mRNAワクチンはSTING依存性の抗腫瘍免疫応答を誘発する
Dec 07, 2023
抽象的な
脂質配合 RNA ワクチンは疾患の予防と治療に広く使用されていますが、その作用機序やそのような作用に寄与する個々の成分はまだ解明されていません。 今回我々は、プロタミン/mRNAコアと脂質シェルで構成されるがん治療用ワクチンが、細胞傷害性CD8+T細胞応答の促進と抗腫瘍免疫の媒介において非常に強力であることを示す。 機構的には、樹状細胞における I 型インターフェロンと炎症性サイトカインの発現を完全に刺激するには、mRNA コアと脂質シェルの両方が必要です。 インターフェロン b 発現の刺激はもっぱら STING に依存しており、Sting 遺伝子に欠陥があるマウスでは mRNA ワクチンによる抗腫瘍活性が著しく低下します。 したがって、mRNA ワクチンは STING 依存性の抗腫瘍免疫を誘発します。
男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点
1. はじめに
SARS-CoV-2 感染予防のための mRNA ワクチンの急速な開発と世界的な応用により、医療における mRNA ベースの薬剤の力が証明されました 1,2。 mRNA 分子は分子量が大きく負電荷であるため、哺乳動物細胞に効果的に侵入するには送達ビヒクルにパッケージングする必要があります。 ナノメートルサイズの送達媒体へのパッケージングには、mRNA 分子を酵素分解から保護するという利点もあります。 脂質ナノ粒子4、リポポリプレックス（LPP）5、リポソームプロタミン-RNA（LPR）6、RNAリポプレックス（RNA-LPX）7、ウイルス様ワクチン粒子（VLVP）など、目的に応じて複数の送達プラットフォームが開発されています。 )8. 各プラットフォームには独自の構造と組成がありますが、ほとんどのビヒクルには、mRNA のパッケージングとエンドソームからの mRNA 分子の脱出を促進するイオン性脂質分子が含まれています。 予防ワクチンの成功により、mRNA 治療薬がおそらくすべてではないにしてもほとんどの疾患タイプの治療に使用できるという一般的な認識が得られています9e12。 実際、mRNA ベースの治療用がんワクチンは長年研究されてきました 13,14。 最近の臨床試験の進歩により、特定のがん患者への応用の可能性も実証されています 15e17。 アジュバント分子を用いて調製されるペプチドがんワクチン18e20とは異なり、mRNAワクチン粒子は自己アジュバントとしても機能します21。
たとえば、遊離 mRNA とプロタミン複合体 mRNA を含む 2 成分 mRNA ベースのがんワクチンも、Toll 様受容体 7 (TLR7) シグナル伝達を活性化できます 22。 しかし、裸の mRNA による急性自然免疫毒性に対する懸念が高まる中、ほとんどの研究者や企業は、TLR による自然認識を避けるために修飾 RNA を使用しています 23。 したがって、脂質成分は、非TLRシグナル伝達を優先的に活性化することにより、mRNAワクチン粒子のアジュバント活性を増強する上で重要な役割を果たしている。 1,2- ジオクタデセニル-3-トリメチルアンモニウム (DOTMA、カチオン性脂質)/ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE、ヘルパー脂質) リポソームで構成される、脂質配合の負に荷電した RNA-LPX に関する最近の研究で、炎症誘発性サイトカインの分泌調節におけるインターロイキン 1 (IL1)-インターロイキン 1 受容体アンタゴニスト (IL-1ra) 軸の活性化、および単球における 2 段階のインフラマソーム経路の活性化の重要な役割。 興味深いことに、ALC-0315（イオン化脂質）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC、ヘルパー脂質）を使用して調製されたLNPベースのBNT162b2に関する別の最近の研究が行われました。 、ポリエチレングリコール-2000-N,N-ジテトラデシルアセトアミド（PEG2000-DTA）、およびコレステロールは、I型インターフェロン依存性MDA5シグナル伝達の活性化に重要な役割を果たしているが、TLRやインフラマソームの活性化には重要な役割を果たしていないことが示された。新型コロナウイルス-19ワクチンの自然免疫および適応免疫25. これらの研究は、可変脂質分子で構成される送達プラットフォームがワクチン活性のために異なるシグナル伝達経路に依存している可能性を指摘している。 したがって、mRNA治療法をさらに改善するには、主要な分子の機能とその組み合わせを十分に研究することが重要です。
現在の研究では、がん治療ワクチンにおける個々の成分の機能的役割を詳しく調べる実験を開始しました。 mRNAワクチン粒子（MVP）は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、ペグ化脂質、コレステロールからなる脂質シェルにカプセル化されたプロタミン/mRNAコアで構成されています（図1A）。 荷電脂質を含めると標的 RNA 送達が促進されることが実証されており 26、ジオレオイルエチル ホスファチジルコリン (EDOPC) とジオレオイル-3- トリメチルアンモニウム プロパン (DOTAP) は、この目的で試験されたカチオン性脂質の 2 つです 5,27。 私たちは、mRNA コア、mRNA フリー ビヒクル、および MVP 全体によるインターフェロン b (IFN-b)、IL{7}} b、および腫瘍壊死因子 a (TNF-a) の発現の刺激を調べました。らは、このような活性を、TLR7、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達 (MAVS、IPS-1 としても知られる)、IFN 遺伝子の刺激因子 (STING)、および IFN-b シグナル伝達を誘導する TIR ドメイン含有アダプター (TRIF) と相関させました。 続いて、我々は、IFN-b および TNF-a の発現の刺激におけるコア内のプロタミンとシェル内のカチオン性脂質の役割を調査しました。 最後に、野生型マウスと遺伝子ノックアウトマウスにおける MVP からの抗腫瘍免疫応答を比較しました。
カンクサの利点 - 抗腫瘍
2。材料と方法
2.1. 材料
