ACKR4aはオートファジーを誘導してNF-κBシグナル伝達とアポトーシスをブロックし、ビブリオ・ハーヴェイ感染を促進する
Nov 29, 2023
まとめ
オートファジーとアポトーシスは、細菌の侵入に対する抵抗性のメカニズムとして認識されています。 しかし、細菌も同様に免疫を回避する能力を進化させてきました。 この研究では、非定型ケモカイン受容体ファミリーのメンバーであるACKR4aがNF-κB経路の抑制因子であることを特定し、これがBeclin-1と連携してオートファジーを誘導し、NF-κBシグナル伝達を阻害してアポトーシスをブロックし、ビブリオ・ハーヴェイ感染症。 機構的には、V. harveyi によって誘導される Ap-1 は、ACKR4a の転写と発現を活性化します。 ACKR4aは、それぞれBeclin-1およびMyD88と複合体を形成し、オートファジーを誘導し、MyD88をリソソームに輸送して分解させ、炎症性サイトカインの産生を抑制します。 一方、ACKR4a 誘導オートファジーは、カスパーゼ 8 を阻害することでアポトーシスをブロックします。 この研究は、V. harveyi がオートファジーとアポトーシスの両方を利用して自然免疫を回避していることを初めて証明し、V. harveyi が魚の免疫に対する能力を進化させてきたことを示唆しています。
カンクサ-免疫システムを改善する
導入
免疫系は一般に自然免疫と獲得免疫に分けられ、ほとんどの生物は生存のために主に自然免疫に依存しています。1 自然免疫は生物内で形成される防御機構です。 パターン認識受容体 (PRR) を通じて病原体関連分子パターン (PAMP) を認識し、病原体感染に対して迅速に反応し、宿主を感染から守ります 2,3 重要な PRR として、トール様受容体 (TLR)食作用からサイトカイン産生まで幅広い反応を開始することができ、それによって炎症性免疫反応や自然免疫反応がさらに強化されます。4 ほとんどの場合、TLR は主に MyD88- 依存性経路を通じてシグナルを伝達し、カスケード反応を通じてシグナルを伝達して核内細胞を活性化します。カッパ B 因子 (NF-kB).5 NF-kB は自然免疫の開始における重要な因子の 1 つであり、炎症反応、自然免疫、細胞の分化、増殖、生存の調整に不可欠です。細菌が宿主に感染すると、サイトカインやケモカインなどの自然免疫応答の下流エフェクターが合成され、最終的に細菌の増殖を阻止する炎症反応を引き起こします。 しかし、細菌は宿主との共進化の中で、宿主の防御を回避し破壊するためのさまざまな制御戦略も開発しました。
オートファジーとアポトーシスは、細菌の侵入に対する 2 つの重要な経路であると考えられています。7 オートファジーは、異常なタンパク質をリソソームに輸送して分解する保存的なプロセスであり、細菌の侵入に対する真核生物の自然免疫において重要な役割を果たしています。8,9細菌は哺乳類のオートファジーを利用して免疫を回避します。 通常、細胞はオートファジーを通じて侵入した細胞外細菌や細胞質内に定着した細菌を除去することを目的としています10が、一部の細菌はオートファジーを「ハイジャック」して自己増殖と繁殖を完了することができます11-13。たとえば、Unc-51-様キナーゼ1 (ULK1)、Beclin1、微小管関連タンパク質軽鎖 3 (LC3)、およびオートファジー関連タンパク質 (ATG) が協力してオートファゴソームを形成し、侵入した微生物をカプセル化し、それらを分解のためにリソソームに輸送します 14-16。 -ベクリン-1を制御してオートファゴソームの形成を防ぎ、最終的にオートファジーを阻害して感染を促進します17。オートファゴソーム形成の阻害とは対照的に、一部の細菌はオートファゴソームを使用して自己複製サイトを完成させて増殖を促進します。11,18オートファジー、アポトーシスは、侵入する病原体に対する宿主防御の手段でもあります。7 アポトーシスは、全身環境の安定性を維持するために損傷した細胞を除去するために使用される細胞死パターンです。19 細菌の侵入の信号を受け取ると、宿主は感染した細胞のアポトーシスを誘導します。したがって、細菌の定着が成功するかどうかは、アポトーシスを防止し、細菌の複製を保護する能力にかかっています。 例えば、Edwardsiella tarda はゼブラフィッシュ ZF4 細胞の感染後にアポトーシスを阻害することで生存を確保し 21、赤ん菌はアポトーシスを阻害することで定着に成功し 22、A 群連鎖球菌 (GAS) によって産生される S タンパク質は赤血球膜に結合して宿主免疫細胞の検出を回避します。多くの細菌が免疫を回避する能力を進化させたことが証明されていますが、海洋病原体に関する報告はいくつかあります。 Vibrio harveyi は Vibrionaceae 科に属し、海水魚の高病原性物質として認識されています。 それは胃腸炎、筋壊死、皮膚潰瘍を引き起こし、海水魚の死亡の主な原因の 1 つです。24
