付着性および懸濁液性のベビーハムスター腎臓細胞は、異なる細胞骨格および表面受容体レパートリーを持っています

連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com

ヴェロニカディル¹、フロリアン・プファフ¹、Aline ZimmerID²、マーティンビール¹、Michael EschbaumerID^1*

概要

単一細胞が成長する動物細胞培養サスペンション、理想的には化学的に定義された環境で、バイオ医薬品生産の主力です。 合成環境は外因性成長因子を欠いており、通常、増殖する細胞クローンを選択するために時間のかかる適応プロセスを必要としますサスペンション高い細胞数に。 適応を促進し、細胞内で起こる分子メカニズムはほとんど知られていません。 特に、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞などのウイルス抗原産生に使用される細胞株の場合、望ましくない細胞特性の進化によるウイルス増殖の制限は非常に望ましくありません。 付着増殖しているBHK細胞と異なる浮遊細胞の比較感受性口蹄疫ウイルスは、インテグリンやヘパラン硫酸などの細胞受容体の発現とアクチン細胞骨格の構成に違いがあることを明らかにしました。 トランスクリプトーム分析と成長動力学BHK細胞株の多様性を実証し、十分に特徴づけられた親細胞クローンの重要性と、適応中に本質的な細胞機能が失われないようにするための注意深いスクリーニングを確認しました。

Cistanchetubulosaは腎臓病を予防します。サンプルを入手するにはここをクリックしてください

1.はじめに

動物細胞培養技術は、ワクチン生産におけるウイルス抗原の生産に最初に使用されましたが、最近では、組換えタンパク質の細菌または酵母生産プラットフォームも哺乳類細胞システムに切り替えられています[1、2]。 両方の状況で重要なのは、シリアのゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）に由来するベビーハムスター腎臓（BHK）細胞です。 もともと、BHK細胞は、ウシ胎児血清（FBS）を含む標準的な細胞培養条件で線維芽細胞の増殖パターンを示す、付着性に増殖するアンカー依存性の哺乳類細胞株でした[3、4]。 付着性BHK細胞の適応サスペンション大規模な培養条件と組み合わせた無血清培地での増殖は、高収量での組換えタンパク質（例えば、第VIII因子）の生産のサクセスストーリーです[1、2]。 さらに、BHK細胞は、口蹄疫（FMD）ウイルスを含む広範囲のウイルスに感染しやすい[5]。 世界の多くの地域で増大するFMDワクチンの需要を満たすには、大量の抗原を可能な限り安価に生産する必要があります。これは、細胞側の生細胞密度を高め、上流および下流の処理を簡素化することでコストを削減することで実現できます。生産側の抗原の[6]。 動物成分を含まない培地（ACFM）は、外来物質による汚染のリスクを低減し、血清を補充する必要がない場合のプロセスをさらに簡素化します[6、7]。 ただし、血清を含まない懸濁液およびACFMで増殖するように細胞を適応させることは、時間がかかり、段階的なプロセスです[6、8]。 BHK細胞は、懸濁液中で3.5×106細胞/ mLの細胞密度に容易に到達しますが、適応は常に、開始集団と比較して望ましくない細胞特性を進化させるリスクを伴い、成長性能の低下、細胞特異的収量の不足、または腫瘍形成性資産をもたらす可能性があります[5、7]。 次に、細胞への変化は、文化的適応プロセス中に予期しないウイルス変異を引き起こす可能性があります。 特にワクチン抗原産生の場合、ウイルスの特徴と抗原性の変化は非常に望ましくありません。 BHK細胞は、感受性とFMDVの特定のウイルス株を増殖させる可能性がすでに異なります[9]。 明らかに、スフェロイドの凝集と形成を介した足場依存性線維芽細胞の成長から、懸濁液中で独立して成長する細胞への変化は、細胞自体への有意な変化を伴います[4、6]。 細胞外マトリックスと細胞の接触の中断によるインテグリンシグナル伝達の喪失は、膜タンパク質の発現と、インテグリンを介したシグナル伝達の重要な受容者であるアクチン細胞骨格の組織化に変化をもたらします[6、10]。 同時に、これらのインテグリンは、天然宿主におけるFMDVの受容体であり、細胞培養における一次受容体であるため、FMDV感染において重要な役割を果たします[11]。

付着的に成長しているHK細胞とサスペンション細胞工学の新しい可能性を開き、ワクチン抗原産生に適した細胞クローンの選択を簡素化します。

この研究では、付着的に成長するBHK細胞とACFM適応サスペンションBHK細胞は、インテグリンやヘパラン硫酸（HS）などの細胞受容体の発現、細胞表面にタンパク質を提示​​する能力、および細胞アクチン骨格の組織化に関して調べられました。 トランスクリプトーム解析と成長速度論は、テストされたBHK細胞株の多様性に関する情報を提供します。

cistancheは腎臓に栄養を与え、腎臓機能を改善することができます

2。材料と方法

2.1細胞株と細胞培養

使用した主な細胞株は、2つの付着性BHK -21クローン13誘導体（アメリカンタイプカルチャーコレクション[ATCC] CCL -10から、獣医学の細胞株コレクションでCCLV-RIE164および179として保持）でした。 、Friedrich-Loeffler-Institut、Greifswald、Germany;要するに：BHK164またはBHK179）およびサスペンションEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（ECACC; 84111301）およびBHK-InVitrus（BHK-InV、「ライン＃8」とも呼ばれる）によって提供される細胞株BHK21C 13-2 P（BHK -2 P）以前の出版物[12]のように、Sigma-Aldrich、セントルイス、米国）。