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン (EDOPC) (890704)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジル-エタノールアミン (DOPE) (850725) ), 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン (DOTAP) (890890)、1,2- ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DOPC) (850375) は、Avanti Polar Lipids, Inc. から購入しました。米国アラバマ州バーミンガム）。 コレステロール (C8667) は Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から入手しました。 試薬は、DSPE-PEG2k については 2 mg/mL、コレステロールおよび DOPC については 10 mg/mL、EDOPC、DOPE、および DOTAP についてはそれぞれ 20 mg/mL の濃度でエタノールに溶解しました。 硫酸プロタミン (P4020) は Sigma Aldrich から入手しました。 オボアルブミン (OVA-mRNA) (L-7210)、eGFP (eGFP mRNA) (L-7201)、およびルシフェラーゼ (Luc-mRNA) (L-7204) をコードする mRNA 分子は、以下から購入しました。 TriLink Biotechnologies (米国カリフォルニア州サンディエゴ)。 RNase フリー水 (W0805-010) は GeneDEPOT (Baker, TX, USA) から入手しました。 TLR7 アゴニストのイミキモド (tlrimq) およびスティング アゴニストの 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) は、Invivogen (米国カリフォルニア州サンディエゴ) の製品でした。 リポフェクタミン 2000 (11668019) および Quant-iT™ RiboGreen™ RNA アッセイ キット (R11490) は、Thermo Fisher Scientific (米国マサチューセッツ州ウォルサム) から購入しました。 組換えマウス GM-CSF (554586) は BD Biosciences (米国カリフォルニア州サンディエゴ) から購入しました。 500 タンパク質トランスポーター阻害剤カクテル (00-4980-93) は Invitrogen の製品でした。 Cytofix/Cytoperm キット (AB_2869010) は BD Biosciences から購入しました。 EasySep™ マウス T 細胞分離キット (19851) は、STEMCELL Technologies, Inc. (バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ) から入手しました。 以下の抗体は BioLegend (米国カリフォルニア州サンディエゴ) から入手しました: 抗 CD80-PE-Cy7 (104734)、抗 CD86-FITC (105006)、抗 CD11b-APC- Cy7 (101226)、抗 CD8-BV510 (100752)、抗 CD44-APC (103012)、抗 CD69-APC (104514) および抗 H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604)、抗 CD64- PE-Cy7 (139314)、抗 B220-APC (103212)、抗 MHCII-BV711 (107643)、およびアンチ CD{105}}PE（121406）。 抗 CD{108}}FITC (553723)、抗 LY6C-AF700 (557979)、および抗 IFN-g-PE (554412) は BD Biosciences から入手しました。 OVA257e264-MHCI デキストラマー PE (JD2163) は ImmuDex (米国バージニア州フェアファックス) から購入しました。 IL-1b (EM2IL1B) および TNF-a (BMS607-3) の ELISA キットは Invitrogen から購入し、CCL5 (DY478) および IFN-b (DY8234) の ELISA キットは R&D Systems から入手しました。 、Ｉｎｃ．（米国ミネソタ州ミネアポリス）。 抗 MAVS (4983)、抗 STING (13647)、抗 TBK1 (3504)、抗ホスホ TBK1 (5483)、抗 b-アクチン (4970)、抗 GAPDH (5174) を含むウェスタンブロット分析用抗体Cell Signaling Technology, Inc. (米国マサチューセッツ州ダンバーズ) から購入しました。
図 1 mRNA 粒子の調製と特性評価。 (A) ワクチン粒子調製の概略図。 (B) アガロースゲル電気泳動は、mRNA 分子が 1:1 ～ 1:2 の比率の mRNA/プロタミンで調製されたサンプルのサンプルローディングウェルに保持されていることを示します。 (CeF) カプセル化の割合、多分散指数、ゼータ電位、およびサイズに基づく mRNA ワクチン粒子 (MVP) の特性評価。 (G) MVP2 粒子の代表的な TEM 画像、スケールバー Z 50 nm。 (H) DC2.4 細胞を eGFP-MVP で 16 時間処理した後の eGFP 発現のパーセンテージ。 (I) eGFP 発現 DC2.4 細胞の蛍光イメージング、スケール バー Z 400 mm。 (J) ルシフェラーゼをコードする mRNA をカプセル化した MVP で 16 時間処理した BMDC における生物発光の定量分析。 (K) PBS、mRNAを含まないビヒクル、mRNA/プロタミンコア、またはmRNAカプセル化MVP2で処理したBMDCの生存率の変化。 処理濃度は mRNA と同等でした。 データは平均 SEM (n Z 3) として表示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01。
2.2. 細胞株と細胞培養