カンサス植物の免疫システムを高める
オートファジーとアポトーシスを除き、一部の細菌 (黄色ブドウ球菌など) は宿主のケモカイン受容体を利用して免疫を回避することさえできます25。 ケモカイン受容体は、主に白血球の表面に見られる G タンパク質共役受容体 (GPCR) です。 ケモカインには 7 つの膜貫通構造が含まれており、これらはリガンドの結合とシグナル伝達に関与し、免疫および炎症反応の開始と維持に重要な役割を果たしています 26。ケモカインの研究が進むにつれて、非定型ケモカイン受容体 (ACKR) が発見されました。27他のケモカイン受容体と構造的に類似しており、リガンドを内部に取り込むことができますが、「サイレント受容体」とも呼ばれる DRYLAIV ドメインが欠如しているため、シグナル伝達経路を活性化できません 28。ACKR の機能は次のように反映される可能性があります。 1. それらは典型的な受容体と競合してケモカインに結合し、それによって細胞走化性のシグナル伝達を調節することができます。 2. ケモカインを細胞内に取り込むことにより、環境中のケモカインの濃度が低下し、細胞の動員に影響を与え、ケモカインスカベンジャーとして作用します。 3. これらは、ケモカインが間質細胞関門を通過して細胞間輸送を完了するのを助けます。29 主に DARC、30 D6 31、32、CXCR7、33、および CCRL1、34 を含む ACKR ファミリーは、非定型ケモカイン受容体としても知られています。 4 (ACKR4)。 現在、いくつかの研究では、ACKR4 が G タンパク質非依存性経路を介してシグナル伝達を実現しているようであり 35-37、炎症や免疫応答の制御において重複しない役割を果たしていることが示されています 38。 適応免疫におけるその役割はよく知られていますが、自然免疫における機能はほとんど研究されていません。
自然免疫では、TLR 経路のシグナル伝達は無脊椎動物から哺乳動物まで高度に保存されています。 MyD88 は、TLR シグナル伝達のコアタンパク質として、脊椎動物で広く研究されています。 さらに、MyD88 の構造は高度に保存されているため、魚類のそのホモログは哺乳類のホモログと同様の機能を持っている可能性があります。 39,40 ゼブラフィッシュでは、MyD88 は細菌感染の除去に関与しています。 41 以前の研究でも、V. harveyi は、MyD88 のシグナル伝達を破壊することで免疫を回避します。42 しかし、V. harveyi がどのようにして免疫を回避するかというメカニズムは、硬骨魚類では依然として十分に理解されていません。 この研究では、V. harveyi で刺激された Miichthys muy において、ACKR4a が急速に上方制御されました。 上方制御されたACKR4aは、オートファジーを誘導してMyD88-媒介NF-κB経路を遮断することと、オートファジーを誘導してアポトーシスを遮断してV. harveyi感染を増強することにより、自然免疫を抑制した。 私たちの知る限り、この報告書は、V. harveyi がオートファジーとアポトーシスの両方を利用して自然免疫を回避することが判明したことを明らかにした最初の報告書です。
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結果
V. harveyi 感染は ACKR4a 発現を誘導して自己増殖を促進します
V. harveyi 感染の制御に潜在的に関与している遺伝子を同定するために、miiuy croaker を V. harveyi で 48 時間処理し、その後 RNA-seq 分析を使用して V. harveyi 処理と未処理の間で異なる発現遺伝子 (DEG) をスクリーニングしました。脾臓のサンプル。 ディープシークエンシングデータから、145 個の上方制御された遺伝子と 28 個の0 の下方制御された遺伝子を同定しました (図 1A)。 これに基づいて、クラスター化ヒートマップ用に最大 10 個と最小 10 個の DEG (倍数変化の log2 は 1.0) を選択しました。その結果、V. harveyi 処理サンプルと未処理サンプルの両方のそれぞれのサンプルがよく複製されたことが示されました (図 1B)。 。 ACKR4a mRNA を調べたところ、V. harveyi 感染後の M 音楽脳で高度に発現していることがわかりました (図 S1A)。 