細菌表面タンパク質のユビキチン化を含む先天性病原体センシング戦略パート 2
Jul 28, 2023
議論
後生動物は、細胞質の恒常性を維持し、損傷したタンパク質/細胞小器官の蓄積を防ぎ、侵入する病原体から防御するための多用途機構としてユビキチン化を使用します(40、41)。 さまざまな病原体とさまざまな損傷タンパク質が遭遇することを考慮すると、基質認識とその後のユビキチン化のための共通モチーフの同定は、資源を最適化するための賢明な戦略となります。 タンパク質分解を受ける真核細胞内のタンパク質は、通常、三部構成のデグロンモチーフによって識別されます (24)。
免疫とは、細菌、ウイルス、その他の有害物質に対する反応を含む、病気と闘う体の能力です。 体の免疫システムが損なわれると、病気の猛攻撃に対処するのに十分な力が得られません。 研究によると、栄養失調は免疫系の機能に影響を与え、体が感染症や病気にかかりやすくなることがわかっています。 タンパク質は免疫力を維持するために重要な物質の一つです。
タンパク質はアミノ酸で構成されており、その一部は食物から摂取する必要があり、体内で合成できないため必須アミノ酸と呼ばれます。 これらの必須アミノ酸には、トリプトファン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、イソロイシン、メチオニン、バリン、ヒスチジンが含まれます。 体が必須アミノ酸を十分に摂取できない場合、タンパク質代謝障害が起こり、免疫系の機能に影響を与える可能性があります。
さらに、高品質のタンパク質の摂取は、正常な免疫システムと身体機能の維持に役立ちます。 体にタンパク質が不足すると、免疫システムが低下し、病気にかかりやすくなります。 人間の体にタンパク質が長期間不足すると、免疫システムに長期的な損傷を引き起こし、さまざまな病気にかかりやすくなる可能性があります。
したがって、タンパク質摂取量を維持するには、バランスの取れた食事と適切な運動が鍵となります。 人々は、肉、鶏肉、魚、豆、卵、乳製品、穀物、ナッツ、種子などのタンパク質が豊富な食品をより多く食べることで、体のタンパク質の必要を満たすことができます。 さらに、適度な運動は、体のタンパク質の需要と吸収効率を高めることにもなります。 バランスの取れた多様な食事と健康的なライフスタイルは、免疫力を維持し、身体を健康で安定させ、病気の侵入に抵抗するための鍵となります。 この観点からも免疫力を高める必要があります。 肉に含まれる多糖類が人間の免疫系の免疫反応を調節し、免疫細胞のストレス能力を改善し、免疫細胞の免疫力を高めることができるため、カンカンケは免疫力を大幅に向上させることができます。 殺菌効果。
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このことから、同様のモチーフが病原体の表面で見つかるかどうか、基質認識の代理として機能する可能性があるかどうかを調査するようになりました。 今回我々は、宿主のユビキチンリガーゼが同様の分子シグネチャを使用して系統発生的に異なる病原体を感知することを実証する。 共通分子パターン/モチーフ (PAMP) による病原体認識は、自然免疫のよく特徴づけられた特徴です (42)。 我々の結果は、細菌の表面タンパク質内のデグロン様配列がPAMPと同等の方法で作用し、細胞内病原体監視を行っていることを示唆している。 この様式オペランドは、細胞内病原体に対する強力な CD8 応答を誘導するために主要組織適合性複合体 I 上の微生物タンパク質抗原を提示するために宿主によってさらに利用される可能性があります。
宿主防御に対するユビキチン媒介病原体検出の潜在的重要性は、BgaA と PspA の両方を欠く変異型 SPN で検出される実質的な残留ユビキチン化によってさらに強調されます。 これは、ユビキチン機構の未確認の基質がさらに存在し、その結果生じる冗長性が強力な病原体遮断を確実にすることを示しています。 特に、デグロンモチーフと細菌にとってのその重要性（認識可能な単位であること以外）に関するいくつかの当面の疑問は、興味深い進化の角度を提供します。
デグロンモチーフは生体内では不要であり、どちらかといえば、モチーフを変異または欠失させると細胞内の持続性が改善され、その結果毒性が増加しました。 これは、SPN血清型19Fで見られるように、デグロンモチーフの変異が病原体によってユビキチン媒介認識を回避するために利用される可能性があるという我々の結果によって実証されている。 しかし、大部分のSPN血清型にわたってBgaAのデグロンモチーフが保存されている性質は、宿主に対する致死性を下げるために細菌が採用した対抗戦略を示唆している可能性がある。