DC2.4 マウス樹状細胞株は ATCC (米国バージニア州マナッサス) から入手し、10% ウシ胎児血清 (FBS) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む RPMI-1640 中で培養しました。 マウス黒色腫細胞株 B16-OVA は、ダナファーバー癌研究所 (米国マサチューセッツ州ボストン) の Kenneth Rock 博士から入手しました。 B16-OVA 細胞は、10% FBS および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した DMEM 中で培養されました。 マウス結腸腺癌細胞株 MC38 は ATCC から購入しました。 細胞は OVA 発現で操作され、10% FBS および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む DMEM で培養されました。 細胞培養は 37℃、5% CO2 で維持されました。
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2.3. mRNAワクチン粒子の調製
すべての mRNA ワクチン粒子は、Precision Nanosystems, Inc. (バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ) の NanoAssemblr Benchtop マイクロ流体機器を使用して、有機相と水相を混合することによって調製されました。 有機相を調製するために、EDOPC (20 mg/mL)、DOPE (20 mg/mL)、コレステロール (10 mg/mL)、および bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) をエタノールに溶解し、34 ℃で混合しました。流速9 mL/minでM比:30:35:1。 水相 mRNA コアを調製するために、mRNA を硫酸プロタミンと 1:1 (w/w) でマイクロ流体機器内で 9 mL/分の流速で混合しました。 20℃で20分間インキュベートした後、水相mRNAコアを有機相と混合して、mRNAワクチン粒子を生成した。 20分後、ワクチン粒子懸濁液をAmicon超遠心フィルター（MWCO 30 kDa）に移し、9-体積の分子グレード水を加えてエタノール濃度を25%から2.5%に希釈しました。 次いで、粒子懸濁液を、４℃、２０００ｇでの遠心分離（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）によって濃縮した。濃縮生成物に等量の２ＰＢＳを添加して、浸透圧を調整した。
2.4. ゲル遅延アッセイ
mRNA/プロタミンコアは、最初にゲル遅延によって分析されました。 簡単に説明すると、0.5 mg の mRNA を含む mRNA/プロタミン コアを 1 TBE 溶液中の 1% アガロースゲルのウェルにロードし、電気泳動を 120 V で 30 分間実行しました (PowerPac™、BioRad Co.、 Ltd.、カリフォルニア州ヘラクレス）。 RNA バンドを Gelred (Biotium、Hayward、CA) で染色し、GelDoc システム (Gel Doc XRþ、BioRad Co., Ltd.) で検出しました。
2.5. mRNAワクチン粒子の特性評価
サイズ分布とゼータ電位は、動的光散乱 Zetasizer (Zetasizer Nano、Malvern Pananalytical, Inc.、米国マサチューセッツ州ウェストボロー) で測定しました。 カプセル化率は、Quant-iT™ RiboGreen™ RNA アッセイ キットを使用して測定しました。 簡単に説明すると、0.5 mg の mRNA を含むワクチン粒子サンプルを、{ {10}}ウェルプレート。 37℃で10分間インキュベートした後、RiboGreenを各ウェルに添加し、蛍光強度を測定した。 カプセル化効率は式1に示すように計算されました。 (1): ワクチン粒子の透過型電子顕微鏡 (TEM) は、前述の手順に従って実行されました 9。
2.6. 動物
すべての動物の手術は、ヒューストン メソジスト病院の動物管理使用委員会によって承認されました (プロトコル番号 AUP06200042)。 マウスは、国立衛生研究所の規制基準および米国実験動物管理協会の基準を完全に満たす環境で飼育されました。 野生型 C57BL/6J マウス、および Tlr7/、Sting/、Mavs/、および Trif/ マウスを含む遺伝子操作マウスは、Jackson Laboratory から購入しました。
2.7. マウス骨髄由来樹状細胞 (BMDC) の生成
完全な RPMI 1640 を使用して、大腿骨および脛骨から骨髄細胞を洗い流しました。赤血球を ACK 溶解バッファーで溶解し、未成熟骨髄細胞を 20 ng/mL の組換えマウス GM-CSF を添加した RPMI 1640 で 10 分間培養しました。 37℃、5% CO2 で数日間。 細胞培養培地は 3、6、8 日目に更新され、非接着樹状細胞は 10 日目に収集されました。
2.8. サイトカインおよびケモカインの測定
BMDC を 24- ウェルプレートに 5 105 細胞/ウェルの密度で播種しました。 1時間の定着後、細胞を1 mg/mLイミキモド、20 mg/mL 20 30 -cGAMP、(1 mg/mL mRNA相当)ワクチン粒子またはコントロールで処理しました。 24 時間後に細胞培養培地を収集し、製造業者が推奨する手順に従って酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) キットを使用して、TNF-α、CCL5、IFN-b、および IL-1b のレベルを測定しました。
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2.9. DCトランスフェクション、DC成熟、および刺激に関する分析
インビトロでのDCトランスフェクション効率を分析するために、DC2.4細胞を24-ウェルプレートに2.5 105細胞/ウェルで播種しました。 細胞を、最終濃度 1 mg mRNA/mL の eGFP またはルシフェラーゼをコードする mRNA カプセル化粒子で処理しました。 24 時間後に細胞を回収し、2% FBS を含む PBS 溶液で洗浄し、同じ溶液に再懸濁してから、BD LSR II フローサイトメーター (LSR II、BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ) によるフローサイトメトリー分析に適用しました。 。 in vitroでDCの成熟と抗原提示を測定するために、BMDCを24-ウェルプレートに2.5 105細胞/ウェルで播種し、1 mg/mL OVA-MVPで24時間処理しました。 BMDCは、DC成熟のためにCD11c、MHC I、MHC II、CD40、CD80、およびCD86に特異的な抗体、および抗原提示のために抗H-2Kb（SIINFEKL）で30分間染色されました。 インビボでの刺激効力を決定するために、C57BL/6J マウスの足蹠に 1 匹あたり 10 mg の OVA-MVP を 1 回ワクチン接種し、24、48 および以下の細胞表面マーカー: CD11c、MHC I、CD11b、B220 で排出する膝窩 LN を採取しました。 、LY6C、CD64、CD8、CD103、CD86。
