FAIMS による脳組織のトップダウン プロテオミクスの強化パート 3
Aug 27, 2024
すぐに明らかな観察の 1 つは、存在量パーセンタイルが高くなるほど、TDP と同一視される確率が高くなるということです。言い換えれば、TDP は主に非常に豊富なタンパク質を識別します。
年齢を重ねると、多くの人が記憶力の低下を感じます。これは、特に長期的な精神的ストレス、睡眠不足、不均衡な食生活を経験した後によく見られる現象です。
しかし、記憶力を向上させる方法の 1 つは、豊富なタンパク質の摂取量を増やすことであることをご存知ですか?豊富なタンパク質にはアミノ酸が豊富に含まれており、脳内で神経伝達物質と呼ばれる分子を合成し、ニューロンの成長と活動を促進します。ニューロンは脳の最も基本的な単位であり、私たちの学習能力と記憶能力の鍵となります。したがって、豊富なタンパク質はニューロンの機能を強化し、記憶力を向上させることができます。
研究では、タンパク質と記憶の関係も実証されています。たとえば、ある研究では、高タンパク質の食事と比較して、低タンパク質の食事は注意力や記憶力などの脳機能の低下につながることがわかりました。
したがって、記憶力を向上させたい場合は、鶏肉、魚、牛肉、卵、豆腐など、タンパク質が豊富な食品を食事に追加するとよいでしょう。もちろん、バランスにも注意する必要があります。食事の多様性もあり、1 種類の食べ物だけを食べることはできません。
つまり、豊富なタンパク質は記憶力の向上に役立ちます。記憶力を高めたいなら、食事から始めて、できるだけ多くの高たんぱく質の食べ物を食べるようにするとよいでしょう。これは、私たちが記憶力を向上させる必要があることを示しています。シスタンシュには、記憶と学習に非常に重要なアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。さらに、シスタンシュは血流を改善し、酸素の供給を促進することで、脳に十分な栄養とエネルギーを確保し、それによって脳の活力と持久力を向上させることができます。
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トップダウン データセット (FAIMS の有無にかかわらず) から同定された遺伝子の約半分は、ボトムアップ分析の存在量ビンの上位 20% 内に含まれていました (図 6A)。逆に、71 個の遺伝子はトップダウン データ セット (「NA」ビン) でのみ見つかりました (図 6A)。
これらの遺伝子は比較的短いタンパク質を表すようでした (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis.
たとえば、トップダウンのみのビンには、H3C1、H4C1、H1–4、および H2BC12 などのヒストンタンパク質が含まれていました。予想どおり、FAIMS は「FAIMS なし」よりも豊富なパーセンタイルの識別を向上させ、深度が増加することがわかりました。観察可能なプロテオームの。
すべてのパーセンタイルにわたる FAIMS と「FAIMS なし」の比率を決定すると、-40 ～ -50 の範囲の CV 内で 40 パーセンタイル未満の識別のかなりの増加が明らかです (図 6B)。
しかし、遺伝子の絶対数を考慮した場合、FAIMS の利点の主な貢献は、すべての存在量パーセンタイルにわたって同定範囲を広げることによるものです。
FAIMS CVとプロテオフォームの伝達との関係
FAIMSでは、FAIMS CVとプロテオフォーム分子量の間の傾向にも注目しました（図7）。-50 CVでは、プロテオフォーム質量の中央値は〜5 kDaで、-20CVでは〜15 kDaに増加します。
これらの質量分布 (図 7) に基づくと、-50 V 未満の CV はトップダウンまたはミドルダウンのプロテオミクス実験に適しているように見えますが、-50 V を超える CV はペプチドまたはボトムアップの実験に最も有益である可能性があります。
観察された分子量の傾向は、おそらく -20 CV を超えて広がっています。ただし、プロテオフォームと遺伝子の同定の低下に基づいて、検索を -20 CV に制限しました。これにより、実行ごとのプロテオーム配列カバー率の収益が減少しました。
FAIMSを使用した以前の研究では、+40 CVがNIST mAb重鎖（〜51kDa）を送信するための理想的な電圧であることが判明し、対応する軽鎖（〜23 kDa）には-20 CVが最適であることが判明し、この考えを裏付けていることに注意する必要があります。私たちが観察した傾向は、陽性の FAIMS CV にも広がっている45。
興味深いことに、単一のプロテオフォームを識別する多くのスペクトルは 10V 範囲内 (5165 個中 3599 個) で見つかることに限定されていましたが、-50 から -20 までの全 CV 範囲にわたって 7 つのプロテオフォームが観察されました。おそらく、これは、特にユビキチン (UBB)、ミエリン塩基性タンパク質、およびアシルCoA 結合タンパク質の場合、サンプル中にそれらが豊富に存在することに起因すると考えられます。
しかし、これらのプロテオフォームの異なる電荷状態は、プロトンの異性化に応じていくつかの気相構造をとり、それらの移動度に影響を与える可能性もあります42。