増殖動態については、次の細胞株を追加で使用しました。BHK-2 Pは、10％FBSを含むグラスゴーの最小必須培地（GMEM）で維持するか（「ライン＃2」）、ACFMCellvento™BHK200（ Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）2つの異なるプロセス（ライン＃4と＃5）、および他の4つのプロセスサスペンション細胞株：BHK21C13はサスペンション血清（ライン＃3）、BHK 21- C（ライン＃6）、BHK 21-ヘクター（ライン＃7）および生産BHK（ライン＃9）の段階的な回収によって[12]。 これらのセルはすべてMerckKGaAによって提供されました。

この研究で使用されたすべてのBHK-21細胞は、最終的にMacphersonandStokerのBHK-21クローン13細胞株に由来します[13]。 「細胞株」という用語は大まかに使用されます。 本研究で説明されている11のBHK-21株のすべてが、異なる条件下で培養された誘導体ではなく、真に異なる細胞株であるとは限りません。 参照しやすいように、行の番号付けは以前の出版物[12]の番号付けと一致しています。

前回の出版物の細胞株＃1は本研究に含まれていなかったため、この番号は使用されていません。 代わりに、行番号＃2、＃4、または＃5に言及していないBHK -2 Pセルへの参照は、プリンシパルへの参照です。サスペンションこのセクションの冒頭で紹介した細胞株BHK21C13-2P（ECACC84111301）。

付着チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）卵巣（CHO）細胞株CHO-K1（ATCCCCL -61、CCLV-RIE 134として保持）およびCHO677（CRL 2244、CCLV-RIE 1524として保持）およびIB-RS -2セル（Instituto Biolo´gico-RimSuı´no -2、CCLV-RIE 103として保持）およびMadin-Darbyウシ腎臓細胞（略して：MDBK、CCLV-RIE261として保持）を使用しましたフローサイトメトリー実験のコントロールとして。

培養条件は37℃、5％CO2、サスペンションTubeSpinバイオリアクター（TPP Techno Plastic Products AG、スイス、トラザーディンゲン）で相対湿度80％のセル320rpm。 すべての付着細胞株は、10％FBSを含むハンクス塩およびアール塩（Sigma-Aldrich）を添加したMinimum Essential Medium Eagle（MEM）で培養しました。 上記のように培養された細胞株＃2を除いて、すべての浮遊細胞株はCellvento™BHK200培地（Merck KGaA）で増殖するように適合されました。

細胞密度と生存率の測定は、トリパンブルー（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）と自動セルカウンター（モデルTC20、Bio-Rad）を使用して行いました。

2.2浮遊細胞の増殖曲線分析

増殖曲線分析は、バッチ実験として実施され、2回ずつ、個別に2回、播種密度0.6×106細胞/mLで実施されました。 生細胞密度（VCD）と生存率（パーセント）は、細胞接種後6日まで毎日測定されました。

セル固有の計算は、[14]で与えられた方程式に従って実行されました。

X：VCD（mLあたり）; t：サンプリングの時点（時間）; nおよびn-1：2つの連続するサンプリングポイント。

細胞分裂番号（cd）：

2.3フローサイトメトリー

フローサイトメトリー分析は、フローサイトメトリー機器FACSCanto II（BD Biosciences、オックスフォード、英国）を使用して実行されました。 細胞の破片は、前方および側方の散乱パターンに基づいてゲートアウトされました。 アクチン染色では、Alexa488チャネルの蛍光強度の中央値を直接測定しました。 すべての抗体染色について、Alexa 488またはPE陽性細胞のパーセンテージは、アイソタイプコントロールに基づいて下限が設定されたインターバルゲートを使用して決定されました。 すべての実験は独立して3回実施されました。

2.3.1細胞表面受容体の抗体染色。

水面。 MDBK細胞はv3の発現の陽性対照として機能し、IB-RS-2細胞はv8の発現の陽性対照として機能し、CHO-K1細胞はHSの発現の陽性対照として機能しました。 CHO677細胞は、テストしたインテグリンもHSも発現しないため、すべての実験でネガティブコントロールとして機能しました。 以下の抗体を使用しました。v3の場合、PE結合クローンLM609（希釈率1:20）（mAb1976H、Merck KGaA）。 v 8の場合、一次抗体11E8、クローン68、マウスIgG2a（希釈率1：100）（StephenNishimura博士から提供）とAlexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific）と結合した二次抗体ヤギ抗マウスIgG2a（希釈率1：1000） ）; HSの場合、クローン10E4、マウスIgM（希釈率1：200）（Amsbio、アビンドン、英国）、Alexa Fluor 488（ab150121、Abcam、ケンブリッジ、英国）と結合した二次抗体ヤギ抗マウスIgM mu鎖（希釈率1：2000） 。 各実験では1つの一次抗体のみを使用しました。