そこで、M. muiiy 脳細胞株 (MBrC) をその後の実験に使用しました。 MBrC における ACKR4a-si1 のノックダウン効率は 46.1%、ACKR4a-si2 は 63.7% (図 S1B) であるため、ACKR4a-si2 (ACKR4a-si と命名) を以降の実験に使用しました。 次に、免疫機能を持つ可能性がある遺伝子ACKR4aに注目し、コロニー形成単位（CFU）アッセイの結果、ACKR4aがV. harveyiの増殖を促進することが明らかになりました（図1C、1D、S1C）。 ACKR4a が V. harveyi の増殖を促進するメカニズムをさらに調査するために、ACKR4a の発現パターンを分析しました。 MBrC 細胞の ACKR4a は V. harveyi によって制御されていました。 結果は、mRNA レベルとタンパク質レベルの両方で V. harveyi 感染の時間依存性を示しました (図 1E および 1F)。 さらに、ACKR4a サイレンシングは、mRNA レベルとタンパク質レベルの両方で ACKR4a の発現を効果的に抑制しました (図 1E および 1G)。 上記の結果は、ACKR4a の上方制御が V. harveyi 感染を促進する可能性があることを示しました。
図 1. V. harveyi によって誘導される ACKR4a は自己増殖を促進する
ACKR4a は V. harveyi によって引き起こされる NF-κB シグナル伝達を阻害します
我々は、MBrC が V. harveyi に感染すると細胞増殖速度が影響を受けることを発見し、この発見を検証するために細胞増殖アッセイを実施しました。 結果は、V. harveyi 感染が MBrC の増殖を確かに減少させることを示しました (図 S1D)。 その後の実験により、ACKR4a の過剰発現により細胞増殖が減少するのに対し、ACKR4a サイレンシングにより細胞増殖が増強されることが確認されました (図 2A および S1E)。 いくつかの研究により、NF-κB の活性化が細胞増殖を促進することが実証されています。 NF-κB の阻害剤である BAY 11-7082 も MBrC の増殖を減少させることができることがわかりました (図 2A および S1E)。 以前の報告と同様に、NF-kB-luc の増加は、時間依存的に V. harveyi 感染と関連していました (図 S1F)。
図 2.ACKR4a は V. harveyi によって引き起こされる NF-κB シグナル伝達を阻害する
V. harveyi によって引き起こされる NF-κB シグナル伝達に対する ACKR4a の効果をさらに調べるために、ルシフェラーゼ レポーター アッセイを実施しました。 ACKR4a は、V. harveyi および LPS によって誘発される NF-κB ルシフェラーゼ活性を有意に阻害しました。 V. harveyi によって引き起こされる IL-1b および TNFa ルシフェラーゼ活性も、ACKR4a によって阻害されました (図 2B ～ 2D)。 自然免疫におけるその役割を検証するために、内因性ACKR4aをサイレンシングした。 次に、p65 および炎症誘発性サイトカイン (IL-1b および TNFa) の発現パターンがさらに検出され、ACKR4a サイレンシングにより p65 mRNA、IL-1b mRNA、および TNFa mRNA が大幅に増加しました (図 2E–2G)。 ）。 MLCおよびMKCの結果は、ACKR4aがNF-kBシグナル伝達を阻害できることも示しました（図S1G〜S1J）。 ELISA の結果も同様でした。 ACKR4a サイレンシングは TNFa を有意に増加させ、ACKR4a 過剰発現は TNFa を阻害しました (図 2H)。 NF-kB の活性化を評価するには、音訳された形、つまりリン酸化された NF-kB を分析することがさらに必要であり、これは標的遺伝子に対する NF-kB 活性の尺度になります。 NF-κB が刺激されると、p65 がリン酸化され、核に入り、炎症誘発性サイトカインの転写を調節します。 ACKR4aによるp65リン酸化の制御を調べるために、ACKR4aサイレンシングおよびACKR4a過剰発現後のp65のリン酸化レベルを免疫ブロットによって測定した。 V. harveyi 感染により p65 リン酸化が増強され、V. harveyi が NF-κB を効果的に活性化することが証明されました。 これに基づいて、ACKR4aサイレンシングはp65リン酸化を増強したが、ACKR4a過剰発現はp65リン酸化を減少させ、ACKR4aがNF-κBシグナル伝達の阻害剤であることを示した(図2Iおよび2J)。 ゼブラフィッシュでは、ACKR4a のノックダウンにより p65 のリン酸化が増加しました。 さらに、CFU アッセイでは、BAY 11-7082 が MBrC の増殖を有意に増加させることが示されました (図 2K)。 全体として、これらのデータは、ACKR4aがNF-κBシグナル伝達の負の調節因子として機能し、V. harveyi感染中に自然免疫を阻害することを示唆している。
