脊髄挫傷マウスモデルにおけるポリ(プロ-17エストラジオール)の急性用量依存性神経保護効果
Jul 05, 2024
抽象的な
17 -エストラジオール（E2）は、全身投与されると脊髄損傷の前臨床モデルに神経保護を与えます。この研究の目標は、ポリ (プロ E2) フィルム生体材料を使用して、損傷した脊髄に局所的に E2 を持続的に適用することでした。
脊髄損傷について人々が学ぶにつれて、脊髄損傷が人々の身体的および精神的健康に与える影響が認識され始めています。脊髄損傷は多くの悪影響を引き起こす可能性がありますが、幸いなことに、記憶への影響は制御できます。
まず、脊髄損傷とは何かを明確にする必要があります。脊髄は背骨の中で保護されている神経で、脳からの指令を体のさまざまな部分に伝達する役割を担っています。脊髄が損傷すると、身体の一部が脳との良好な接続を失い、その結果、手足の動き、感覚、自律神経制御に影響が生じます。
脊髄損傷は、特に脊髄損傷患者のリハビリテーションの初期段階において、人々の記憶に一定の影響を与える可能性があります。脊髄損傷により注意力、作業記憶、感情処理能力が低下する可能性があり、記憶能力に影響を及ぼします。
ただし、患者がリハビリテーション治療を受けるにつれて、これらの悪影響は徐々に減少します。患者は記憶ゲームやその他の認知トレーニングに参加することで記憶力を向上させることができます。同時に、身体的リハビリテーションは体の運動機能と感覚機能を回復し、それによって感情的および認知的機能を改善するのにも役立ちます。
脊髄損傷患者がリハビリテーション治療に積極的に参加し、心身の健康を改善するためにリハビリテーション訓練を継続的に行うよう奨励する必要があります。正しい認知と術後治療の助けを借りて、患者は脊髄損傷による記憶への影響を克服し、活動的な生活を続けることができると信じてください。私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。シスタンシェには、記憶と学習に非常に重要なアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。さらに、シスタンシュは血流を改善し、酸素の供給を促進することで、脳に十分な栄養とエネルギーを確保し、それによって脳の活力と持久力を向上させることができます。
成体雄マウスの挫傷性脊髄損傷後、ポリ(プロ-E2)フィルムを硬膜下に移植し、損傷および移植の7日後に免疫組織化学を用いて神経保護を評価した。これらの研究では、ポリ(プロ-E2)フィルムは、炎症反応に影響を与えることなく、神経保護を適度に改善した。負傷した対照と比較した場合。
放出される E2 用量を増やすために、結合していない E2 をポリ (proE2) フィルムに組み込むことによって、ボーラス放出ポリ (プロ E2) フィルムを作製しました。
しかし、損傷した対照と比較して、ボーラス放出ポリ (プロ E2) フィルムは、損傷後 7 日または 21 日の時点で、神経保護を有意に強化したり、炎症を制限したりすることはありませんでした。今後の研究は、より正確に治療用量のE2を放出します。
導入
外傷性脊髄損傷（SCI）は、米国で毎年 18,000 人以上が罹患している衰弱性疾患であり1、世界の脊髄損傷の有病率は 100 万人あたり 236 人から 1,009 人と推定されています。2
SCIに罹患した患者は、感覚喪失、腸/膀胱機能障害、麻痺などの重度の神経障害を引き起こします3,4。脊髄への一次衝撃により損傷部位で神経細胞死が起こり、アストロサイトやマクロファージが関与するいくつかの二次損傷カスケードによってさらに悪化します。 。
時間の経過とともに、これらの星状細胞はグリア瘢痕を形成し、病変の端を越えて軸索が伸長するのを防ぎます。5 現在まで、SCI の治療に FDA が承認した神経保護薬はありません。
数十年にわたる研究は、二次損傷による神経細胞の喪失を防止したり、軸索の再生を促進したりして、最終的には失われた機能の回復につながる生体分子の全身投与に焦点を当ててきました。性ホルモン、17 -エストラジオール(E2)。
E2 投与は、炎症を軽減し、7-9 グリア細胞の反応性を緩和し、10 酸化ストレスを制限し、11-14 グルタミン酸誘発性興奮毒性神経細胞死を軽減することにより、中枢神経系に広く有益です。15 E2 は、SCI のさまざまなげっ歯類モデルにおける機能回復を改善します。興味深いことに、E2 の複数回全身投与は、単回投与のみを受けた動物と比較して、より迅速に機能回復を誘導します 18,19。
E2は複数回投与レジメンを通じて機能回復をより効果的に促進するため、我々の目標は、E2の複数回投与/全身注射から生じる問題を回避するために、損傷部位で局所的にE2を安定して放出し(オフターゲット効果を防ぐため)することでした。