2.10. T細胞の活性化と増殖に関するフローサイトメトリー分析
インビボでの T 細胞活性化を測定するために、マウスに 10 mg の OVA-MVP を 1 回ワクチン接種し、24 または 48 時間後に膝窩 LN を単離しました。 T 細胞は次の抗体で染色されました: CD45、CD3、CD4、CD8、および CD69。 抗原特異的 T 細胞を検出するために、2 回目のワクチン接種の 5 日後に腫瘍、脾臓、膝窩リンパ節を採取しました。 組織を処理して単一細胞懸濁液を生成し、メーカーの指示に従って細胞を T 細胞特異的抗体と OVA257e264-MHCI デキストラマーで染色しました。 細胞内 IFN-g レベルを測定するために、2 106 脾細胞または膝窩 LN および腫瘍から単離した細胞を、55 mmol/L b-メルカプトエタノールおよび 1 種類のタンパク質トランスポーター阻害剤を添加した完全 RPMI 1640 培地中の 10 mg/mL OVA257e264 ペプチドで刺激しました。 18時間のカクテル。 細胞を採取し、T 細胞特異的抗体で染色しました。 Cytofix/Cytoperm キットで固定および透過処理した後、細胞を抗 IFN-g 抗体で染色し、BD LSR II フローサイトメーター (BD Biosciences) での分析に適用しました。 T 細胞の増殖を測定するために、マウス T 細胞単離キットを使用して OT-I トランスジェニック マウスの脾臓から T 細胞を単離しました。 それらを、200 mg/mL BSAを含むRPMI 1640中の1 mmol/L CFSEで37℃で10分間染色しました。CFSE標識T細胞を5倍量の冷却した完全RPMI 1640で2回洗浄しました。その間、成熟BMDCをT 細胞単離前の 24 時間の 2 mg/mL OVA mRNA カプセル化 MVP。 T 細胞の準備ができたら、BMDC と T 細胞を 1:5 (DC:T) の比率で 72 時間共培養しました。 細胞を収集し、T 細胞の表面抗体で染色し、BD LSR II フローサイトメーター (BD Biosciences) を使用して増殖をテストし、分析しました。 すべてのフローサイトメトリーの結果は、FlowJo v10 ソフトウェア (米国オハイオ州アシュランド) で分析されました。
2.11. 生きたマウスにおけるタンパク質発現の追跡
BALB/c マウスは、10 mg の Luc mRNA カプセル化 MVP の足蹠内注射によって治療されました。 6、12、24、または48時間後にマウス1匹あたり30 mgのRediJect D-ルシフェリンを腹腔内注射し、Xenogen IVIS-200イメージングシステム（Caliper Life Sciences, Inc.、ホプキントン、カリフォルニア州）で生物発光を測定しました。米国マサチューセッツ州）。
2.12. ELISpot アッセイ
IPフィルタープレートを50 mLの35%エタノールで事前にリンスし、エタノールが蒸発する前にPBSで3回徹底的に洗浄しました。 続いて、プレートを抗IFN-g捕捉抗体で4℃で一晩コーティングした。 プレートを、55 mmol/L b-メルカプトエタノールを含むRPMI 1640完全培地で37℃で2時間ブロックしました。細胞（1 105脾細胞、膝窩LN由来の1 105細胞）を各ウェルに播種し、 10 mg/mL OVA257e264 ペプチドで 36 時間刺激しました。 培地を廃棄し、細胞をＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で４回、ＰＢＳで２回洗浄した。 最後の洗浄後、抗 IFN-g 検出抗体を添加し、暗所、室温で 2 時間インキュベートしました。 プレートをPBSTで4回、PBSで2回洗浄し、アビジン-HRPを添加し、暗所、室温でさらに45分間インキュベートした。 最後に、プレートを上記のように再度ＰＢＳＴおよびＰＢＳで洗浄し、５０ｍＬのＡＥＣ基質を適用してスポット反応を観察した。 スポットが見えるようになったら、AEC 基質を廃棄し、再蒸留水で 5 回洗い流すことによって反応を停止しました。 一晩風乾した後、CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038、CTL Inc.、米国オハイオ州クリーブランド) を使用してプレートをスキャンし分析しました。
2.13. ウェスタンブロット分析
野生型、Mavs KO または Sting KO マウス由来の BMDC を収集し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充した RIPA 細胞溶解バッファーで細胞を溶解しました。 細胞溶解物中のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキットを使用して測定しました。 タンパク質サンプルをドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で分離し、ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写しました。 MAVS および STING の発現は、膜を 1:2000 希釈の抗 MAVS または抗 STING 抗体とインキュベートした後、SuperSignal West Pico および Femto Chemiluminescent Substrate で免疫検出した後に検出されました。 STING 経路の活性化を測定するために、野生型マウス由来の BMDC を、示された濃度のビヒクルまたは OVA mRNA カプセル化 MVP で 2 時間処理しました。 細胞を溶解し、1:2000希釈の抗TBK1抗体および抗ホスホTBK1抗体を用いたウェスタンブロット分析に進めた。