図 3.ACKR4a は MyD88 と相互作用し、オートファジーにおける MyD88 分解のプロモーターと相互作用する
ACKR4a は MyD88 と相互作用し、MyD88 のオートファジー分解を促進します。
次に、NF-kB シグナル伝達のどの標的が ACKR4a0 の抑制機能を媒介するかを決定しようとしました。 NF-κB ルシフェラーゼ レポーター アッセイにより、ACKR4a の過剰発現がルシフェラーゼ活性の低下を引き起こし、これが MyD88 によって用量依存的に誘導されることが明らかになりました (図 3A)。 しかし、ACKR4aの過剰発現は、TRAF6またはTAK1によって駆動されるルシフェラーゼ活性には影響を示さなかった(図3Bおよび3C)。 イムノブロットの結果はルシフェラーゼ レポーター アッセイと同様でした。 ACKR4a の過剰発現は MyD88 を用量依存的に阻害しましたが、TRAF6 および TAK1 には影響がありませんでした (図 3D)。 これらの結果は、ACKR4a が MyD88 レベルで機能していることを示唆しています。
TLR3 を除くすべての哺乳類の TLR は、少なくとも部分的に MyD88 アダプターに依存してシグナルを伝達します。これにより、MyD88 の直接制御がより効果的になります 44。次に、V. harveyi 感染のさまざまな時点で MyD88 の発現を調べ、ACKR4a のサイレンシングを発見しました。はMyD88の発現を増強し(図3E)、ACKR4a過剰発現は時間依存的にMyD88発現を阻害した(図3F)。 興味深い結果は、ACKR4aサイレンシングはV. harveyiによって引き起こされるMyD88発現を増強するが、この増強は細胞が休止しているときには存在しないということが判明した(図3Gおよび3H)。 MyD88-媒介NF-κBシグナル伝達におけるACKR4aの作用の根底にある分子機構をより深く理解するために、我々は免疫共沈降（Co-IP）アッセイを実施し、ACKR4aがMyD88と相互作用するかどうかを判定した。 Flag-ACKR4aはMyc-MyD88と免疫沈降することができた(図3IおよびS1K)。 それと一致して、Flag-MyD88 が内因性 ACKR4a と相互作用できることがわかりました (図 3J)。 その後の細胞内局在実験では、ACKR4a が MyD88 と有意な共局在を持たないことが示されました (図 S1L)。 したがって、これらの発見は、ACKR4a が MyD88 と物理的に相互作用し、それらの相互作用は細胞質内で起こる可能性が高いという概念を裏付けています。 次に、ACKR4a が MyD88 の発現を抑制するメカニズムを調べました。 オートファジー-リソソーム依存性分解経路の阻害剤であるNH4Clまたは3-メチルアデニン(3-MA)のいずれかは、ACKR4aの存在下でMyD88の有意な蓄積を引き起こし、MG132はMyD88の分解に影響を与えなかった。 MyD88 (図 3K)。 さらに、同様の結果は、3-MA および NH4Cl が用量依存的に MyD88 分解を有意にブロックすることを示しました (図 3L および 3M)。 これらの発見は、オートファジーをブロックすると、ACKR4a を標的とする MyD88 分解が効果的に防止されることを示唆しているようです。 オートファジーフラックスはオートファジーの動的なプロセスを示し、オートファジー活性の信頼できる指標です。 GFP 蛍光はリソソーム内で消光されるため、オートファジーの段階は GFP と RFP の蛍光から決定できます。42 Merge パネルでの黄色蛍光の観察では、ACKR4a の存在下でより多くの赤色蛍光が示され、ACKR4a が GFP と RFP の融合を促進したことを示しています。オートファゴソームとリソソーム。 一方、オートファジー阻害剤クロロキン (CQ) はオートファゴソームとリソソームの融合を妨げ、より多くの黄色の蛍光を示しました (図 3N)。 ACKR4a がオートファジー分解の MyD88 を標的とすることをさらに検証するために、リソソーム局在アッセイを行ったところ、MyD88 (緑色) とリソソーム (赤色) が MBrC 細胞内で共局在し (図 3O)、MyD88 がリソソームに輸送されたことが示唆されました。 総合すると、これらの結果は、ACKR4a が MyD88 と相互作用し、MyD88 を標的にしてオートファジー分解を行うことを示唆しています。