そのために、我々はポリ（プロドラッグ）生体材料戦略を採用しました。この戦略では、前述したように、ネイティブ薬物（E2）を最初に反応性アリル基で官能化し、次に柔軟なオリゴ（エチレングリコール）ジチオールによる光開始チオールエンラジカル付加によって重合させます。 .20 ポリマー内の繰り返し単位として E2prodrug から構成される高分子量ポリマー鎖が得られました。
加水分解により、ポリマーは周囲の媒体に E2 を徐々に放出します。放出による他の唯一の副産物は、二酸化炭素とオリゴ(エチレングリコール) (oEG) です (図 1)。フィルムまたはマイクロファイバーに加工されたポリ (プロ E2) 鎖は、数ヶ月から数年の時間スケールで in vitro でナノモル濃度の E2 を放出できます。 .20
これらのポリ(プロ-E2)足場から放出されるE2は生物活性があり、これらの足場は、過酸化水素誘発酸化ストレスからニューロンを保護することにより、インビトロで神経栄養症および神経保護を促進する。ここで、我々は損傷直後の挫傷SCIのマウスモデルにポリ(プロ-E2)フィルムを適用し、生体内での神経保護能力を評価した。
私たちの最初のポリ (プロ E2) フィルム設計は、炎症反応に影響を与えることなく、損傷部位での神経保護を急激に (損傷後 7 日間) 増加させました。ポリ (プロ E2) フィルムは 1 日あたりナノグラムの E2 を放出するため、結合していない E2 をポリ (プロ E2) マトリックスに組み込む別の放出戦略を開発しました。我々は、結合していない E2 のボーラス放出がさらなる神経保護効果をもたらす可能性があると仮説を立てました。
ポリ(プロ-E2)フィルムはE2をバースト的に放出し、その後低濃度でポリマーからE2を持続的に放出した。免疫組織学的染色により、これらのボーラス放出ポリ(プロ-E2)フィルムの存在下で、SCI後の急性(損傷後7日)および慢性(損傷後21日)に損傷部位に存在するニューロン、アストロサイト、およびマクロファージ/ミクログリアを評価した。
結果と考察
Poly(pro-E2) フィルムは、ナノモル濃度で E2 を放出し、後根神経節からのニューロンの成長を促進し、in vitro で過酸化水素誘発の酸化ストレスからニューロンを保護します。20 ここで紹介される研究は、poly(pro-E2) の能力を決定することを目的としています。挫傷SCIのマウスモデルを使用して生体内で神経保護を提供するフィルム。
成体雄マウスに中等度の挫傷 SCI を誘発し、損傷直後にポリ (プロ E2) フィルムを損傷の真上に置きました (図 2A)。ポリ(プロ-E2)フィルムが移植後に所定の位置に留まるようにするために、ローダミンBを負荷したポリ(プロ-E2)フィルムを損傷した動物の脊髄に移植した。移植から 7 日後、脊髄を収集し、光学顕微鏡を使用して画像化しました (図 2B)。すべての動物において、移植されたローダミン B を負荷したポリ (プロ E2) フィルムは所定の位置に残り、移植プロトコルが検証されました。
神経保護を提供し、炎症を軽減するポリ（プロ E2）フィルムの能力をテストするために、ポリ（プロ E2）フィルム（ローダミン B を含まない）を脊髄挫傷後に移植し、損傷および移植の 7 日後に脊髄を採取しました。損傷震源の周囲を中心に縦切片(厚さ10μm)を切り出し、脊髄内のニューロンおよびマクロファージを視覚化するために免疫標識した(図3)。
神経細胞の存在を評価するために切片に NeuN のラベルを付け、染色の定量分析により、ポリ (プロ E2) フィルムがフィルム移植を受けなかった損傷対照と比較して損傷震源周囲の NeuN 陽性領域を有意に増加させたことが明らかになりました (図 3A; p)。=0.0002)。 NFH (神経フィラメント重鎖) を使用した軸索の追加染色も、移植されたポリ (プロ E2) フィルムの急性神経保護効果を明らかにしました (図 3B; p=0.0017)。
私たちは、この神経保護の変化が損傷部位のアポトーシス (カスパーゼ 3) の変化によるものではないことを観察しました (図 S1 を裏付ける; p=0.9966)。また、活性化マクロファージ (CD68) の染色でも、何も明らかになりませんでした。ポリ(プロ-E2)フィルムで処置した動物と未処置の動物との間の有意な差(図3C; p= 0.7207)。
まとめると、ポリ (プロ E2) フィルムは、炎症反応を変えることなく、神経保護を急激にわずかに増加させます。ポリ (プロ E2) フィルムは、ニューロン密度をほぼ 20% 急激に増加させましたが、フィルムには明らかな抗炎症効果はありませんでした (定量化に基づく)。活性化されたマクロファージが占める領域) (図 3)。
