ純度99%のPep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) ペプチドは、Shanghai GL Biochem (中国、上海) 社および Wuhan Bioyeargene Biosciences (中国、武漢) 社によって購入されました。
For more information:1950477648nn@gmail.com