懸濁細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。 PBS中の10mM EDTAを使用して付着細胞を剥離し、PBSで洗浄しました。 洗浄後、細胞をセルストレーナー（ナイロンメッシュ、7 0μmポア径、VWR、Radnor、USA）でろ過して細胞塊を除去し、1×106細胞/mLに調整してから1μLのLIVE/ DEAD FixableViolet死細胞​​染色液（Thermo Fisher Scientific）を1mLの細胞懸濁液に30分間添加しました。 このステップとそれに続くすべてのステップは、光から保護され、4℃で実行されました。 一次抗体を30分間インキュベートし、二次抗体を20〜30分間インキュベートしました。 2 mLのFACSバッファー（PBS、0.1％アジ化ナトリウム、0.1％BSA）による洗浄ステップと、300×g、5分、4℃での遠心分離をすべてのステップの後に実行しました。 最後に、染色された細胞を300μLのFACSバッファーに再懸濁しました。

2.3.2アクチン染色。

糸状アクチンは、データシートに従って調製されたファロイジン-iFluor 488試薬（ab176753、Abcam）を使用して染色されました。 BHK179、BHK -2 P、およびBHK-InVcellを上記のように分離し、4％ホルムアルデヒドで、室温（RT）で20分間固定しました。 細胞をPBSで2回洗浄し、1×106個の固定細胞をPBS中の0.1％Triton X -100（Sigma-Aldrich）で透過処理した後、RTで3分間インキュベートしました。 細胞をPBSで2回洗浄し（300×gで5分間遠心分離）、調製したファロイジンストック溶液を添加し、FACSバッファーで1：1000に希釈し、RTで20分間インキュベートしました。 最後に、細胞をFACSバッファーで2回洗浄し、300μLのFACSバッファーに再懸濁しました。 染色された細胞は、蛍光顕微鏡で直接分析され、FACS分析に使用されました。

2.3.3トランスフェクション実験。

BHK164およびBHK-2P細胞に、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）（Clontech）を発現するプラスミドであるEGFP-N1、または小胞のGタンパク質を発現するプラスミドであるpVSV-Gを使用した別の一連の実験のいずれかをトランスフェクトしました。製造元の指示に従ってLipofectamine3000（Thermo Fisher Scientific）を使用したインディアナ口内炎ウイルス（VSV）。 要するに、Cellvento™BHK200培地で希釈した2ugのプラスミドDNAと1.875μLまたは3.75μLのリポフェクタミンを混合し、RTで20分間インキュベートして複合体を形成させました。 その後、これらの混合物を12-ウェルプレートの細胞に移し（約4×105細胞/ mL）、培地を200μLまで加えました。 細胞を37℃で24時間インキュベートした。

FACS分析では、ウェルの全内容物を24時間後に回収しました。 pEGFPをトランスフェクトした細胞をPBSで3回洗浄し、300μLのFACSバッファーに再懸濁しました。 pVSV-Gでトランスフェクトされた細胞の1つの複製は、抗体染色の前にRTで5分間0.1パーセント（v / v）TritonX -100を含むPBSで透過処理され、もう1つは透過処理されませんでした。 抗体染色は、ポリクローナルウサギ血清VSV 274 / E（希釈率1：500、Stefan Finke博士から提供）およびAlexa Fluor 488と結合した二次抗体ヤギ抗ウサギ（HプラスL）（希釈率1： 1000;サーモフィッシャーサイエンティフィック）。

2.4統計分析

データは、Windows用のGraphPadPrismバージョン07.04（GraphPad Software、La Jolla、USA）を使用して分析されました。 通常の一元配置分散分析は、治療グループ間の差異を評価するために、テューキーの事後検定を使用して行われました。 統計的有意性のしきい値は、0.001のp値に設定されました。

2.5トランスクリプトーム解析

2.5.1 RNA抽出、ライブラリー調製、およびシーケンシング。

トランスクリプトーム解析には、付着性のBHK179細胞株とBHK-2PおよびBHK-InV浮遊細胞株のそれぞれの3つの独立したバッチを使用しました。 平均して、8.3×1 0 5 BHK179細胞、1.6×107 BHK -2 Pcell、および1.4×107 BHK-InV細胞をTRIzol試薬（Thermo Fisher Scientific）で溶解しました。 細胞溶解物に0.2倍量のトリクロロメタンを加え、インキュベーションおよび遠心分離した後、水相を収集し、1倍量の100パーセントエタノールと混合した。 このことから、RNeasy Mini Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を使用し、RNase-Free DNase Set（Qiagen）を使用したオンカラムDNase消化により、メーカーの指示に従ってトータルRNAを抽出しました。 ERCC RNA Spike-In Mix 1（Thermo Fisher Scientific）が追加され、以降のすべてのステップの内部コントロールとして使用されました。 次に、Dynabeads mRNA DIRECT Microキット（ThermoFisher Scientific）を使用して、1〜3ugの高品質トータルRNAからポリアデニル化mRNAを単離しました。 続いて、mRNAを断片化し、TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（Illumina、San Diego、USA）を製造元の指示に従って使用して、cDNA合成およびライブラリー調製に使用しました。 シーケンスは、ハンブルクのHeinrich-Pette-Institutで、NextSeq 500（2x75 bp）およびHiSeq 4000（1x50 bp）機器（イルミナ）を使用して実行されました。

2.5.2差次的遺伝子発現の統計分析。

FastQC（バージョン{{0}}。11.9; Babraham Institute、Cambridge、UK）を使用して、各シーケンスライブラリからの生の読み取りの品質チェックを実行しました。アダプターの前後の読み取り長の分布とアダプターの汚染に重点を置いています。 Trim Galore（バージョン0.6。4_ dev、Babraham Institute）およびCutadapt（バージョン2.10）を使用したトリミング[15]。 次に、サーモン[16]を使用して、トリミングされた生の読み取り値をシリアのゴールデンハムスターのゲノムに準マッピングしました。