この炎症減少の欠如は、E2 の抗炎症用量と神経保護用量が異なること、および現在のフィルム製剤では両方が達成されなかったことを示している可能性があります。 我々は、ポリ (プロ E2) フィルムからの E2 放出の増加により炎症が急激に軽減される可能性があると仮説を立てました。より強力な神経保護反応を可能にします。
急激に放出される E2 の用量を増やすために、移植直後にボーラス E2 放出が起こるようにポリ (プロ E2) フィルムを改変しました。 E2 のボーラス放出後、ポリマーの分解が続き、以前と同じ濃度で E2 が放出されます。これらのボーラス放出ポリ（プロＥ２）フィルムを使用して上記の実験を繰り返し、損傷後７日目（ｄｐｉ）に神経保護と炎症を評価した。
しかしながら、追加の利益の代わりに、ボーラス放出ポリ（プロＥ２）フィルムは、損傷した未治療の対照と比較して、ＮｅｕＮ陽性領域を有意に増加させなかった（図４Ａ；ｐ= 0.6770）。ボーラス放出ポリ (proE2) フィルムは CD68 発現を増加させましたが、その増加には統計的な差異はありませんでした (p= 0.1780)。
GFAP (アストロサイト) および Iba1 (ミクログリア) 発現の増加により、ボーラス放出ポリ (プロ E2) フィルムの存在下でグリア反応性とミクログリア炎症の増加傾向も観察されました。ただし、これらの増加は、損傷した未治療の対照で観察されたものよりも統計的に大きくはありませんでした（それぞれ、p=0.3233およびp=0.3053）。総合すると、ボーラス放出ポリ (プロ E2) フィルムは神経保護を強化せず、星状膠細胞の反応性とマクロファージ/ミクログリアの存在は当初の仮説のように減少しませんでした。
損傷を受けた未治療の動物と、損傷を受けてボーラス放出ポリ（プロＥ２）フィルムで治療された動物との間の差異は、急性の７ｄｐｉ時点では観察されなかったため、ポリ（プロＥ２）フィルムが損傷しているため、さらなる調査のために慢性時点を選択した。上記の実験はボーラス放出ポリ（プロ E2）フィルムを用いて繰り返されましたが、動物は 21 dpi で慢性的に評価されました（図 5）。
脊髄には、前述したのと同じ細胞タイプのラベルが付けられました。分析後、損傷した未治療の動物と比較して、ボーラス放出ポリ(プロ-E2)フィルムを移植した動物ではNeuNの面積率が増加する傾向があった(図5A; p=0.0897)。さらに、ボーラス放出ポリ(プロ-E2)フィルムは、未治療の損傷動物対照からのデータと比較して、CD68およびGFAP発現の面積分率を減少させる傾向が観察された(図5B、C; p=0.0859およびp=0.2780)。
ただし、どの傾向も統計的には異なりませんでした。一方、ボーラス放出ポリ(プロ-E2)処置動物からのIba1標識組織切片は、未処置の損傷対照からのデータと比較して発現増加を示した(p<0.0001)。我々の以前の研究は、ポリ(プロ-E2) 15 mm × 15 mm のカバースリップ上にキャストしたフィルムは、1 日あたり約 266 ng の E2 を放出します 20。これは、ここで使用したフィルム (1 mm × 1.8 mm) から 1 日あたり約 2 ng の E2 を放出することになります。ボーラス放出ポリ (プロ E2) フィルムは、移植後すぐにさらに 40 μg の非結合 E2 を放出します。
げっ歯類のSCIモデルにおけるE2の使用に焦点を当てた研究では、静脈内投与された低用量エストロゲン(10μg/kg)が反応性神経膠症を軽減し、炎症事象を軽減し、アポトーシスを阻害し、血管形成を増加させながら神経保護を提供することが示されている21。逆に、高用量のエストロゲンを全身投与すると、深部静脈血栓症やがんの発生率の増加22,23、男性における女性的な身体的特徴の発達などの悪影響があります。 E2 研究のほとんどが E2 を静脈内または腹腔内に全身的に送達することに焦点を当てているため、これは注目に値します。
高用量の E2 の全身使用に伴う安全性の懸念を考慮すると、副作用を防ぐために損傷した脊髄への局所送達の E2 濃度を最適化することが重要です。現在までのところ、ナノ粒子を使用して E2 (2.5 ug または 25 ug) を局所的に送達することによって生体材料から E2 を送達した研究は 1 つだけです。ナノ粒子からの放出により、SCI 挫傷ラットモデルにおいて炎症が急速に減少しました。9 私たちのデータ (図 4 および 5) に統計的に有意な反応が見られないのは、脊髄に局所的に送達される E2 の量の不均衡が原因である可能性があります。非常に多くの E2 (40 μg) が急性的に放出される一方で、非常に少量 (2 ng) が慢性的に放出されます。
これらのデータから観察されることは控えめな傾向ですが、この研究は、生体内での神経保護を促進するための E2 投与の重要性を強調しています。 E2 の初回投与量を減らし、ポリ (プロ E2) 生体材料の分解速度を調整することは、この問題の軽減に役立ち、より良い神経保護効果が得られる可能性があります。