2.14。 抗腫瘍アッセイ
マウス腫瘍モデルは、マウスあたり 2 105 細胞 B16- OVA 黒色腫細胞または 5 105 MC38- OVA 細胞を 6 ～ {{5} の左脇腹に皮下接種することによって作成されました。 }生後1週間の雌C57BL/6Jマウス。 マウスを無作為に治療群に割り当て、足蹠に１０ｍｇのＯＶＡ ＭＶＰまたは対照を７日おきに２回治療した。 腫瘍の増殖を 2 日ごとに監視しました。 腫瘍体積は式に従って計算されました。 (2):
2回目のワクチン接種から5日後にマウスを安楽死させ、腫瘍組織の重量を記録した。
2.15。 統計分析
すべての結果は平均値の SEM として表示されます。 統計は、複数グループの比較にはテューキー補正を使用した一元配置分散分析検定、および 2 グループの比較には対応のない両側 t 検定を使用して評価されました。 データはGraphPad Prism v8.0.2ソフトウェアで分析されました。 P < 0.{{10}}5 は統計的に有意であるとみなされます (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001)。
3. 結果
3.1. MVP は樹状細胞 (DC) における強力な mRNA 発現を仲介します
我々は、2段階のマイクロ流体アプローチでコアシェルワクチン粒子を調製し（図1A）、ナノ粒子内の個々の成分を体系的に評価して、DCでの高い安定性、高い細胞取り込み、および高い発現能を備えたワクチン粒子を組み立てました。 ゲル電気泳動により、mRNA対プロタミンの比率が1以下になると安定したmRNAコアが形成できることが明らかになりました（図1B）。 eGFP をコードする mRNA を代理マーカーとして使用したところ、34% EDOPC/30% DOPE/35% コレステロール/1% DSPEPEG2k のモル比の脂質組成が理想的なカプセル化率と最高の発現効率を提供することがわかりました (表 1、サポート情報 図 S1AeS1D)。 電荷比を変更しても、カプセル化率、多分散指数、または粒子の表面電荷は大きく変化しませんでした（表 2、図 1CeE）。 ただし、比率が 12 ～ 16 の場合、得られる粒子のサイズは直径 70 ～ 80 nm であったのに対し、比率が範囲外になると直径は 120 ～ 130 nm でした (図 1F および G)。 最良の発現は、電荷比12を有するMVP2で処理したDC2.4細胞で検出された(図1HおよびI)。 ルシフェラーゼをコードする mRNA を用いて粒子を調製した場合にも同様のパターンが観察され、用量依存的な発現が検出されました (図 1J)。 mRNA カプセル化粒子は、凍結乾燥または凍結融解後も活性を失わなかったため、望ましい安定性を示しました (図 S1E および S1F)。 さらに、骨髄由来樹状細胞（BMDC）をmRNAコアのみ、mRNA分子を含まずに調製したビヒクル粒子、またはmRNAを含むMVP2で処理した後、細胞毒性はありませんでした（図1K）。 したがって、MVP2 は最高の発現可能性を示しました。 これは研究におけるその後のすべての実験に使用され、本文の残りの部分では MVP としてラベル付けされています。 MVP 粒子は in vivo で mRNA 分子を効果的に送達することができ、体重変化に基づいて mRNA カプセル化 MVP から検出可能な毒性はありませんでした (図 S1GeS1I)。
3.2. MVP は、in vitro および in vivo で抗原提示と T 細胞活性化を効果的に誘導します
mRNAコア、mRNAフリービヒクル、およびOVA mRNAカプセル化MVPを調製し、それらをDCの成熟と抗原提示のテストに適用しました（図2A）。 MVPで処理されたBMDCは、CD40、CD80、およびCD86を含むDC成熟マーカーの用量依存的な過剰発現を示した(図2BeD)。 mRNAを含まないビヒクルまたはmRNAカプセル化MVPのいずれかによる処理はMHC I過剰発現を引き起こし(図2E)、この効果はmRNA複合体ではなくビヒクルに関連していることを示している。 さらに、MVP処理により、抗SIINFEKL-MHCI抗体で検出されたOVA257e264抗原エピトープ-MHC I複合体（SIINFEKL-MHC I）が細胞表面に提示され（図2F）、BMDCによる効果的な抗原プロセシングと提示が実証されました。 。 さらに、MVP 処理 BMDC と、OVA257e264 エピトープを特異的に認識する CD8þ T 細胞株である B3Z、または OVA257e264- 特異的 T 細胞を発現する OT-I マウスの脾臓から単離された T 細胞との共インキュベーションこの結果は、ビヒクル単独またはmRNA/プロタミンコア単独で処理したDCと同時インキュベートしたT細胞では観察されませんでした(図2G)。 フローサイトメトリー分析により、MVP との共インキュベーション後に 32.5% の増殖性 CD8+ T 細胞が検出されました (図 2H および I)。 OVA mRNA カプセル化 MVP 粒子も、皮内注射によってマウスを治療するために適用されました。 流入リンパ節の細胞を検査すると、最初の 48 時間で古典的 DC (CD8þ DC、CD11bþ DC、CD103þ DC) と形質細胞様 DC (pDC) の両方で CD86 発現の着実な増加が明らかになり、DC の刺激が示されました。成熟（図２Ｊ）。 治療によりリンパ節における CD8+ T 細胞の濃縮も促進され、CD69+CD8+ T 細胞の集団が大幅に増加しました (図 2K および L)。これは、治療による T 細胞の活性化を示しています。 T 細胞の活性化を測定するために、MVP 処理の 3、5、または 7 日後に流入リンパ節で細胞を収集し、細胞を OVA257e264 抗原ペプチドで攻撃した後、ELISpot 分析を実行しました (裏付け情報図 S2)。 MVP 治療は、その間に IFN-g 分泌細胞の大きな増加を引き起こし、5 日目に活性がピークに達しました (図 2M)。 これらの結果は、MVP による治療後の強力な DC 刺激、抗原提示、および T 細胞活性化を実証しました。
表 1 eGFP をコードする mRNA をカプセル化したナノ粒子の組成。
表2MVPの脂質組成と電荷比粒子。
3.3. MVP は結腸直腸腫瘍および黒色腫のマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍免疫を誘発します