つまり、GCF{{0}}。1_MesAur1.0のゲノムおよびトランスクリプトの参照は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）から取得され、ERCCスパイクの参照配列と組み合わされました。コントロールで。 サーモンとの選択的アラインメントを可能にするために、おとりを意識したトランスクリプトームインデックス[17]が構築されました。 定量化には、10回のブートストラップ複製が使用され、シーケンス固有のバイアス、GCバイアス、および5'または3'の位置バイアスの補正が有効になりました。

続いて、サンプル調製中の問題を検出するために、ERCCスパイクインコントロールの定量データを理論濃度と相関させました。

さらに、遺伝子固有の定量化データは最初にフィルタリングされ（15カウントを超える複数の複製に現れる遺伝子のみ）、正則化対数変換（rlog）を使用して正規化され、PCAなどの探索的データ分析に使用されました。 差次的に発現する遺伝子が同定され、その後、DESeq2を使用した経路分析に使用されました[18]。 発現データは、細胞株ペアBHK -2 PとBHK179、BHK-InVとBHK -2 P、およびBHK-InVとBHK179の間で有意に差次的に発現する遺伝子について分析されました。 続いて、分散の過大評価につながる可能性のある低い読み取りカウントまたは可変読み取りカウントを補正するために、DESeq2の関数「lfcShrink」および「apglm」を使用して、結果の2進対数（log2）倍数の変化を調整しました[19]。

有意に異なって発現される遺伝子の基準は、{{0}}。05の最大調整値と1の縮小log2倍変化の最小絶対値に設定されました。経路と基準有意に異なって発現する遺伝子については、最大調整値0.05および収縮log2倍変化の最小絶対値1に設定しました。経路および濃縮分析は、クラスタープロファイル（バージョン3.16.0）の関数「濃縮」を使用して実施しました。

cistancheは腎臓に栄養を与え、腎臓機能を改善することができます

3.結果

3.1 FMDVに対する細胞株の感受性は、その個々の増殖速度および細胞分裂数とは無関係です。

9つの異なるBHK浮遊細胞株を用いたバッチ実験を6日間にわたって実施し、生細胞密度（VCD）と生存率を毎日測定しました。 細胞株がFMDV血清型アジアに対する感受性が異なるという以前の観察に基づいて{{0}}[12]、細胞代謝および増殖速度の上昇がこれによる感染に対する感受性の低下に関連しているかどうかを調べた。ウイルス（表1）。 3つの感受性BHK浮遊細胞株のうち2つは、0。60（＃3）および0.70（＃9）の小さな細胞分裂数（cd）でゆっくりと成長する細胞ですが、3番目の感受性細胞株（＃8）はテストしたすべての細胞株の中で最も高い増殖速度とcd（μ= 0。035、cd=1。62）。

血清の除去とACFMでの増殖への適応は、調査した一連の細胞株のFMDVに対する感受性に影響を与えませんでした。 細胞株＃2は、BHK -2 P細胞株のゆっくりと増殖する血清依存性の前駆体であり、ウシ胎児血清を含むGMEMで懸濁状態に維持されます。 ACFMでの成長への適応中に、細胞は高いVCDのために選択され、高い成長率とcdにリンクされました。 研究に使用された主要なBHK-2P細胞株と同様に、細胞株＃4および＃5も細胞株＃2に由来しますが、ACFMへの適応モードが異なります。 ACFMで維持されているすべてのBHK-2P細胞株は、非常に類似した増殖プロファイルを示しました。 FMDV血清型Asia-1の感受性は、ACFMへの適応中にこれらの細胞株のいずれによっても獲得されませんでした。おそらく、元の系統＃2はすでに耐性があったためです。 同様に、浮遊細胞株＃3では感受性に変化は見られませんでした。 付着して増殖する場合（[12]の細胞株＃1を参照）、細胞はFMDV Asia -1の影響を受けやすく、懸濁液中での増殖への適応中にこの特性を保持していました。 同時に、彼らは他の浮遊細胞の急速な成長プロファイルを獲得しませんでした。

3.2浮遊細胞は、付着性のBHK細胞よりも、表面にFMDVの一次受容体は少ないが二次受容体は多い

ウイルスが細胞にうまく感染するための最初のステップは、ウイルス粒子が細胞表面の受容体分子に結合することです。 付着的に増殖するBHK細胞と懸濁液中のBHK細胞の違いを分析するために、細胞外マトリックス相互作用に関与し、FMDV感染に重要な役割を果たすことが知られている細胞受容体に対する抗体をテストしました。 インテグリンv3およびv8は、RGD（Arg-Gly-Asp）結合モチーフを認識し、血清成分および細胞外マトリックスと相互作用するが、FMDVによってその天然の一次受容体としても使用される代表的な細胞受容体として検討されました。 試験した浮遊細胞株（BHK-InVおよびBHK -2 P）はいずれも、細胞表面にインテグリンv3またはv8を発現していませんでした。 接着性BHKと懸濁液BHKの違いは、インテグリンv 8では有意ではありませんでしたが（図1b）、浮遊細胞株BHK-InVおよびBHK -2 Pと比較して、接着性BHK179の有意に高い割合でインテグリンv 3が発現しました（図1b）。図1a）。