これは、病原体が占有可能な生息地を増やす機会を与える可能性があります。 同時に、デグロンモチーフでの細菌の表面または分泌タンパク質のユビキチン化は、それらを機能的に調節して、最終的な利益のために宿主の応答を弱めたり、配線し直したりする可能性がある(43)。 したがって、真核生物様の機能ドメインまたはモチーフ（デグロンなど）の有無は病原性ニッチに依存し、宿主の免疫応答を回避または調節するように適応している可能性があります。
グアニル酸結合タンパク質が関与する同様の病原体感知機構も細菌の排除に関与していると考えられています。 しかし、ユビキチン化とは異なり、その役割はグラム陰性病原体に限定されていることが報告されています(44-47)。 ユビキチン化は、グラム起源に関係なく病原体を標的とします。たとえば、RNF213 はリステリア属菌を標的とすることが報告されています。 LPS の不在とは関係ありません (48)。 したがって、我々は、SPN に対する抗菌作用の可能性も排除しません。
病原性表面は、鎖間相互作用を持つ異なる E3 リガーゼによって複数の鎖タイプでユビキチン化されます (41)。 特に、Mtb の場合、Smurf1、および Parkin は、病原体を分解するために相乗的に機能する K48 および K63 鎖タイプを形成することが証明されています (12)。 感染シナリオ中に関与する K48 ユビキチン化と E3 リガーゼの機構的役割の理解はまだ研究が進んでいません。 STm の場合、単一の E3 リガーゼ ARIH1 が、K48 ユビキチン鎖を持つサイトゾル STm を標的にし、システムからユビキチン鎖を除去することが示されています (15)。 私たちや他の研究者の発見に基づくと、K48-Ub で標識された病原体は、プロテアソーム機構と関連しながら最終的に分解されます。
しかし、この研究では、特定の細菌表面タンパク質の K48-Ub 装飾が示されています。 一部の病原体は、表面タンパク質を積極的に修飾してユビキチン化とその後の死滅から保護することが知られており、ユビキチン基質の表面局在化の重要性が強調されています(10)。 さらに、複数の偏性細胞内病原体は、ユビキチン媒介のクリアランスを回避するために、自身または宿主の調節成分を脱ユビキチン化する戦略を進化させてきました(5)。 まとめると、これらの発見は、宿主防御の中心となる基本的な細胞内病原体感知機構としてのユビキチン媒介の警報覚醒の重要性を強調している。
我々の研究はさらに、細菌のユビキチン化による病原体分解の増強における、特にFBXW7とのSCF E3リガーゼの中心的な役割を実証した。 FBXW7 のヘテロ接合変異、特に R505C (基質認識ポケットの重要な残基) 変異体は、ヒトにおける多発性癌およびリンパ性白血病を引き起こします (49, 50)。 最近のコホートベースの研究では、慢性リンパ性白血病 (CLL) 患者のほぼ 43 パーセントが細菌性肺炎と敗血症で死亡し、続いて真菌感染症で死亡することが示されました (51)。
これは、FBXW7 変異を持つ宿主細胞の病原体を感知して排除する能力が無効になっているという我々の観察を裏付けるものである。 したがって、我々の発見は、CLL患者における感染リスクの増大について予期せぬ分子的説明を提供するものである。 E3リガーゼ遺伝子の遺伝的多型と細菌感染に対する感受性との関連性は、腸チフスやハンセン病にかかりやすいパーキンソン病患者によっても実証されており(14)、細菌感染に対する宿主免疫とその維持におけるE3リガーゼの注目すべき寄与を示唆している。細胞の定常状態。
結論として、我々は、宿主が微生物を認識してその後排除するために効率的に適用できる、サイトゾルに生息する病原体を感知するための普遍言語を解読した。 まとめると、これらの発見は、抗菌免疫を強化するために利用できる基本的な細胞免疫プロセスの理解に光を当てます。
材料および方法
細胞培養
ヒト肺胞癌（ＩＩ型肺細胞）細胞株Ａ５４９［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）ｎｏ． CCL185)] と子宮頸部腺癌細胞株 HeLa (ATCC 番号 CRM-CCL-2) を、10% ウシ胎児血清 (Gibco) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; HiMedia) で 37 ℃、5 ℃で培養しました。 CO2 パーセント。
細菌株と増殖条件