MVP は、MC38 結腸癌および B16 黒色腫を患うマウスの治療に適用されました。 どちらのモデルでも、OVA mRNA カプセル化 MVP を 2 回投与すると、皮下での腫瘍の増殖が完全にブロックされました。 比較すると、eGFP mRNAでカプセル化されたMVPまたはビヒクル単独による治療は、腫瘍増殖に対して検出可能な阻害効果を有さなかった（図3AeD、裏付け情報図S3）。 リンパ節における CD4 から CD8 へのシフトのパターン (図 2) と一致して、OVA mRNA カプセル化 MVP で処理したマウスの腫瘍における CD8+/CD4+ T 細胞比の増加が観察されました (図 3E)。 さらに、OVA mRNA カプセル化 MVP で治療したマウスの脾臓、リンパ節、腫瘍で IFN-gþCD8þ T 細胞レベルの上昇が検出されましたが、ビヒクル単独または GFP mRNA カプセル化 MVP では検出されませんでした（図 3FeH、サポート情報）図S4)。 さらに、OVA mRNA カプセル化 MVP 治療群の腫瘍では、OVA257e264-MHCI デキストラマー陽性 CD8þ T 細胞が大幅に増加し、抗原特異的 CD8þ T 細胞の増殖が示されました (図 3I)。 脾臓およびリンパ節から単離された細胞を用いたELISpotアッセイは、T細胞の活性化をさらにサポートしました(図3JeM)。
3.4. MVP は STING 依存性シグナル伝達を活性化することにより自然免疫応答を刺激します
私たちは、I 型 IFN および炎症性サイトカイン発現の刺激に関与する重要な因子と経路を特定するために、mRNA コア、mRNA フリー ビヒクル、および mRNA カプセル化 MVP を BMDC の治療に適用しました。 興味深いことに、MVP は IFN-b 分泌の誘発において Tlr7 アゴニストのイミキモドと同じくらい強力であり、その効力は MVP ほど高くはありませんでしたが、ビヒクル単独でも IFN-b 分泌の促進に活性を示しました。 しかし、mRNAコア単独ではIFN-b分泌の刺激には効果がありませんでした（図4A）。 この結果は、IFN-b の発現を最大化するには、mRNA とビヒクル内の成分の両方が必要であることを示唆しました。 一方、イミキモドとビヒクルは、TNF-αとIL{8}bの発現促進において同様の活性を示しましたが、MVPはそれらのいずれよりもはるかに強力でした（図4BおよびC）。 NF-κBおよびIFN調節因子に一般的に関連するサイトカインであるCCL5の発現は、イミキモド、ビヒクルのみ、またはMVPで処理した細胞において同様に刺激された（図4D）。 TLR7、MAVS、STING、および TRIF は、ウイルス RNA および損傷した DNA に対する細胞応答を媒介する主要なシグナル伝達経路の重要な因子です28e30。 Tlr7、Mavs、Sting、または Trif 遺伝子ノックアウト (KO) マウスから BMDC を生成し、細胞を mRNA コア、mRNA フリー ビヒクル、または mRNA カプセル化 MVP で処理して、IFN-b および TNF-a の発現を調べました。
図 2 MVP による免疫応答の刺激。 (A) mRNA/プロタミンコア、mRNAを含まないビヒクル、および完全なMVPの概略図。 (BeD) OVA-MVP で 24 時間処理した後の BMDC の成熟。 (EおよびF) OVA-MVPで24時間処理した後のBMDCにおけるMHC I発現およびOVA257e264抗原エピトープ-MHC I複合体。 (G) B3Z または OT-I T 細胞と共インキュベートした処理 BMDC からの IL-2 のレベル。 (H および I) 増殖性 T 細胞のフローサイトメトリー分析。 T 細胞の代表的なクロマトグラムを示します。 (J) インビボでのMVP処理後のDC成熟。 C57BL/6J マウスを OVA-MVP で処理し、膝窩リンパ節の DC を分析しました。 (K および L) T 細胞集団の分析。 C57BL/6J マウスをビヒクルまたは OVA-MVP で処理し、膝窩リンパ節の T 細胞をフローサイトメトリーで分析しました。 (M) ELISpot アッセイ。 C57BL/6J マウスを OVA-MVP で処理し、指定の時点でリンパ節を収集しました。 分離された細胞は、IFN-g 発現細胞の測定に適用されました。 データは平均 SEM (n Z 3) として表示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001; ns、重要ではありません。
図 3 MVP による抗腫瘍活性。 (A) MC38-OVA 腫瘍増殖の阻害。 メスの C57BL/6J マウスに、0 日目に 5 105 MC38-OVA 腫瘍細胞 / マウスを皮下接種し、2 日に PBS コントロール、ビヒクルコントロール、GFP-MVP、または OVA-MVP で処理しました。 3日目と1日目0。 (B) B16-OVA 腫瘍増殖の阻害。 雌 C57BL/6J マウスに 0 日目に 2 105 B16-OVA 腫瘍細胞 / マウスを皮下接種し、PBS コントロール、ビヒクルコントロール、GFP-MVP、または OVA-MVP で処理しました。 3日目と1日目0。 (CおよびD) 17日目のB16-OVA腫瘍の画像および重量。(E) 治療後のマウスの腫瘍におけるT細胞集団。 (FeH) 治療後のマウスの脾臓、リンパ節 (LN)、および腫瘍における IFN-gþCD8þ T 細胞。 (I) 治療後のマウスの腫瘍における OVA 特異的 CD8+ T 細胞。 (JeM) 治療後のマウスの脾臓および LN 細胞の ELISpot アッセイの画像と定量分析。 データは平均 SEM (n Z 5) として表示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001。