大量のHSが両方の浮遊細胞株の表面に現れました。 HSの発現は、付着性BHK179細胞の複製培養間で非常に異なっていました。 浮遊細胞株と比較して、BHK179培養物では、所定の有意水準で差が有意ではなかったとしても、HS陽性の細胞は少なかった（図2）。

染色および顕微鏡分析により、付着細胞と浮遊細胞の間でアクチン細胞骨格の配置に大きな違いがあることが明らかになりました（図3）。 付着性のBHK179細胞のアクチンフィラメントは、細胞全体に細かい網状パターンで均一に分布していますが（図3a）、浮遊状態で成長している細胞はびまん性のアクチン染色を示しました（図3b）。 興味深いことに、糸状アクチンの量は、浮遊細胞株BHK-InVとBHK-2Pの間で異なっていました。 ファロイジン染色後の蛍光強度（MFI）の中央値は、BHK -2 Pと比較してBHK-InV細胞で有意に高く、これらの細胞の繊維状アクチン含有量が高いことを示しています（図3c）。

3.3浮遊細胞はトランスフェクション効率が異なりますが、表面タンパク質を表示する能力は異なります

付着細胞と懸濁細胞の間のアクチンコンフォメーションの違いのために、細胞は、それらの移動性およびそれらの表面にタンパク質を提示​​する能力に関して調べられた。 一般に、EGFPの発現によって測定されるトランスフェクション効率は、浮遊細胞では低下します（図4a）。 低用量のトランスフェクション試薬を使用した場合、浮遊細胞と比較して、接着細胞のかなり高い割合がEGFPを発現しました。 高用量のトランスフェクション試薬を使用した場合、高用量と低用量の違いは有意ではありませんでしたが、より高い割合の浮遊細胞が正常にトランスフェクトされました。 浮遊細胞が細胞受容体などのタンパク質を表面に提示できるかどうかという質問に答えるために、細胞にVSV Gタンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトしました（図4b）。 Gタンパク質が発現したが細胞表面に表示されなかった可能性を説明するために、染色前に一連の細胞を透過処理しました。 低用量または高用量のトランスフェクション試薬を使用した場合でも、接着細胞と浮遊細胞の間でVSVGタンパク質を発現および提示する能力に有意差はありませんでした。

3.4トランスクリプトーム解析により、浮遊細胞間の細胞外マトリックスに関連する遺伝子の発現の違いが明らかになりました

トランスクリプトーム解析を実施して、付着して増殖しているBHK細胞と懸濁液中のBHK細胞の違いをさらに調査し、懸濁液細胞のFMDVに対する感受性が異なる理由を解明しました。 FBSを添加したMEMで培養された付着性BHK細胞株（BHK179）と、急速に成長するFMDV感受性細胞株（BHK-InV）および急速に成長する耐性細胞株（BHK -2 P）、両方ACFMに適合し、分析のために選択されました。

主成分分析（PCA）は、個々の細胞株の生物学的複製間の密接な関係を浮き彫りにしました（図5a）。 同じ細胞株のすべての複製は、バッチ間の影響をほとんど示さずに、プロット内で密接に配置されています。 最初の主成分（正規化されたデータセットの分散の81％を占める）は、浮遊状態で成長する細胞と付着性で成長する細胞の間の転写の違いとして解釈され、2番目の主成分（分散の15％）は浮遊細胞株BHK-2PおよびBHK-InV、おそらくFMDV感染に対する感受性に関連している。 一緒に、最初の2つの主成分は、データセット内で見つかった分散の96％を説明することができました。これは、トランスクリプトーム分析が3つの細胞株間の関連する違いを識別したことを示しています。

BHK-InVをBHK-2Pと比較した場合、差次的に発現する遺伝子の数が最も少なかった（590が上方制御され、304が下方制御された）。 BHK -2 PまたはBHK-InVを個別にBHK179と比較した場合にも同様の数値が見られました（1527および1519が上方制御され、それぞれ1308および943が下方制御されています）（図5b）。 2つの浮遊細胞株（BHK-InVとBHK -2 P）を組み合わせて、付着性のBHK179細胞株と比較すると、1814個の遺伝子が異なって発現していました。 BHK179とBHK-InVを比較すると、411遺伝子は排他的に異なって発現されますが、BHK179とBHK -2 Pの間ではほぼ2倍（701遺伝子）が排他的に異なって発現されます。 2つの浮遊細胞株の間で、104個の遺伝子だけが排他的に異なって発現されました。

FMDV感受性細胞株BHK179およびBHK-InVの差次的に発現する遺伝子のセットをFMDV耐性細胞株BHK-2Pと比較すると、553個の遺伝子のサブセットが両方の比較で異なって発現することがわかりました（図5c）。 これらの遺伝子はFMDV感受性に関与している可能性があるため、GOターム濃縮分析を実施し、これらの遺伝子の多くが細胞外マトリックス（ECM）の細胞成分、細胞膜、および細胞間結合に関連していることを明らかにしました（図5d）。 。

ECM相互作用に関連する細胞株間の違いを観察したため、トランスクリプトームは、インテグリンv 1、v 3、v 6、v 8、およびアクチンの発現に焦点を当てて再分析されました。これらはすべて、FMDV感染に対する感受性に関連する可能性があります。 （図5e）。 ACTA2を除いて、mRNAレベルでBHK-InV細胞とBHK-2P細胞の間でアクチン関連遺伝子の発現に有意差はありませんでした。 調べたすべてのアクチン関連遺伝子の正規化された遺伝子数は、付着細胞株BHK179の方が浮遊細胞株よりも有意に高かった（S1図）。