SPN (R6、血清型 2、イギリス、バーミンガム大学の Tim J. Mitchell から贈呈) は、1.5 パーセントの酵母エキスを添加した Todd-Hewitt ブロス中で 37 度、5 パーセント CO2 で培養されました。 必要に応じて、次の抗生物質を SPN 培養物の増殖に使用しました: カナマイシン (2{{12}0 μg/ml)、スペクチノマイシン (100 μg/ml)、およびクロラムフェニコール (4.5 μg/ml)。 0.4 OD600 (600 nmでの光学密度) で増殖させたSPN 培養物 900 マイクロリットルを 600 μl の 80 パーセント滅菌グリセロール (最終グリセロール濃度 32 パーセント) と混合し、-80 度のディープフリーザーに保管しました。 これらのグリセロールストックをすべての実験の開始接種材料として使用しました。
大腸菌 DH5 および STm (ATCC 14028) 培養物をルリア ベルターニ ブロス (LB) 中で 37 度、振盪条件 (200 rpm) で増殖させ、必要に応じて以下の抗生物質を使用しました: カナマイシン (50 μg/ml)、スペクチノマイシン(100μg/ml)、クロラムフェニコール(20μg/ml)、およびアンピシリン(100μg/ml)。 すべての感染アッセイでは、細菌を OD600 ~0.4 まで増殖させた後、宿主細胞に感染させる前にリン酸緩衝食塩水 (PBS) に同様の密度まで再懸濁しました。
推定上のユビキチン標的タンパク質のスクリーニング
STm および SPN プロテオームに存在するすべての表面タンパク質は、公開された文献から初めて同定されました。 表面タンパク質の完全なタンパク質配列は UniProt から取得され、デグロン モチーフの存在を確認するために使用されました。 29 個の推定デグロン モチーフのセットが、出版された文献 (24、52、53) および真核生物の線形モチーフ データベースから厳選されました。 Python の正規表現モジュールを使用して、表面タンパク質配列内のこのような厳選されたモチーフすべての位置を特定しました。 線形検索をさらに実行して、特定されたすべてのデグロンモチーフの近く（8～14アミノ酸残基）にリジン残基の存在を特定した。 このリジン残基は、ユビキチン部分の結合部位として機能すると推定されています。 最後に、最終候補に挙げられたタンパク質配列をタンパク質構造予測ツールである IUPred (54) に入力し、デグロン モチーフと近位リジンの間の無秩序な領域の存在を特定しました。 得られたタンパク質 (SPN の場合は BgaA および PspA、STm の場合は RlpA) を、ユビキチン化標的としての評価と、病原体除去におけるそれらの役割の解読のために選択しました。
菌株構築
相同組換えによる対立遺伝子交換は、SPN と STm の両方で変異株を生成するために挿入された抗生物質カセットを保持する遺伝子隣接領域を使用して実行されました (表 S2)。
SPN の場合、bgaA、pspA、およびその遺伝子の 500- bp 上流および下流領域が、適切なプライマー (表 S3) を使用してゲノムから増幅され、pBKS ベクターに組み込まれました。 これらのフラグメントのクローニングに続いて、抗生物質耐性カセット (バッグにはスペクチノマイシン、pspA には pspA、hysA にはクロラムフェニコール) をこの構築物に挿入しました。 次に、コンピテンス刺激ペプチド 1 (GenPro Biotech) を使用して線状化組換えプラスミドを WT SPN に形質転換し、それぞれの抗生物質を使用して組換え体を選択し、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) およびそれぞれの遺伝子座の配列決定によって遺伝子置換を確認しました。 STm の場合、遺伝子欠失変異体の生成には λ-red リコンビナーゼ法が使用されました (55)。
簡単に言うと、ロープ遺伝子の末端に相同な配列が、カナマイシン耐性カセットの増幅に使用されるプライマー配列に付加された。 次に、このカセットを WT STm 株にエレクトロポレーションし、相同組換えによって生成されたノックアウトをカナマイシン耐性に基づいて選択しました。 遺伝子欠失は、PCR および遺伝子座の配列決定を使用して確認されました。 全長 pspA、hysA、および切断型 bgaA-T (1 ～ 3168 bp) をシャトル ベクター pIB166 (56) の P23 プロモーター下でクローン化し、相補に使用しました。