図4.ACKR4aはBeclin-1を介してオートファジーの制御に関与する
ACKR4aはベクリンを介してオートファジーの制御に関与しています-1
一部の細菌はオートファジーを利用して増殖と感染を促進しますが、オートファジーが存在しない場合、その複製は減少します。13 V. harveyi が MBrC 細胞におけるオートファジーの制御に関与しているかどうかをテストするために、細胞を V. harveyi に感染させ、発現パターンを調べました。 LC3の試験を行った。 MBrC 細胞では、V. harveyi への曝露により、GFP-LC3 涙点の蓄積によって示されるように、オートファジーが増加しました。これは、V. harveyi 感染の時間依存的な増加を伴いました (図 4A)。 ACKR4a サイレンシングが V. harveyi 誘導性オートファジーを有意に減少させるのとは対照的に、RFP-LC3 の涙点蓄積の顕著な増加によって示されるように、ACKR4a 過剰発現は V. harveyi 誘導性オートファジーを増強しました (図 4B および 4C)。 さらに、ACKR4a サイレンシングにより、V. harveyi 誘導性の LC3- II 発現が減少しました (図 4D)。
ULK1、Beclin-1、ATG5 はオートファジーの重要な調節タンパク質でした。 qPCR の結果は、ACKR4a が Beclin-1 の発現を有意に増強するが、ULK1 と ATG5 の発現は増強しないことを示しました (図 4E)。 ULK1、ATG5、および Beclin-1 のルシフェラーゼ レポーター アッセイにより、ACKR4a の過剰発現のみが Beclin-1 ルシフェラーゼ活性の増加を引き起こすことが明らかになりました (図 4F)。 次に、ACKR4a の過剰発現により Beclin-1 の発現が増強されるが、ULK1 と ATG5 の発現は増強されないことが検出されました (図 4G)。 また、ACKR4a 誘導性のオートファジーは Beclin-1-si によって阻害されましたが、ATG5-si では部分的にしか阻害されませんでした (図 4H)。 上記の結果は、ACKR4a が Beclin-1 を標的としていることを示しました。 したがって、ACKR4a を介した MyD88 のオートファジー分解における Beclin-1 の機能と機構を調べた。 V. harveyiに感染したゼブラフィッシュでは、ACKR4aのノックダウンはULK1に大きな変化をもたらさなかったが、Beclin-1とATG5は大幅に減少した（図S2B〜S2D）。 Beclin-1 は、Baf1A および CQ 処理により ACKR4a 誘発オートファジー流動をさらに強化し (図 4I)、Beclin-1 は ACKR4a による MyD88 の分解を強化しました (図 4J)。 次に、ACKR4aがBeclin-1と相互作用するかどうかを決定するためにCo-IPアッセイを実施したところ、ACKR4aがBeclin-1と相互作用し、V. harveyiの感染によりACKR4aとBeclinの相互作用が強化されることが判明しました{{51 }} (図 4K)。 リソソーム局在アッセイにより、ACKR4a がオートファゴソームとリソソームの融合を強化することが示されました (図 4L)。 続いて、ACKR4a は内因性 Beclin-1 発現を増加させ (図 4M)、ACKR4a サイレンシングは V. harveyi 誘導性 Beclin-1 発現を減弱させます (図 4N)。 さらに、Beclin-1 サイレンシングは、V. harveyi によって引き起こされる p65 のリン酸化を強化しました。このことは、V. harveyi がオートファジーを誘導して NF-κB シグナル伝達を負に制御していることをさらに示唆しています (図 4O)。 次に、我々は、V. harveyi感染における、特にV. harveyi増殖の制御におけるベクリン-1の生物学的重要性を決定しようとした。 CFU アッセイを実施したところ、Beclin-1 サイレンシングと CQ ブロック オートファジーの両方が V. harveyi の増殖を減少させることがわかり、V. harveyi がオートファジーを利用して増殖を促進していることが証明されました (図 4P)。 上記の結果を総合すると、ACKR4a が Beclin-1 を誘導して複合体を形成してオートファジーを促進し、V. harveyi 感染を促進することが明らかになります。