3つの細胞株はすべて、インテグリンサブユニットvをコードする、同量のITGAVトランスクリプトを発現しましたが、インテグリンサブユニットの発現は異なっていました。 詳細には、浮遊細胞株BHK -2 PおよびBHK-InVは、付着細胞株BHK179と比較して、ITGB1、ITGB3、およびITGB6の発現が有意に少なかった。 ITGB3とITGB8は、浮遊細胞株BHK-2PとBHK-InVの間で有意に差次的に発現しました。 興味深いことに、ITGB8は、FMDV耐性細胞株BHK -2 Pと比較した場合、FMDV感受性細胞株BHK179とBHK-InVの両方で高度に過剰発現した唯一のインテグリンサブユニットコード遺伝子でした（図5e）。

cistancheは腎臓に栄養を与え、腎臓機能を改善することができます

4。議論

懸濁液中および無血清培地で増殖するための細胞の適応は、抗体、ワクチン抗原、または他のタンパク質の産生に使用される高収量の細胞株を生成するためのバイオテクノロジーにおいて、時間のかかる段階的ですが必要なプロセスです[1、8 ]。 実際、このプロセスには、元の細胞材料と比較して、細胞が望ましくない特性を獲得するリスクが常にあります[7]。 ワクチン抗原産生の場合、標的ウイルスに対する細胞株の感受性が非常に重要です。 口蹄疫ウイルス（FMDV）の場合、特定のBHK細胞株が感染に耐性があるか、継代培養を繰り返すと感受性が失われることはよく知られている現象です[20–22]。 さらに、ウイルスの抗原特性は、宿主細胞に応じて変化する可能性があります[9]。

浮遊細胞は表面とは独立して成長し、酸素が豊富な栄養培地に飲み込まれ、急速に成長します。 細胞の急速な増殖は、培養物を簡単かつ短時間で大量にスケールアップするために必要な機能です。 培地からの血清の除去は、コストと汚染のリスクを減らし、ダウンスケールプロセスを簡素化するために必要です[23、24]。

さまざまなBHK浮遊細胞株のバッチ増殖分析は、無血清条件で急速に増殖する細胞集団に向けた選択がFMDVの増殖に有害であるかどうかを判断することを目的としていました。 実際、3つの感受性細胞株のうち2つはゆっくりと増殖しましたが、FMDVに対する感受性は増殖代謝とは無関係であることがわかりました。 FMDV感受性は、懸濁液中の増殖への最初の適応中にすでに失われている（または保持されている）可能性が高いです。 懸濁液の成長に適応する次のステップでの細胞の表面からの剥離と血清の除去は、表面タンパク質と細胞骨格に関与するタンパク質の発現レベルの変化につながります[7]。

インテグリンは、細胞膜に組み込まれ、細胞間シグナル伝達を仲介するだけでなく、細胞外マトリックス（ECM）コンポーネントの結合を介して細胞と表面の間の強力な接続を仲介する細胞表面受容体の重要なファミリーです[10、25 ]。 細胞周期の調節、細胞骨格の組織化、および新生受容体分子の細胞膜への移行は、インテグリンに依存します[25]。 多くのインテグリンでは、ECMの結合、および培地への血清の添加によって細胞に提供されるリガンドの結合は、RGDモチーフによって媒介され[6、25]、次の場合に変化する可能性があります。細胞は付着増殖から浮遊増殖に切り替わります。 インテグリンによるRGDモチーフの認識は、ウイルス粒子の受容体を介したエンドサイトーシスを開始するためにFMDVによっても使用されます[26]。 FMDVのVP1のRGDモチーフは高度に保存されており[27]、インテグリンv 1、v 3、v 6、およびv 8は、FMDVがinvivoおよびinvitroで使用する既知の受容体です[28–31]。 付着細胞と浮遊細胞の間の細胞表面プロテオームの疑わしい違いもFMDV感染に対する感受性の違いに重要である可能性があるため、インテグリンv3およびv8に結合する抗体を使用して、付着BHK細胞株および感受性および耐性のある懸濁液BHK細胞株。 ITGB6 mRNAは検出可能ですが、このインテグリンはBHK細胞の表面に発現しないことが以前に示されているため[32]、v6染色は実行されませんでした。 同様に、BHK179およびBHK-InV細胞で検出された高レベルのITGB8 mRNA発現にもかかわらず、v8インテグリンは一般にBHK細胞の表面に提示されていないようです。 インテグリンv3は、付着細胞株ではわずかに検出されましたが、浮遊細胞株では検出されませんでした。

インテグリンとは別に、リガンド結合、内在化イベント、および細胞内シグナル伝達は、ヘパラン硫酸（HS）プロテオグリカンによって媒介される可能性があり[33]、二次受容体としてのHSの獲得は、培養中のFMDVの反復継代後にしばしば観察されます[34]。 特異的抗体染色により、両方の浮遊細胞株に豊富なHSが見られ、付着性のBHK細胞にもそれほどではありませんでした。 口蹄疫ウイルスのゲノムに変異があり、HSを受容体として使用できるようにするウイルスキャプシドタンパク質の変化を引き起こし、自然宿主のウイルスを弱毒化することが知られています[35]。 したがって、HSの利用可能性は、ウイルスが適応した細胞株のFMDV非依存性の抗原性の変化にとって重要な要因である可能性があります。