これらの組換えプラスミドは、bgaA-T (bgaA-TK96R、bgaA-TK97R、bgaA-TK96R、K97R、および bgaATΔDegron)、pspA (pspAK314R、pspAK315R、pspAK314R、K315R、および pspAΔDegron) のさまざまな変異体を生成するための部位特異的突然変異誘発にも使用されました。 ）、および彼の（hysADegron-BgaAおよびhysADegron-PspA）を、適切なプライマーセット（表S3）を使用して、ΔbgaAおよびΔpspA変異体に形質転換しました。 すべてのクローンは DNA 配列決定によって検証されました。 BgaA、PspA、および HysA のさまざまな変異体の発現は、適切な抗体を使用したウェスタンブロットによって確認されました。
抗体と試薬
抗エノラーゼおよび抗 PspA 血清 (S. Hammerschmidt、グライフスヴァルト大学、ドイツ); 抗 BgaA 血清 (S. King、オハイオ州立大学、米国); His6 (Invitrogen、MA1-21315)、K48-Ub 結合 (Millipore、05-1307)、K63-Ub 結合 (Millipore、14-6077-80) に特異的な抗体)、Ply (サンタクルーズバイオテクノロジー、サウスカロライナ州-80500)、FBXW7 (ベチルラボラトリーズ、A301-721A)、SKP1 (インビトロジェン、マサチューセッツ州5-15928)、Cullin1 (インビトロジェン、{{15}) })、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ (Millipore、MAB374)、GSK3 [Cell Signaling Technology (CST)、D5C5Z]、ホスホスレオニン (CST、9381S)、IgA、マウス骨髄腫由来のカッパ、クローン TEPC-15 (Sigma-Aldrich、 M1421)、および PSMB7 (Invitrogen、PA5-111404) を調達しました。 次の二次抗体を使用しました: 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) タグ付き抗ウサギ (BioLegend、406401)、HRP タグ付き抗マウス (BioLegend 405306)、抗ウサギ Alexa Fluor 488 (Invitrogen、A27206)、抗ウサギ Alexa Fluor 555 (Invitrogen、A31572)、ビオチン結合抗マウス免疫グロブリン A (Life Technologies、M31115)、抗マウス Alexa Fluor (Invitrogen、A31570)、抗マウス Alexa Fluor 488 (Invitrogen、A21202)、抗ヤギ Alexa Fluor 633 (Invitrogen、A21082)、および FM4-64 (Thermo Fisher Scientific、T13320)。
タンパク質の発現と精製
BgaA-T とその変異体は、Xba I/Not I 制限部位を使用して pET28 にクローン化されました。 N末端Hisタグを有するBgaA-Tをコードする組換えプラスミドを、タンパク質発現のために大腸菌BL21(DE3)細胞に形質転換した。 新たに形質転換したコロニーを、カナマイシン（５｛｛１３｝｝μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ中、３７度、振盪インキュベーター上で１２時間増殖させた。 初代培養液の 1 パーセントを 1 リットルの LB ブロスに加え、OD600nm が 0.6 ～ 0.8 の間に達するまで、シェーカーインキュベーター上で 37 度でインキュベートしました。 タンパク質発現は、100μMイソプロピル- -D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、150rpmで撹拌しながら培養物を37℃で5〜6時間さらに増殖させることによって誘導した。