これら 7 つのプロテオフォームにより、CV の変調によって電荷状態エンベロープがどのように差次的に伝達されるかを調査することができました。各 CV での荷電状態分布の代用として、各 CV で特定されたプロテオフォーム スペクトル マッチ (PrSM) に基づく荷電状態中央値を使用し、-50 CV から始まる CV の関数としてこの値がどのように変化するかを追跡しました。
図S3のMS1スキャンは、PrSM充電状態の中央値がUBBの充電状態分布をどのように追跡するかを示しています。これら 7 つのプロテオフォームのうち、4 つは逆の関係に従い、観察された電荷状態の中央値は CV が減少するにつれて増加しました (図 8)。
この傾向は一般にペプチドおよび低分子タンパク質で観察されていることに注目する価値があります。 56,62-64 驚くべきことに、3 つのプロテオフォームは、CV の低下により観察される電荷状態の中央値が減少するという逆の関係を示しました (図 8)。
2 つのグループ間の平均前駆体質量をざっと調べると、CV が減少するにつれて、より大きな前駆体がより高い電荷状態を好む可能性が高いことが示唆されます。
これらの関係をさらに検証するために、この分析を拡張して、より控えめではあるが依然として広い 20 ～ 30 CV 範囲内で同定されたプロテオフォーム (n=256 プロテオフォーム) を含めました。ここでは、電荷の中央値が全体で 1 電荷よりも大きくシフトしたプロテオフォームです。 CV 範囲全体が、シフトの方向に応じて 2 つの異なるグループに分類されました。
1 電荷未満シフトしたものは、CV の変更に関して「中立」とみなされました。以前の結果と同様に、より大きな前駆体は、観察された電荷状態と CV の間の逆関係に関連付けられる可能性が大幅に高かった (表 S2)。
CV が減少すると、プロテオフォームの大部分は、より高い電荷状態 (n=39) を好むプロテオフォームと比較して、より低い電荷状態 (n=177) で伝達するように見えました。残り (n=40) は、CV の変化に関して「中立」であると考えられました。
中立グループ内に含まれるプロテオフォームは、逆グループと直接グループの間で平均前駆体質量を示し、プロテオフォームの質量がこの挙動に本質的に関連していることを再度示唆しました。
ただし、塩基性/酸性アミノ酸組成や脂肪族インデックスなどの他の一次配列ベースのパラメーターには有意な相関はありませんでした（表S2）。
気相に導入されるタンパク質は変性していると考えられますが、双極子モーメントや衝突断面積などのネイティブタンパク質に通常関連する要素の方が、この現象に対してより適切な予測値を持つ可能性があります。64-66 私たちの結果は、CV を使用してさまざまなタンパク質をフィルタリングする方法を示しています。質量、およびタンパク質の電荷状態エンベロープが FAIMS を介してどのように差次的に伝達されるかについても説明します。
TDP実験におけるタンパク質フラグメントの有用性
驚くべきことに、我々が同定したプロテオフォームのかなりの数は、より大きなタンパク質の断片でした。同定された固有のプロテオフォームのうち、その由来元となるタンパク質配列の半分以上をカバーしているのはわずか 25% であることがわかりました。
この 25% は 11.4 kDa の平均質量を有し、残りの 75% の平均質量は 5.7 kDa でした。この観察にはいくつかの要因が寄与している可能性がありますが、その一部は FAIMS とは独立しています。
たとえば、これらのフラグメント自体は、細胞の「デグラドーム」の一部として正常な恒常性条件下で生成されたタンパク質分解性切断産物である可能性があり、67、あるいは死後の間隔やサンプルの取り扱い中に導入されたさまざまな予防策にもかかわらず、生成されたものである可能性があります。
中枢神経系組織は、「神経ペプチド」として知られるシグナル伝達ペプチドの豊富な供給源であり、これらは通常、はるかに大きな前駆体タンパク質にも由来します。68
プロテオフォームの同定を確立された神経ペプチドデータベース (NeuroPedia) と相互参照することにより 69、バソスタチン-1、セクレトニューリン、コレシストキニン-58デスノノペプチド、神経ペプチド y および多くの非標準配列変異体を含むいくつかの神経ペプチドを同定することができました。既知の神経ペプチド生成遺伝子に由来します。
生物学的要因を超えて、特定の機器パラメーターもタンパク質断片の観察に影響を与える可能性があります。たとえば、ソース内の低い「断片化」電圧 (10 ～ 20 V) は通常、付加物の除去とタンパク質イオンの脱溶媒和に使用できますが、より高い電圧では、ソース誘導解離を生成します。
ただし、アミド結合の解離に対する感受性は大きく異なる可能性があり、タンパク質のサイズが大きくなるにつれて、Xaa-Pro などの不安定なアミド結合が含まれる可能性も高くなります。このメカニズムでは、電源電圧が低い場合でも、機器内にフラグメントイオンが導入される可能性を減らすために、電源電圧の印加を避けることにしました。