この研究は男性のみを対象に実施されましたが、この生体材料の有効な翻訳可能性を確立するには、男女両方でこれらのポリ (プロ E2) フィルムの効果を評価することが重要です。研究では、脊髄損傷後の女性のエストロゲンレベルの上昇が、男性と比較して機能的転帰の改善に部分的に関与している可能性があることを示しています。24女性ではエストロゲンの存在が増加しているため、エストロゲンを使用する生体材料戦略では、このレベルの上昇を考慮して材料を変更する必要があります。それに応じて放出動態を調整し、男性と女性で投与量が同じになるようにします。
方法
ポリ (プロ E2) フィルムの製造。
ポリ（プロ E2）ポリマー P1 は、以前に詳細に説明したように合成および特性評価されました。 20 このポリマーは、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によれば、重量平均分子量が MW ～ 80 kDa であり、分散度が ± 3 です。ポリ (プロ E2) フィルムは、ポリマーをクロロホルムに溶解し (5 wt%/wt; ポリマー/クロロホルム)、溶液を 15 mm × 15 mm のカバーガラス上にドロップ キャストし (カバーガラスあたり 100 μL の溶液)、その後放置することによって作製しました。真空下で一晩乾燥させます（<100 mTorr) at
room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented
with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
未結合 E2 を含むポリ (プロ E2) フィルムを作成するには、ドロップキャストの前に未結合 E2 (Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州) をポリマー溶液 (0.0625 wt %/wt; E2/クロロホルム) に加えることによってフィルムを製造しました。溶液をカバースリップ上に置きます。移植前に、フィルムを備えたカバースリップを紫外線（ＵＶ）放射を使用して３０分間滅菌し、滅菌バイオセーフティキャビネット内でフィルムをカバースリップから剥がした。次いで、ポリ（プロ－Ｅ２）フィルムを、以下に記載するように成体マウスへの移植に適した１ｍｍ×１．８ｍｍの小片に切断した。
脊髄挫傷およびポリ (プロ E2) フィルムの移植。
すべての外科的および術後管理手順は、レンセラー工科大学およびオハイオ州立大学施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。挫傷SCIを誘発するために、Jackson Laboratory（ストック番号000664、メイン州バーハーバー）から購入した成体雄C57BL/6マウス（10-〜12-週齢）を腹腔内注射で麻酔した。ケタミン (80 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg)。動物の背中の毛を剃り、70% エタノールとベタジンを使用して無菌的に準備しました。
３７度に維持された加熱パッド上に動物を置いた後、皮膚および筋肉層を開いて脊柱を露出させ、胸椎９番（Ｔ９）椎弓の背側椎弓切除術を行って脊髄を露出させた。 Infinite Horizons インパクター (Precision Systems and Instrumentation、ケンタッキー州レキシントン) を使用して、このレベルで中等度 (75 kdyn) の挫傷 SCI を誘発しました。
止血が達成された後、硬膜を開き (図 2)、ポリ (プロ E2) フィルムまたはボーラス放出ポリ (プロ E2) フィルム (1 mm × 1.8 mm) を硬膜の下および脊髄の上に配置し、覆いました。怪我の部位。対照動物では、硬膜は切開されましたが、ポリ(プロ-E2)フィルムは移植されませんでした。次いで、筋肉層を滅菌縫合糸を使用して閉じ、皮膚を滅菌金属創傷クリップを使用して閉じた。
マウスに２ｍＬの滅菌生理食塩水を皮下注射し、ケージに戻し、３７度に設定したスライド加温器上に一晩置いた。適切な水分補給を確保し、感染を防ぐために、損傷後最初の 5 日間 (dpi)、マウスに毎日 1 ～ 2 mL の滅菌生理食塩水とゲントシン (1 mg/kg) を皮下注射しました。実験期間中、膀胱を 1 日 2 回手動で搾り出しました。すべての動物は、餌と水を自由に摂取できる従来の条件下で、12-時間の明暗サイクルで飼育されました。
組織の採取。