細胞を、６｛５｝００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。 細胞ペレットを緩衝液Ａ［２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）および３００ｍＭ ＮａＣｌ］に再懸濁し、超音波処理により溶解した。 細胞破片を遠心分離（14、000 rpm、50分間、4度）によって分離し、上清を緩衝液Aで平衡化したNi-NTAカラムにアプライした。カラムを10カラム容量の緩衝液で洗浄した。 BgaA-T のすべての変異体は、同じ手順を使用して発現および精製されました。 FBXW7 は、Eco RI 制限酵素を使用して、pCMV6-Entry-FBXW7 ベクターから N 末端グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) タグを有する pGEX-4 T-1 ベクターにサブクローニングされました。
GSTタグ付きFBXW7を、0.1 mM IPTGによるタンパク質発現の誘導および30度で4時間増殖させた後、大腸菌BL21(DE3)細胞で発現させた。 大腸菌粗抽出物からのGST-FBXW7を、グルタチオン-セファロース(GE HealthCare)カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。 精製タンパク質を含む画分をプールし、｛｛１３｝ｋＤａ分子量カットオフフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用し、４℃、４７００ｒｐｍでの遠心分離により０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。 タンパク質の純度は、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で確認し、その後クマシー ブルーで染色しました。
宿主細胞のトランスフェクション
BgaA-Tは、インフュージョンクローニングキット（Takara）を使用して、ドキシサイクリン誘導性ベクターpAK_Tol2_TRE_Blast（Addgene no. 130261）にクローニングされました。 サンガー配列決定により陽性クローンが確認された。 FBXW7R505C 変異は、pMRX-GFP-FBXW7 を鋳型として使用する部位特異的変異誘発によって実行され、サンガー配列決定によって確認されました。 すべてのトランスフェクションはリポフェクタミン 3000 試薬 (Thermo Fisher Scientific) を使用して実行し、選択は塩酸ブラストサイジン (2 ug/ml; HiMedia) の存在下で実行しました。
siRNA による遺伝子ノックダウン
特定の遺伝子の RNA 干渉媒介ノックダウンには、次の siRNA を使用しました: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005)、siCullin1 (Qiagen、1027423)、siSKP1 (Qiagen、SI00301819)、および siGSK3 (Dharmacon ONTARGET) SMARTpool L-003010-00-0005)。 簡単に説明すると、24- ウェル プレートで増殖させた A549 細胞に、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン 3000 を使用して遺伝子特異的 siRNA またはスクランブル (siControl) (150 pmol) を一時的にトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 36 時間後、細胞をウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光またはペニシリン - ゲンタマイシン保護アッセイのために処理しました。
構造予測とモデリング
すべての構造は、AlphaFold (タンパク質相同性/類似性認識エンジン V 2.0) (57) によって予測され、PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System、バージョン 2.0 Schrödinger, LLC) を使用して視覚化されました。 構造は、規則的 (青) から無秩序 (赤) を経て白までの範囲の IUPred (54) スコアに基づいて PyMol で色分けされました。
ウェスタンブロッティング