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ACKR4aはオートファジーを誘導してアポトーシスをブロックした
オートファジー細胞死はアポトーシスに代わる合理的な手段であると考えられており、アポトーシスは抗菌機構としても認識されています。 細菌感染が成功すると、アポトーシスを阻害することで自己複製が完了します。 22 V. harveyi 誘発オートファジーとアポトーシスの関係を調べるために、V. harveyi 感染前後のさまざまな処理による MBrC 細胞のアポトーシスが測定され、ACKR4a サイレンシングにより V. harveyi が増加しました。 harveyi 誘発アポトーシス (図 5A および 5B、左パネル)。 カスパーゼ 3 とカスパーゼ 7 はアポトーシスの開始に重要であるため、アポトーシスの信頼できる指標として広く受け入れられています。 カスパーゼGlo 3/7アッセイは、ACKR4aの過剰発現がV. harveyi誘導性のカスパーゼ3/7活性を阻害する一方、ACKR4aのサイレンシングがV. harveyi誘導性のカスパーゼ3/7活性を増強することを示した(図5B、右パネル)。 V. harveyi および外因的に添加された組換え活性カスパーゼ 8 によって誘導されるカスパーゼ 3/7 活性は、ACKR4a によって阻害され (図 5C)、ACKR4a がアポトーシスシグナル伝達を効率的にブロックできることが示唆されました。 ACKR4a 誘導性のオートファジーは実証されていますが、アポトーシスの阻止におけるオートファジーの役割を調査するにはさらなる研究が必要です。 図 5D に示すように、ACKR4a サイレンシングにより、エフェクター カスパーゼ (カスパーゼ 7) とイニシエーター カスパーゼ (カスパーゼ 8) が大幅に増加しました。 さらに、ACKR4aの過剰発現はカスパーゼ7およびカスパーゼ8のmRNAを阻害し（図5E）、ACKR4aのノックダウンはゼブラフィッシュのカスパーゼ7およびカスパーゼ8を有意に増加させた（図S2EおよびS2F）。 以前の研究では、ベクリン-1がアポトーシスとオートファジーのプロセスを媒介する分子スイッチであることが示されているため、アポトーシスの制御におけるベクリン-1の関与が調査されました。 我々の研究では、Beclin-1の過剰発現はV. harveyi誘導性カスパーゼ8を下方制御する一方、Beclin-1サイレンシングはV. harveyi誘導性カスパーゼ8を上方制御した（図5F）。 V. harveyi 感染 3 時間でカスパーゼ 8 が有意に上方制御されるという興味深い結果が見つかりました。 感染期間が長くなるにつれて再び阻害され、LC3- II はカスパーゼ 8 と負の相関を示しました (図 5G)。 上記の結果によると、ACKR4a はオートファジーを誘導してアポトーシスシグナル伝達を遮断し、V. harveyi 感染を促進し、Beclin-1 はオートファジーとアポトーシスのカスケードにおける潜在的な標的である可能性があります。
図 5.ACKR4a はオートファジーを誘導してアポトーシスをブロックします
Ap-1 は V. harveyi 感染時の ACKR4a 誘発オートファジーを増強します
続いて、V. harveyi 感染によって誘導される ACKR4a 発現のメカニズムが調査されました。 まず、プロモーター予測配列に従って、4 つの異なる ACKR4a プロモーター プラスミドを構築しました (図 6A)。 ルシフェラーゼアッセイでは、ACKR4a-p-3 活性が最も高いことが示されました (図 6B)。 V. harveyi感染時のACKR4a発現の上流活性化因子を同定するために、ACKR4aのプロモーター領域を分析したところ、ACKR4aにはSp-1およびAp-1の潜在的な結合部位があることが判明した（図6C）。 ACKR4a-luc アッセイでは、Sp-1 はルシフェラーゼ活性を増強できず、Ap-1 はルシフェラーゼ活性を増強したことが示されました (図 6D および 6E)。これにより、ACKR4a が Ap の直接の標的である可能性が高まりました。 -1。 これを調べるために、変異体 ACKR4a からなる 2 つのルシフェラーゼ ベクターを構築しました (図 6F)。 ルシフェラーゼアッセイにより、Ap-1結合部位を欠く変異体は野生型とは対照的にルシフェラーゼ活性を阻害することが示されました（図6G）。 Ap-1がACKR4a発現を促進することを確認するために、過剰発現またはノックダウンによってAp-1の発現を抑制または増強し、トランスフェクトされたMBrC細胞でACKR4a発現を評価しました。 