7 または 21 dpi の指定された終末時点で、マウスに致死量のケタミン/キシラジン (1.5 倍の外科用量) を注射し、0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; pH 7.4) を経心的に灌流しました。脊髄を除去し、4% PFA で 2 時間後固定し、次に 0.2M リン酸緩衝液 (PB; pH 7.4) に一晩移しました。
脊髄を30%スクロース中で4度、48時間凍結保護し、その後、後柱を上にして損傷部位の周囲を中心とする10mmのセグメントにブロックした。これらの切片を Tissue-Tek 最適切断温度媒体 (VWR International、ペンシルベニア州ラドナー) に包埋し、ドライアイス上で急速凍結させました。すべての脊髄を Microm HM505E クライオスタット上で 10 μm に切片化し、ColorFrost Plus スライド (ThermoFisher Scientific、 Waltham、MA)、その後免疫染色に使用するまで -20 度で保管しました。
免疫組織化学および定量化。
スライドをスライドウォーマー上で1時間解凍し、次に0.1 MPBSで3回リンスした。内因性ペルオキシダーゼ活性は、メタノールで希釈した6% H2O2中でスライドを室温で15分間インキュベートすることによってクエンチされた。 0.1 M PBSで3回洗浄した後、切片を0.1 M PBS中の4% BSAおよび0.1% Triton X-100とともに1時間インキュベートしました。時間後、一次抗体を4℃または室温で一晩インキュベートした(表1)。
スライドを適切なビオチン化二次抗体(1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA)とともに室温で1時間インキュベートした。結合した抗体を視覚化するために、スライドを Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) で 1 時間インキュベートし、ImmPACT3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) または Vector SG 基質 (Vector Laboratories) で 10 分間発色させました。
切片を、70% および 90% エタノールで 2 × 2 分間、100% エタノールで 2 × 3 分間、続いて Histoclear で 3 × 3 分間のインキュベーションを繰り返して脱水し、最後に Permount (ThermoFisher Scientific) でカバースリップをかけました。定量分析には、損傷した脊髄内に100μmの間隔をあけた動物当たり6つの切片を使用した。
免疫標識切片は、AxioCamdigitalカメラおよびAxioVisionバージョン4.8.2ソフトウェア(Carl Zeiss Microscopy GmbH、イエナ、ドイツ)および5倍の対物レンズを備えたAxioplan 2画像化顕微鏡を使用して画像化した。
ＭＩＰＡＲ画像解析ソフトウェア（ＭＩＰＡＲ、オハイオ州ワーシントン）を使用して各セクションの陽性ピクセルの数を数え、セクション当たりの陽性面積率を計算した。動物当たり６つの切片の平均陽性面積パーセントを各染色について計算し、報告した。
統計分析。
すべてのデータは平均±標準偏差として報告されます。統計分析は、GraphPad Prism 9 Statistical Software (GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して実施した。すべての実験において、少なくとも 2 つの異なる動物ロットに由来する、1 グループあたり 5 ～ 6 匹の動物が使用されました。対照群とポリ（プロＥ２）フィルム群との間の差を試験するために、スチューデントのｔ検定（図３、４、および５）を使用した。 p 0 以下で有意性が確立されました。05。
補足資料
補足資料については、PubMed Central の Web バージョンを参照してください。
謝辞
著者らは、マウスの手術を支援してくれたウェンミン・ライに感謝する。
資金調達
この研究は、MKG へのクレイグ H. ニールセン財団フェローシップ (助成金 468116) および麻痺退役軍人研究財団フェローシップ (助成金 3171)、および NIH R01 (助成金 NS092754) およびニューヨーク州脊髄損傷審査委員会の RJG への施設内支援助成金 C32245GG からの支援を受けました。すべての動物実験は、NINDS Grant P30NS104177 の支援を受けたオハイオ州立大学神経科学部外科コアの支援を受けて実施されました。
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