細胞の剥離はアクチン-ミオシン収縮メカニズムの変化に関連しており[7]、懸濁液中で細胞を培養すると、生存のためのさまざまな要件がもたらされます。たとえば、培養液の攪拌による高せん断応力への耐性[6]、アクチン骨格はこの研究で大きな関心を集めています。 顕微鏡分析は、付着性の成長細胞における網状分布から、懸濁状態における高密度の球状構造への細胞骨格のコンフォメーションの再配列を明らかにした。 これは、上記の高せん断応力に対する調整メカニズムである可能性があり、同じ条件でCHO細胞で発生することも知られています[6]。 しかし、mRNAレベルでBHK-InV細胞とBHK -2 P細胞の間でほとんどのアクチン遺伝子の発現に有意差はなかったが、FMDV感受性BHKでは有意に多くの糸状アクチンタンパク質が検出されたことも注目に値する。 -FMDV耐性BHK-2PよりもInV。 これは、球状アクチンの繊維状アクチンへの異なる重合速度に関連している可能性があります。

少なくとも付着細胞では、FMDVの侵入はアクチンダイナミクスに依存します。 ウイルス侵入はアクチンフリルを誘発し、糸状アクチンの球状アクチンへの変換を介したアクチンフィラメントネットワークの破壊が感染の初期段階で報告されています[36-38]。 FMDVに感染したときに付着性BHK細胞に見られる細胞変性効果（CPE）から判断すると、細胞骨格はその構成要素の多くで集中的な再配列を経ます[38]。 このようなCPEは、すでに球形であるため浮遊細胞には見られませんが、アクチン含有量の上昇はウイルスにいくらかの利点をもたらす可能性があります。 アクチン細胞骨格の違いのため、トランスフェクション実験を実施して、懸濁液と付着性BHKのトランスフェクション効率を比較し、懸濁液細胞の高密度の細胞骨格が細胞表面でのタンパク質の提示を妨げる​​かどうかを判断しました。 浮遊細胞株のトランスフェクションは非常に困難であることが一般的に知られています。これは、トランスフェクション複合体の細胞膜への付着が減少し、その後DNAペイロードの取り込みが減少するためです[39]。 これは私たちの実験でも確認されました。 しかし、BHK -2 P細胞では、接着性のBHK細胞株と比較してトランスフェクション効率が低下しましたが、トランスフェクトされたVSVGタンパク質を細胞表面に表示する能力に違いはありませんでした。 BHK -2 P細胞では、pEGFP-N1発現プラスミドとpVSV-G発現プラスミドの間に染色細胞の割合の違いが観察されました。 これはこれ以上調査されませんでしたが、VSV-Gの可視化に使用される免疫蛍光染色とEGFPの生来の蛍光との間の検出限界が異なることが原因である可能性があります。

最後に、トランスクリプトーム解析を実行して、一方では付着性BHK細胞と浮遊BHK細胞の間、他方ではFMDV感受性とFMDV耐性のBHK細胞株の間の転写の違いについてより多くの情報を提供しました。 私たちの結果は、付着性増殖から懸濁増殖への切り替え中のCHO、MDCK、またはHEK細胞のトランスクリプトミクス変化に関する他の研究と一致しています。 一般に、ほとんどの変化は、細胞骨格構造、細胞代謝、およびECM成分の相互作用に関連しており、浮遊細胞に対してアップレギュレーションされます[7、40、41]。 驚いたことに、FMDV耐性のBHK -2 P浮遊細胞は、これらの遺伝子セットのダウンレギュレーションを示しました。これは、BHK-InV細胞と比較してBHK-2Pのアクチンレベルが低下したことも説明している可能性があります。 インテグリンサブユニット発現の特異的分析により、3つすべての細胞株で同様のレベルのインテグリンサブユニットV転写産物が明らかになりました。 すべての細胞株で最も高い発現がインテグリンサブユニット1で見られました。インテグリン1は10の異なる鎖を持つヘテロダイマーを形成でき、ほとんどの哺乳動物細胞で構成的に発現されることに注意することが重要です[6、42]。 同様に、Vサブユニットは5つの異なる鎖を持つヘテロダイマーを形成することができますが、6と8はVと組み合わせて細胞表面にのみ存在します[42]。 これは、単一のインテグリンサブユニットの転写産物の観察された豊富さに正確に反映されています。 付着細胞における3の転写の上昇は、抗体染色実験におけるインテグリンv3のより高いシグナルともよく相関します。 一方、BHK -2PとBHK-InVの間で観察されたITGB3とITGB8のmRNAレベルの違いは、表面染色には反映されていませんでした。 これが単にmRNAとタンパク質の定量法の感度の違いによるものなのか、転写後のタンパク質発現や表面提示の遮断を示しているのかを解明することはできませんでした[43]。 全体として、浮遊細胞株BHK -2 PおよびBHK-InVは、付着細胞株と比較して、ITGB1、ITGB3、およびITGB6mRNAの発現が有意に少なかった。