{{0}}.4 OD600nm まで増殖させた SPN 培養物を超音波処理によって溶解し、遠心分離 (15,000 rpm、30 分、4 度) 後に粗抽出物を収集しました。 A549 の場合、単層を PBS で数回洗浄し、氷冷したラジオ免疫沈降アッセイ (RIPA) バッファー [50 mM トリス-Cl (pH 7.89)、150 mM NaCl、1 パーセントの Triton X-100、0.5 パーセントのナトリウム] で溶解しました。デオキシコール酸、および 1 パーセント SDS] プロテアーゼ阻害剤カクテル (Promega)、フッ化ナトリウム (10 mM)、および EDTA (5 mM) を含む。 細胞懸濁液を短時間超音波処理し、遠心分離して細胞溶解物を収集しました。 細菌または A549 細胞溶解物 (10 または 20 μg) に存在するタンパク質を 12 パーセント SDS-PAGE ゲルで分離し、活性化ポリ二フッ化ビニリデン膜に転写しました。 5%のスキムミルクでブロッキングした後、膜を適切な一次抗体およびHRPタグ付き二次抗体でプローブしました。 最後に、増強された化学発光基質 (Bio-Rad) を使用してブロットを展開しました。
ペニシリン-ゲンタマイシン保護アッセイ
0.2パーセントの酵母エキス（THY）を添加したTodd-Hewittブロス中でOD600nm 0.4まで増殖させたSPN株をペレット化し、PBSに再懸濁しました（ ｐＨ７．４）を用いて、感染多重度（ＭＯＩ）１０でＡ５４９単層を感染させるためのアッセイ培地で希釈した。感染の１時間後、単層をＤＭＥＭで洗浄し、ペニシリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むアッセイ培地とともにインキュベートした。 ）およびゲンタマイシン（400 ug/ml）を 2 時間処理して細胞外 SPN を死滅させます。 次に、細胞を 0.025 パーセントの Triton X-100 で溶解し、溶解物を Brain Heart Infusion 寒天プレートにプレーティングして、生存可能な SPN を数えました。 浸潤率は、[ライセート中のコロニー形成単位 (CFU) / 感染に使用した CFU] × 100 として計算しました。 感染後 9 時間 (ペニシリン - ゲンタマイシン処理の開始から) の細胞内生存を評価するために、細胞ライセートを次のように調製しました。上で述べたように、播種された細菌と生存細菌が数えられました。 生存効率（パーセント）は、示された時点（０時間に正規化）における対照と比較した生存パーセントの変化倍数として表した。
免疫蛍光
免疫蛍光アッセイでは、A549 または HeLa 細胞をカバーガラス上で増殖させ、MOI ~25 で SPN または STm 株に 1 時間感染させ、その後 2 時間抗生物質で処理しました。 感染後の所望の時点(A549sにおけるSPN感染の場合は9時間、HeLaにおけるSTmによる感染の場合は3時間)で、細胞をDMEMで洗浄し、-20度の氷冷メタノールで10分間固定した。 さらに、カバースリップを、室温 (RT) で 2 時間、PBS 中の 3% ウシ血清アルブミン (BSA) でブロックしました。 次いで細胞を、ＰＢＳ中の１パーセントＢＳＡ中の適切な一次抗体で４℃で一晩処理し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１パーセントＢＳＡ中の適切な二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。 最後に、カバースリップを PBS で洗浄し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (Vector Laboratories) の有無にかかわらず VECTASHIELD とともにスライドガラスにマウントし、レーザー走査型共焦点顕微鏡 (LSM 780、Carl Zeiss) を使用して視覚化しました。 ) 40 倍または 63 倍の石油対物レンズ未満。 画像は光学的切断後に取得され、ZEN lite ソフトウェア (バージョン 5.0) を使用して処理されました。 超解像顕微鏡法は、Elyra 7 (Carl Zeiss) を SIM モードで使用して同様に実行されました。 共局在分析では、反復ごとに n > 100 個の細菌を視覚的に計数することによって細菌をスコア化しました。
透過電子顕微鏡法