また、タンパク質が FAIMS で生成された電場を通過する際に断片化現象の影響を受けやすい可能性もあります。ただし、これらのフラグメントは親イオンと同じ移動度を持つことは期待できず、これは前駆体イオンに対するフラグメントのサイズにも依存する可能性が高いことに注意してください。
最後に、より小さなプロテオフォームの観察に偏りをもたらす可能性があるいくつかの要因を指摘する価値があります (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74
この信号の広がりは、主に電荷状態エンベロープと各電荷状態の同位体分布に起因する可能性があります。私たちの実験設定に特有なのは、サンプル調製の最終濾過ステップとしてサイズ 3K MWCO フィルターを使用することでした。この場合、これは、より小さいアミロイド ベータ プロテオフォームが存在する場合に効率的に捕捉できることを保証するために選択されました。
一般的な機器要因も、四重極の調整、電気力学的捕捉、オービトラップ セル内の残留ガス分子との衝突など、小さなプロテオフォームに対する偏りを生み出す可能性があり、これにより大きな分子の過渡現象のより速い減衰が引き起こされます。75 これらの偏りや正確な起源とは無関係に、断片の一部であっても、プロテオームについての洞察を得ることができます。
これらのフラグメントは、タンパク質恒常性の破壊が一般的に病理に関連している神経変性疾患の状況において特に有用です。76,77
実際、タウの断片は神経毒性があり、アルツハイマー病などのタウオパチーの進行に関与していることがしばしば判明しています23-26。一般に、私たちが観察する断片はトリプシンペプチドよりもはるかに大きく、特定のタンパク質の断片が多数存在する場合もあります。 、かなりのシーケンス範囲が観察されます。
これは、図 9A、B に示すように、約 50 kDa のチューブリンα-1 B 鎖 (TUBA1B) と約 70 kDa のシナプシン -1 (SYN1) をカバーするフラグメントを調べることで例示されます。複雑なサンプルのTDPでは、全長の形で観察することが難しいタンパク質を観察できます。
神経変性疾患に関連するプロテオフォームの同定
FAIMS とトップダウン分析を併用することで、267 個の固有のスプライス バリアントと 96 個の TrEMBL エントリを含む、いくつかの固有の Swiss-Prot スプライス バリアントと TrEMBL エントリの同定が可能になりました（表 S3）。
特に、神経細胞接着分子 1 (NCAM1) の代替 ORF アイソフォーム (A{{0}}A0D9SF30) を明確に識別する複数の PrSM が観察されています。また、いくつかの神経変性疾患、特にシヌクレインと PARK7 で役割が知られている遺伝子に由来するプロテオフォームも観察しました。
これらのどちらの場合でも、主要なプロテオフォームには全長配列が含まれています。興味深いことに、-シヌクレイン、シヌクレイン、および（程度は低いですが）-シヌクレイン PrSM の大部分には、C 末端付近に約 177 Da の未知の質量シフトが含まれていることがわかりました（図 S4A に示すように、未知の修飾を伴う全長 - シヌクレインスペクトル）。 。
この質量シフトは、オープン データベース検索で以前に観察されており、通常は Asp または Gluresidues で見られます。78 修飾の平均および単同位体質量と厳密に一致する潜在的な説明は、1 つの酸素と 3 つの鉄原子、および 7 つの水素原子の喪失で構成されます ( Unimod アクセッション #1971 に基づいています)。
-シヌクレインからのy242+フラグメントイオンの同位体ピーク（図S4B）と、未知の修飾に属すると考えられる前述の元素を含むシミュレートされたスペクトル（図S4C）との比較は、2つの同位体分布間の類似性を示しています。同位体ピークの多くは互いに 2 ppm 以内に並んでいます。
また、左端の同位体ピークは天然に存在する鉄同位体に特有のものであり、3 つの鉄原子を含まずにスペクトルをシミュレートするとこれらのピークの欠如がすぐに明らかであり (図 S4D)、この未知の修飾が構成されている可能性が非常に高いことを強く示唆していることも指摘しておく必要があります。提案された要素の一部。
以前の研究では、さまざまな金属イオンに対するαシヌクレインの高い親和性も記載されており、この修飾を含むことが観察された領域は、結合に関与することが知られている残基、特に 119DPDNEA124 モチーフと重複しています (図 S5)。
我々のデータはまた、-シヌクレインと-シヌクレインのC末端領域が、同じ未知の質量シフトを持つ複数のスペクトルがこれらのタンパク質内の類似の配列と一致することから、金属結合において同様の役割を果たしているということを示唆している。
ミトコンドリアタンパク質PARK7については、その単一活性部位Cys残基C106上で約116.0 Daの質量シフトが見られた（図S6）。同様のδ塊サクシニル化による潜在的な説明の 1 つは、ミトコンドリアのストレスに起因すると考えられる修飾であり、マイケルによる Cys チオール基へのフマル酸の付加によって形成されます。82
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