Ap-1のサイレンシングはV. harveyi誘導性ACKR4a発現を有意に減少させたが(図6H)、Ap-1の過剰発現はACKR4a発現を有意に増強した(図6I)。 イムノブロットの結果は qPCR の結果と一致し、Ap-1 の過剰発現は ACKR4a の発現を増加させましたが、Ap-1 のサイレンシングは ACKR4a の発現を減少させました (図 6J)。 ChIP分析により、Ap-1は通常の生理学的条件下でMBrC細胞のACKR4aプロモーターに結合し、V. harveyi刺激によりACKR4aプロモーターへのAp-1の結合が強化されることが示されました（図6K）。 上記の結果により、ACKR4a が Ap-1 の潜在的な転写標的であることが確認されました。 次に、オートファジーにおける Ap-1 の機能が調査されました。 Ap-1 サイレンシングは、V. harveyi 感染によって誘発される GFP-LC3 の蓄積を効果的に減少させ (図 6L)、V. harveyi 感染によって誘発される LC3- II の上方制御も減弱させました (図 6M) ）。 CFU アッセイは、V. harveyi 感染における Ap-1 の役割を調べるために実行され、AP-1 が V. harveyi の増殖を促進することがわかりました (図 6N)。 まとめると、上記の結果は、Ap-1 が ACKR4a の転写と発現を活性化し、V. harveyi 感染に寄与していることを示しました。
図 6. V. harveyi 感染時の Ap-1 による ACKR4a 誘発オートファジーの増強
図 7.ACKR4a がどのように V. harveyi 感染を促進するかの実用モデル
議論
ACKR は、ケモカイン システム制御、ケモカイン リガンド内部移行、細胞内分解、炎症反応などのいくつかの生物学的プロセスに関与していることが示されています 4,26。これは、適応免疫にとって重要であるだけでなく、自然免疫システムの重要な構成要素としても重要です。 33,34 しかし、魚の細菌感染に対する炎症反応における ACKR の役割は調査されていません。 この研究は、ACKRファミリーのメンバーであるACKR4aが、オートファジーとアポトーシスを介して硬骨魚類へのV. harveyiの感染を促進することを初めて証明した。 機構的には、ACKR4a の転写は転写因子 AP-1 によって上方制御されました。 次に、上方制御されたACKR4aはBeclin-1と相乗してオートファジーを誘導し、MyD88を分解のためにリソソームに輸送しました。 一方、ACKR4a はオートファジーを誘導してアポトーシスをブロックし、V. harveyi 感染を促進します (図 7)。 自然免疫は、真核生物を内因性および外因性の病原体の侵入から守る上で重要な役割を果たしています 46。 微生物への長期曝露の結果、魚は感染から身を守るためにより最適化された自然免疫を進化させました。 47 細菌感染が発生すると、TLR は PAMP を認識します。そしてMyD88-依存性および独立性経路を介して自然免疫応答を開始し、細菌感染を排除する炎症誘発性サイトカインの産生を誘導しました。 MyD88 は TLR シグナル伝達に必須のアダプターであり、TLR3 を除いて、すべての哺乳類 TLR は MyD88 を利用して NF-κB シグナル伝達を活性化します 48。したがって、MyD88 を直接制御することが最も効果的である可能性があります。 たとえば、S-1-アセチルシステインは、MyD88 の分解を誘導することで IL-6 の産生を阻害します。 同様に、魚類では、IRF3 と eIF3k が MyD88 を標的とすることで NF-kB シグナル伝達を阻害することが報告されています。42,49 蓄積された証拠は、MyD88 が細菌感染の排除に重要であることも示唆しています。 たとえば、MyD88-欠損マウスは細菌成分を認識できず、黄色ブドウ球菌に非常に感染しやすい状態でした。 さらに、MyD88 はゼブラフィッシュの細菌感染の除去にも関与していることが示されています。 41 自然免疫系の活性化は、主要な選択圧となる細菌の除去を促進し、自然免疫を抑制する能力の進化を促進します。 .51,52 サルモネラ菌が宿主細胞に感染した後、免疫応答を調節し、炎症反応を操作できることが実証されています。 サルモネラ菌の病原性 SpvC は、ERK、p38、および MAPK を不可逆的に脱リン酸化し、それによって炎症誘発性サイトカインの転写を阻害します。 53 この研究では、V. harveyi に感染した M. miiuy で上方制御された ACKR4a を MyD88 と組み合わせて、p65 リン酸化を阻害しました。 NF-κBシグナル伝達をブロックします。 これは、細菌が免疫回避を目的としてTLRシグナル伝達のアダプターの安定性を妨害することにより、魚の自然免疫を抑制する可能性があることを示唆しています。