SPN および STm による感染後、細胞を {{0}}.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中の 2.5% グルタルアルデヒド (Sigma-Aldrich) で固定しました。 Sigma-Aldrich) 4 度で 3 時間。 固定後、細胞をセルスクレーパーで収集し、2{15}00 rpmで10分間ペレット化しました。 次いで細胞を０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の１パーセント四酸化オスミウムで４℃で２０分間後固定した。 その後、カコジル酸緩衝液と蒸留水で洗浄した後、細胞をエタノール濃度（50、70、95、100パーセント）とプロピレンオキシドの濃度を増加させながら30分間脱水し、最後にエポキシ樹脂（電子顕微鏡科学、14300）に包埋しました。 75度で45分間重合。 続いて、カプセルを95度のオーブンに45分間移した。 Leica EM UC7 ウルトラミクロトームでダイヤモンド ナイフを使用して極薄切片 (70 nm) を切断し、2% 酢酸ウラニルおよび 1% クエン酸鉛で染色し、120 KV の透過型電子顕微鏡 (Talos L120 C、Thermo Fisher Scientific) を使用して観察しました。
生体外のユビキチン化
BgaA-T およびその変異体を発現する A549- を MG132 (5 μM) で処理し、ドキシサイクリン (100 ug/ml) で 24 時間タンパク質発現を誘導しました。 次に細胞をRIPAバッファーで溶解し、サンプルをSDS-PAGEで電気泳動しました（8パーセント）。 BgaA-T とその変異体のタンパク質発現とユビキチン化の確認は、それぞれ抗 BgaA 抗体と抗 K48- Ub 抗体でプローブした後のウェスタンブロットによって証明されました。
インビトロユビキチン化
in vitro ユビキチン化アッセイでは、以前に記載されているように組換えタンパク質を精製しました (58)。 SCFFBW7 E3 リガーゼ複合体を、組換え 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem)、0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem)、およびユビキチン (2.5 ug/ml; Boston Biochem) とインキュベートしました。 Biochem)、精製 BgaA-T およびその変異体の存在下で。 ユビキチン化反応は、アッセイバッファー [50 mM トリス (pH 8)、5 mM MgCl2、5 mM アデノシン三リン酸 (ATP)、1 mM -メルカプトエタノール、および 0.1 パーセント Tween 20] 中で 25 度で 2 時間実行されました。 。 反応を5×Laemmli緩衝液で停止し、SDS-PAGEゲルで分離し、抗BgaA抗体を使用する免疫ブロッティングによって分析した。
インビトロキナーゼアッセイ
インビトロキナーゼアッセイを実施するために、ＧＳＫ３キナーゼ酵素システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコールに従って以下の変更を加えて使用した。 簡単に説明すると、3μgの組換えBgaA-Tを、40mMトリス(pH7.5)、20mM MgCl2からなる反応緩衝液中の400μM ATPを含む活性型GSK3 0.5μgに添加した。 、BSA (0.1 mg/ml)、および 50 μM ジチオスレイトール。 反応を30度で2時間インキュベートし、1×Laemmli緩衝液を添加することによって停止させた。 次に、サンプルを煮沸し、前述したようにウェスタンブロッティングのために電気泳動しました。 リン酸化された BgaA-T は抗ホスホスレオニン抗体で検出されました。
生体内モデル
All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >開始時の体重が 20% で、顕著な鼻汁または眼汁が見られます。 終末麻酔下で心臓穿刺により血液サンプルを採取し、細菌の計数のために死後脾臓を切除した。 組織サンプルは手持ち式組織ホモジナイザーで処理され、ホモジェネートは血液寒天プレートにスポットする前に PBS で段階的に希釈されました。 プレートを37℃、5パーセントCO2で一晩インキュベートし、翌日細菌コロニー数を評価した。
統計分析
統計分析には GraphPad Prism バージョン 5 を使用しました。 個々の実験に対して行われた統計的テストは、それぞれの図の凡例に記載されています。 P < 0.05 は統計的に有意であると考えられました。 データは正規性についてテストされ、テストされた各グループの分散が定義されました。 すべてのマルチパラメーター分析には多重比較の補正が含まれており、特に明記しない限り、データは平均値 ± SD として表示されます。
参考文献とメモ
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