5.結論

結論として、浮遊細胞の調製では、よく知られた特性を持つ親細胞クローンを使用し、適応プロセス中に得られた細胞集団を注意深くスクリーニングして、細胞株が本質的な特徴を保持していることを確認することが非常に重要です。 、FMDVに対する感受性。 さらに、FACS分析やトランスクリプトミクスなどの最新の方法を使用して、生産細胞株のさらなる特性評価を行う必要があります。

cistancheは腎臓に栄養を与え、腎臓機能を改善することができます

謝辞

PatrickZitzowの優れた技術サポートに感謝します。

著者の貢献

概念化：ヴェロニカ・ディル、マイケル・エシュバウマー。

正式な分析：ヴェロニカ・ディル、フロリアン・プファフ。

資金調達：アラインジマー、マーティンビール。

調査：ヴェロニカディル。

方法論：ヴェロニカ・ディル、フロリアン・プファフ、マイケル・エシュバウマー。

プロジェクト管理：Martin Beer.Resources：Aline Zimmer

監督：マイケル・エシュバウマー。

視覚化：ヴェロニカ・ディル、フロリアン・プファフ、マイケル・エシュバウマー。

執筆–原案：ヴェロニカディル。

執筆–レビューと編集：Veronika Dill、Florian Pfaff、Aline Zimmer、Martin Beer、MichaelEschbaumer。

参考文献

1.メルテンOW。 細胞培養の進歩：足場依存性。 Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370（1661）：20140040。

2. Dingermann T.組換え治療用タンパク質：生産プラットフォームと課題。 Biotechnol J.2008; 3（1）：90–7。

3. Hernandez R、ブラウンDT。 ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞の成長と維持。 CurrProtocMicrobiol。 2010; 第4章：付録4H。 mca04hs17 PMID：20440683

4. Cruz HJ、Moreira JL、Stacey G、Dias EM、Hayes K、LoobyDなど。 組換えタンパク質を産生するBHK細胞の無血清培地および無タンパク質培地への適応。 細胞検査。 1998; 26（1）：59–64。

5. Guskey LE、JenkinHM。 BHK -21細胞のシェーカー培養での増殖への適応と、それに続く日本脳炎ウイルスによる攻撃。 ApplMicrobiol。 1975; 30（3）：433–8。 https://doi.org/10.1128/am。 30.3。433-438。1975PMID：1237269

6. Walther CG、Whitfield R、JamesDC。 CHO細胞の浮遊適応におけるインテグリンとアクチン細胞骨格間の相互作用の重要性。 ApplBiochemBiotechnol。 2016; 178（7）：1286–302。

7. Kluge S、Benndorf D、Genzel Y、Scharfenberg K、Rapp E、ReichlU。MDCK細胞株の付着から懸濁液中での成長までの段階的適応中のプロテオームの変化を監視します。 ワクチン。 2015; 33（35）：4269–80。

8. Costa AR、Withers J、Rodrigues ME、McLoughlin N、Henriques M、OliveiraRなど。 チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化プロファイルに対する無血清条件への細胞適応の影響。 Nバイオテクノロジー。 2013; 30（5）：563–72。 https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12。 002 PMID：23247406

9. Bolwell C、Brown AL、Barnett PV、Campbell RO、Clarke BE、ParryNRなど。 口蹄疫ウイルスの抗原性変異体の宿主細胞選択。 JGenVirol。 1989; 70（Pt 1）：45–57。

10. Wiesner S、Legate KR、FasslerR.インテグリン-アクチン相互作用。 Cell MolLifeSci。 2005; 62（10）：1081–99。

11. O'Donnell V、Pacheco JM、Gregg D、BaxtB.ナイーブ牛および感染牛の組織における口蹄疫ウイルスインテグリン受容体発現の分析。 JCompPathol。 2009; 141（2–3）：98–112。 PMID：19515380

12. Dill V、Hoffmann B、Zimmer A、Beer M、Eschbaumer M. FMDV Asia -1の浮遊培養への適応：細胞耐性はウイルスキャプシドの変化によって克服されます。 ウイルス。 2017; 9（8）。 https://doi.org/10。 3390 / v9080231 PMID：28820470

13. Macpherson I、Stoker M.ハムスター細胞クローンのポリオーマ形質転換—細胞の能力に影響を与える遺伝的要因の調査。 ウイルス学。 1962; 16：147–51。

14. Rourou S、van der Ark A、van der Velden T、KallelH.完全に動物成分を含まない条件下で攪拌バイオリアクターで増殖させたベロ細胞で狂犬病ウイルスを増殖させるためのマイクロキャリア細胞培養プロセス。 ワクチン。 2007; 25（19）：3879–89。

15. Martin M. Cutadaptは、ハイスループットシーケンスリードからアダプターシーケンスを削除します。 EMBnetjournal。 2011; 17：10–2。

16. Patro R、Duggal G、Love MI、Irizarry RA、Kingsford C. Salmonは、転写産物発現の高速でバイアスを意識した定量化を提供します。 ネイチャーメソッズ。 2017; 14（4）：417–9。

17. Srivastava A、Malik L、Sarkar H、Zakeri M、Almodaresi F、SonesonCなど。 アラインメントとマッピングの方法論は、転写産物の存在量の推定に影響を与えます。 ゲノムバイオロジー。 2020; 21（1）：239。

18. Love MI、Huber W、AndersS.DESeq2を使用したRNA-seqデータの倍率変化と分散の適度な推定。 ゲノムバイオロジー。 2014; 15（12）：550。

19. Zhu A、Ibrahim JG、LoveMI。 シーケンスカウントデータの裾が重い事前分布：ノイズを除去し、大きな差を保持します。 バイオインフォマティクス。 2019; 35（12）：2084–92。

20. Clarke JB、SpierRE。 口蹄疫ウイルスの3つの株に対するBHK集団およびクローン化細胞株の感受性の変動。 アーチビロル。 1980; 63（1）：1–9。