BMDC における Mavs と Sting の KO 状態はウェスタンブロット分析で確認されました (裏付け情報図 S5A)。 驚くべきことに、Sting KOはビヒクル単独およびMVPの両方からのIFN-b分泌に対する刺激活性を一掃し(図4E)、MVPがSTINGを介してI型IFN発現を活性化したことを示した。 この概念を裏付けるために、STING 活性に一般に関連するキナーゼであるタンク結合キナーゼ 1 (TBK1) (図 S5B) のリン酸化を検出しました 31。 さらに、イミキモドで処理した細胞ではIFN-b発現が損なわれていなかったため、この経路はTLR7シグナル伝達とは独立していました（図4E）。 比較すると、Trif または Mavs KO は、MVP によって促進される IFN-b 発現に最小限の影響を与えました。 予想通り、イミキモドは、Tlr7 KO 由来の BMDC における IFN-b 分泌の刺激には効果がありませんでした。 しかしながら、Tlr7 KOはMVPからの刺激効果にマイナスの影響を及ぼした(図4E)。 興味深いことに、同じ治療からの TNF-α 分泌には異なるプロファイルが観察されました。 Sting、Trif、または Tlr7 のノックアウトは、MVP 刺激によるサイトカイン発現にまったく影響しませんでした。 一方、Mavsのノックアウトは、ビヒクル単独またはMVPのいずれかで処理した細胞のTNF-αレベルを劇的に減少させた(図4F)。 この結果は、MAVSがMVP治療時のDCにおけるTNF-α発現の重要な調節因子であることを示している。
3.5. MVP は STING および MAVS 経路を刺激し、IFN-I および炎症性サイトカインの分泌を促進します。
STINGおよびMAVSシグナル伝達の刺激に関与するビヒクル内のコンポーネントを特定するために、主要なコンポーネントを置換または省略してビヒクルおよびMVPを作成し、それらをBMDCの治療に適用しました。 Sting アゴニストのサイクリック GMP-AMP (cGAMP) は、IFN-b 分泌の刺激における陽性対照として機能しました。 ビヒクル内のカチオン性脂質 EDOPC を別の正に荷電した脂質 DOTAP に置き換えると、IFN-b 分泌が完全に消失しました。 比較すると、ビヒクルおよびMVPからの刺激効果はプロタミンの有無に関わらず保持され、そのような刺激活性は無傷のSting遺伝子に依存していた(図4G)。 興味深いことに、EDOPCを含む脂質シェルの個々の成分で処理したBMDCは、強力なIFN-b分泌を促進しませんでした（裏付け情報図S6）。 したがって、EDOPC は STING の活性化に必須であり、その活性は脂質ナノ粒子 (つまり、ビヒクルまたは MVP) の形成に依存します。 EDOPC または DOTAP で調製したビヒクルと MVP を野生型および Mavs KO マウス由来の BMDCS の治療にも適用し、細胞増殖培地中の TNF レベルを測定しました。 予想通り、EDOPC を DOTAP または DOPC に置き換えると、車両と MVP からの刺激的な取り組みが排除されました。 さらに、TNF-αレベルは、野生型細胞と比較してMavs KO細胞で有意に減少しましたが、減少はしませんでした（図4H）。これは、追加の因子がMVP刺激によるTNF-α発現の媒介に関与している可能性があることを示しています。
3.6. STING 経路は MVP 媒介抗腫瘍免疫応答に不可欠です
野生型マウスとノックアウトマウスの両方を OVA mRNA カプセル化 MVP で処理し、DC の成熟と T 細胞の増殖を調べました。 Sting KO は、CD80þ および CD86þ DC 細胞と CD69þ T 細胞の割合を大幅に減少させました (図 5AeD)。 ELISpotアッセイにより、同用量のMVPで処理した後、野生型マウスと比較して、Sting KOマウスの脾臓およびリンパ節におけるIFN-g産生細胞が有意に減少していることが明らかになった(図5EeH)。 CD44þCD8þメモリーT細胞、OVA257e264-MHCIデキストラマー陽性CD8þT細胞、または野生型と比較したリンパ節内のIFN-g産生細胞の数には差が観察されなかったため、Mavs KOによる影響は最小限でした。タイプマウス（図５１ｅＬ）。 この結果は、MAVS 以外の追加の因子が MVP 刺激による炎症性サイトカイン発現に関与している可能性があるという考えを強化します。 野生型マウスと Sting KO マウスの両方を B16- OVA 腫瘍に接種するために適用し、マウスを PBS コントロールまたは OVA mRNA カプセル化 MVP で処理しました。 ワクチン接種マウスから採取したリンパ節および腫瘍サンプルのフローサイトメトリー分析により、Sting KO マウスにおける IFN-g 産生 CD8+ T 細胞の数が大幅に減少していることが明らかになりました (図 6A および B)。 その結果、Sting KO マウスでは部分的にしか阻害されなかったのに対し、MVP で治療した野生型マウスでは腫瘍増殖が完全に阻害されました (図 6C)。
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4。討議
現在の研究では、抗腫瘍免疫応答の刺激における MVP の個々のコンポーネントの機能的役割を体系的に調べました。 私たちの細胞ベースの研究では、IFN-b や IL{4}b や TNF を含む多くの炎症性サイトカインの発現を促進する完全な活性には、MVP の mRNA 分子と RNA フリー ビヒクルの両方が必要であることが明確に証明されました。 -a 樹状細胞。 このようなサイトカインは、樹状細胞の活性化とワクチン媒介抗腫瘍免疫において重要な役割を果たすことが示されています20。 私たちの研究は、サイトカイン産生の刺激が、STING や MAVS によって媒介されるものを含む、自然免疫感知に関与する多くの重要なシグナル伝達経路に依存していることも明らかにしました。 STINGはIFN-b発現に必須である一方、MAVSは主にTNF-a発現の調節に関与している(図6D)。 MVP 媒介抗腫瘍免疫に対する STING シグナル伝達の重要性は、Sting KO マウスにおける T 細胞活性の低下とその結果としての腫瘍増殖阻害の低下によってさらに実証されています。 この結果は、STING の活性化が細胞傷害性 T 細胞媒介抗腫瘍免疫を決定するという他の報告と一致しています 32。 MAVS は、ウイルス感染に応答した RIG-I 受容体 (RLR) シグナル伝達における重要な仲介物質です。 この経路の活性化は炎症反応のカスケードを引き起こします33。 MAVSシグナル伝達がTNF-αを含む炎症性サイトカインの発現制御に明らかに大きな役割を果たしていることを考えると、Mavs KOマウスにおいてT細胞活性が損なわれていないことは興味深い。 考えられる理由としては、MVP によるこのようなサイトカインの刺激は複数の経路によって媒介され、MAVS 経路の破壊によってサイトカイン発現が重大な影響を引き起こすほど十分に低いレベルまで低下しないことが考えられます。 あるいは、MAVS シグナル伝達の損失は他の経路によって補われます。 