オートファジーとアポトーシスは細菌の侵入に対する抵抗性のメカニズムとして認識されており、抗菌性のオートファジーは微生物の侵入に対する障壁となります。 PRR は、宿主と細菌の接触のさまざまな段階でオートファジーを誘導し、細菌の細胞内増殖を阻害します 54。逆に、細菌はオートファジーを予防したり、対抗したり、命令したりするための効率的な機構も進化させてきました。 これらのメカニズムには、多くの場合、オートファジーをブロックするためにベクリン-1を標的にする55、オートファゴソームの成熟を防ぐ56、さらに場合によってはオートファジーを活性化して細菌の増殖に栄養を供給する57ことが含まれます。これとは異なり、我々は、V. harveyiがベクリン{{6}を誘導することを発見しました。 }ACKR4a を介してオートファジーを活性化し、MyD88 を標的にしてオートファジー分解を行うことで、NF-κB シグナル伝達をブロックし、自己複製を促進します。 もう 1 つの防御戦略はプログラムされた細胞死 (アポトーシス) であり、これは病原体が生存と複製のために宿主細胞を使用するときに活性化されます。 たとえば、マクロファージのマイコバクテリウム感染はアポトーシスを引き起こし、細胞からの細菌の除去に寄与します58。さらに、TNF-α媒介マクロファージのアポトーシスは、マイコバクテリアが複製するための細胞内環境を破壊し、感染したマイコバクテリアの増殖速度を低下させます59。多くの成功した病原体は、その産物が宿主細胞のアポトーシスを阻害する遺伝子をコードしており、それによって病原体の複製の生存能力を維持している60。これらの機構は哺乳類ではよく研究されているが、魚類における細菌によるアポトーシスの阻害についてはほとんど知られていない。 私たちの研究では、V. harveyi によって誘導されるオートファジーがアポトーシス段階で役割を果たし、アポトーシスシグナル伝達をブロックすることがわかりました。 アポトーシスとオートファジーは両方とも互いに促進し、拮抗します。 前アポトーシス段階では、細胞はアポトーシス経路をブロックし、オートファジーを通じてアポトーシスのレベルを低下させるため、利点が維持されます。 オートファジーは、アポトーシスの初期段階では細胞死を引き起こしませんが、細胞の生存も促進します 61。 アポトーシスの後期段階でのオートファジーはアポトーシスを促進する可能性があり、その後、アポトーシスの増加により、p53 および BH3 経路の移動を通じてオートファジーの発生が阻害されます。 62生物学的プロセスは、オートファジーとアポトーシスの相互作用など、厳密に制御されています。 多数の調節遺伝子がアポトーシスとオートファジーの相互作用応答メカニズムに関与しており、ベクリン-1もその 1 つです。63 オートファジー開始の調節に加えて、ベクリン-1 はアポトーシスの調節にも関与しています。45 ,64研究では、ベクリン-1は活性化カスパーゼによって切断された後、アポトーシスに抵抗する能力を失うことが示されています。65これは、ベクリン-1が調節において「分子スイッチ」として重要な役割を果たしていることを示唆しています。オートファジーとアポトーシスの関係。
カンクサ-免疫システムを改善する
V. harveyi は、海洋養殖漁業の健全性に重大な脅威をもたらす海洋グラム陰性細菌です。 V. harveyi 感染は魚の髄膜炎と脳炎を引き起こし 66、V. harveyi 感染はハタ類の脳うっ血を引き起こします 67。細菌感染に対する反応として、自然免疫と炎症反応が魚の主な防御システムです。 しかし、細菌は宿主と共生することで免疫を回避する能力も進化させてきました。 要約すると、我々の結果は、魚における V. harveyi 免疫回避のメカニズムを明らかにしました。 ACKR4a はオートファジーを誘導して NF-κB シグナル伝達を阻害し、アポトーシスをブロックします。これにより硬骨魚類の V. harveyi 感染が促進されます。 また、グラム陰性菌がオートファジーを介して自然免疫とアポトーシスを同時に制御することで免疫を回避していることが判明したのはこれが初めてである。 この研究は、硬骨魚類の宿主と細菌の相互作用に対するオートファジーの影響を理解するための洞察を提供し、細菌感染に対する哺乳類の抵抗性に関する展望を提供します。
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