MVP ワクチンの作用機序をさらに理解するために、これらの経路を特定するにはさらなる研究が必要です。 TLR7 は伝統的に mRNA 治療薬と関連付けられてきましたが 21、TLR7 シグナル伝達は MVP 活性の媒介において主要な役割を果たしていないように思われます。 今回の研究における完全メチル化 mRNA 分子の適用により、TLR7 シグナル伝達の関連性が低下した可能性があります。 RNA メチル化が TLR による認識を抑制することは十分に実証されています 23。 TRIF は、TLR3/7/8 シグナル伝達の重要なアダプタータンパク質です 28。 Trif のノックアウトも MVP 活性に影響を与えず、TLR7 を含む上記の TLR は MVP に対する細胞応答の媒介において主要な役割を果たしていないという考えを強化します。 環状ジヌクレオチドや小分子化合物、大分子化合物など、複数の Sting アゴニストががんワクチン開発に応用されています 34e37。 このようなスティングアゴニストは、ワクチン調製中に外部アジュバントとして添加する必要があり、ワクチン組成物にさらなる複雑さが加わる。 さらに、外部から添加された Sting アゴニストは、mRNA 複合体から分離すると、望ましくない副作用を引き起こす可能性があります。 比較すると、EDOPC を含むワクチンの個々の成分はサイトカイン発現を促進できないため、当社の MVP は自己アジュバントとして機能し、がんワクチンの状況で機能します。 興味深いことに、カチオン性リン脂質 EDOPC は、同じく正に荷電した非リン脂質 DOTAP で置き換えることはできません。 これら 2 つのカチオン性脂質間の違いの潜在的なメカニズムを推測することは興味深いです。 しかし、疎水性などの脂質分子成分の他の特性が、ナノ粒子の全体的な機能と核酸の送達効率に大きな影響を与える可能性があることが実証されています 38。 したがって、完全に機能する mRNA ワクチンを調製するには、適切な分子を選択する際に注意を払う必要があります。 要約すると、我々は強力な mRNA ベースの治療用癌ワクチンを開発し、ワクチン内の個々の成分にその機能を割り当てました。 その作用機序は、予防および治療介入に使用される他の mRNA プラットフォームとはまったく異なります。 現在の研究から得られた知識は、将来の追加の mRNA 治療法の開発を確実に導くでしょう。
図 4 MVP による自然免疫応答の促進。 (AeD) 1 mg/mL イミキモド、1 mg/mL mRNA 相当コア、ビヒクル、または MVP で 24 時間処理した BMDC。 IFN-b、TNF-a、IL-1b、および CCL5 レベルを ELISA で測定しました。 (E および F) 野生型および遺伝子ノックアウト (KO) マウスに由来する BMDC の IFN-b および TNF-a の発現。 BMDC を指定の試薬で 24 時間処理しました。 IFN-b および TNF-a は ELISA で測定しました。 (G) 野生型マウスおよびスティングノックアウトマウスに由来するBMDCにおけるIFN-b。 BMDC を 20 mg/mL cGAMP、1 mg/mL mRNA 相当コア、ビヒクル、または MVP で 24 時間処理しました。 ビークル (DOTAP): EDOPC を DOTAP に置き換えることによって作成されます。 ビヒクル（プロタミンなし）：プロタミンを省略して調製。 ND：検出できません。 (H) 野生型およびMavsノックアウトマウス由来のBMDCにおけるTNF-α。 BMDC を 1 mg/mL mRNA 相当のコア、ビヒクル、または MVP で 24 時間処理しました。 ビークル (DOTAP): EDOPC を DOTAP に置き換えることによって作成されます。 ビヒクル（DOPC）：EDOPCをDOPCに置き換えたもの。 データは平均 SEM (n Z 3) として表示されます。 ***P < 0.005; ****P < 0.001; ns、重要ではありません。
図5 StingおよびMavsノックアウトマウスにおける抗腫瘍免疫応答。 (AeD) Sting ノックアウトマウスにおける DC および T 細胞の活性化の減少。 野生型マウスとスティングノックアウトマウスの両方を OVA mRNA カプセル化 MVP で処理し、48 時間後に DC および T 細胞の測定のためにリンパ節を採取しました。 (EeH) Sting ノックアウト マウスの脾臓およびリンパ節における IFN-g 発現 T 細胞の減少。 スポットの画像と定量分析の両方が表示されます。 (IeL) Mavs ノックアウト マウスの T 細胞活性には影響なし。 野生型マウスとMavsノックアウトマウスの両方をPBSコントロールまたはOVA mRNAにカプセル化されたMVPで処理し、CD44þCD8þメモリーT細胞（I）、OVA257e264-MHCIデキストラマー陽性CD8þの測定のために48時間後にリンパ節を採取しました。 T 細胞 (J)、および IFN-g 産生細胞の数 (K および L)。 データは平均 SEM (n Z 3 または 5) として表示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005; ****P < 0.001; ns、重要ではありません。
図 6 刺し傷依存性の抗腫瘍免疫。 (AおよびB)B16-OVA腫瘍を有する野生型およびStingノックアウトマウスをOVA mRNAカプセル化MVPで処理した後の、リンパ節および腫瘍組織におけるIFN-g発現T細胞の分析。 マウスは 3 日目と 1 日目に治療され0、15 日目にリンパ節と腫瘍が収集されました。単一細胞はフローサイトメトリーで分析されました。 (C) 野生型マウスおよびスティングノックアウトマウスにおける腫瘍増殖の阻害。 マウスは 3 日目と 1 日目に PBS 対照または MVP で治療されました0。 データは平均 SEM (n Z 5) として表示されます。 *P < 0.05; ****P < 0.001; ns、重要ではありません。 (D) DC におけるサイトカイン産生につながるシグナル伝達経路の MVP 刺激の概略図。 IFN-b 発現の刺激はもっぱら STING によって媒介されますが、TNF-a および IL{19}}b の発現を媒介する MAVS を含む複数の因子が存在します。
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