神経膠芽腫化学免疫療法のための CAR 好中球を介した腫瘍微小環境応答性ナノドラッグの送達

膠芽腫 (GBM) は、ヒトの固形腫瘍の中で最も進行性が高く致死性の高い腫瘍の 1 つです。 新興キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞や化学療法などの有効な治療法がさまざまながんを治療するために開発されてきましたが、GBM治療におけるそれらの有効性は血液脳関門や血液脳腫瘍関門によって大きく妨げられてきました。 ヒト好中球は生理学的障壁を効果的に通過し、病原体に対してエフェクター免疫を示しますが、初代好中球の寿命が短く、ゲノム編集に耐性があるため、免疫療法における広範な応用は制限されています。 今回我々は、CRISPR/Cas9-媒介遺伝子ノックインを用いてヒト多能性幹細胞を遺伝子操作し、T 特異的 CD3ζ または好中球特異的シグナル伝達ドメインを持つさまざまな抗 GBM CAR 構築物を発現させます。 最高の抗腫瘍活性を有するCAR好中球は、腫瘍部位で追加の炎症を誘発する必要なく、腫瘍微小環境応答性ナノ薬物を標的GBMに特異的かつ非侵襲的に送達および放出するために生成されます。 この併用化学免疫療法は、優れた特異的な抗 GBM 活性を示し、オフターゲット薬物送達を減少させ、雌の腫瘍担持マウスの寿命を延長します。 この生体模倣 CAR 好中球薬物送達システムは、総合すると、GBM およびおそらく他の重篤な疾患を治療するための、安全で強力かつ多用途のプラットフォームとなります。

カンクサの利点 - 抗腫瘍

神経膠芽腫（GBM）は、高い死亡率、短い寿命、再発傾向が高い予後不良を特徴としています1,2。 手術と化学薬品の両方の治療効果は、主に脳の微細構造と生理学的血液脳関門 (BBB) または血液脳腫瘍関門 (BBTB) によって妨げられます 3-5。 特に、脳腫瘍を治療するための中枢神経系 (CNS) への薬物送達は非常に困難です。<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

GBM を含むさまざまな癌に対する好中球の自然免疫と可塑性 12-16 は、薬物送達における細胞担体としての応用ほど研究されていません 8-10。 血液中の循環好中球は低酸素腫瘍微小環境（TME）に戻り、そこで不均一な腫瘍関連好中球（TAN）になります。TAN は、がんの進行と治療抵抗性に寄与する免疫抑制性 TME の必須成分です 12,17。 マクロファージと同様に、TAN の抗腫瘍 N1 表現型と前腫瘍 N2 表現型が低酸素状態の TME18-21 内で見つかりました。 好中球の枯渇または阻害に焦点を当てて、好中球を直接標的とするさまざまな治療戦略が開発されており、いくつかの臨床試験につながっている（例、NCT03274804のCCR5阻害剤マラビロック）。 したがって、未処理の好中球をナノキャリアとして直接適用すると、薬物輸送好中球が腫瘍部位にホーミングした後にTME内の免疫抑制性前腫瘍N2表現型に再プログラムされる可能性があるため、がん患者にさらなるリスクをもたらす可能性がある13,23。 さらに、化学療法剤と組み合わせて薬物担体として使用した場合に最適化された治療効果を達成するには、ナイーブ好中球の固有の抗腫瘍活性を探索し、増強する必要があります。

カンクサの利点-免疫システムを強化する

キメラ抗原受容体 (CAR) の修飾により、免疫 T 細胞またはナチュラルキラー (NK) 細胞の抗腫瘍活性が大幅に強化されました 24-27。 しかし、固形腫瘍におけるそれらの有効性は、部分的にはそれらの輸送能力および腫瘍浸透能力が比較的低いことにより、依然として制限されている。 生理学的BBBおよびBBTBの存在は、脳内のGBMに対するこれらの新たな治療法の有効性をさらに妨げます。 我々は、CARエンジニアリングと高運動性好中球の組み合わせにより、抗腫瘍N1表現型が維持され、GBMの治療において優れた治療効果が得られるのではないかと推測した。 初代好中球は寿命が短く、ゲノム編集に耐性があるため 28、CAR 指向の免疫療法への応用が制限されています。 ヒト多能性幹細胞（hPSC）は、遺伝子編集が容易で、大量に好中球に分化することができるため、化学的に定義された異種成分を含まない条件下での標的免疫療法に高品質のCAR好中球の無制限の供給源を提供できる可能性があります29。 好中球はまた、黄色ブドウ球菌や大腸菌などの表面が粗いまたは長い微生物病原体を優先的に貪食するため、好中球を介した薬物送達におけるナノ粒子の設計ではこれを考慮する必要があります。 確かに、Safari ら。 最近、循環好中球による、複雑な表面修飾を伴わない、静脈内投与された細長い粒子の好ましい貪食作用を報告した。 薬物を担持したナノ粒子におけるこのような簡単で生物インスピレーションに基づいた設計は、好中球における薬物担持を最大化し、標的部位への治療レベルの薬物送達を可能にする可能性がある。

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>投与されたナノドラッグの 20% が CAR 好中球によって脳腫瘍に送達されるのに対し、遊離ナノドラッグによる送達は 1% です。 要約すると、当社の生体模倣 CAR 好中球薬物送達システムは、GBM およびその他の重篤な疾患を治療するための、安全で強力かつ多用途のプラットフォームです。

カンクサの利点 - 抗腫瘍

結果

抗腫瘍活性を高めるための好中球特異的CAR構造のスクリーニング

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90％、およびターゲットクローンの大部分はヘテロ接合性です（補足図1a〜d）。 操作された hPSC 上の CAR 発現は、RT-PCR および CLTX-IgG4 のフローサイトメトリー分析によってさらに確認されました（補足図 1e-g）。 予想通り、CAR発現hPSCは、OCT4、SSEA4、SOX2などの多能性マーカーの高い発現レベルを保持しました（補足図1f）。

de novo CAR 好中球を産生するために、CAR 発現 hPSC は最初に多能性造血前駆細胞に分化し、次に段階特異的なサイトカイン処理により骨髄前駆細胞に分化しました 35 (図 2c)。 その後の G-CSF とレチノイン酸アゴニスト AM580 の使用により、強力な好中球の産生が促進されました 36。 末梢血（PB）の対応物と同様に、hPSC 由来 CLTX-CAR 好中球は、典型的な好中球形態と表面マーカー CD16、CD11b、MPO、CD15、CD66b、および CD18 を示しました（補足図 2）。 次に、hPSC 由来好中球を in vitro で神経膠芽腫 (GBM) U87MG 細胞と共培養することにより、好中球の抗腫瘍細胞毒性に対する CAR 発現の効果を調べました。 予想どおり、hPSC 由来 CLTX-CAR 好中球は、PB 好中球と比較して改善された腫瘍殺傷能力を示し (図 2d)、CLTX CAR-T 細胞における以前の観察と一致しました 27。 これらの異なる CAR の中で、CAR #1 は、hPSC 好中球において優れた腫瘍殺傷活性を媒介しました。 特に、β鎖ベースのCAR #4は、好中球媒介の腫瘍死滅を引き起こす効果が最も低く、これは、ITAMのコピーがζサブユニットよりも少ないことと、細胞表面上のα鎖を持つCARの発現が低いためである可能性があります28。 好中球は、細胞傷害性活性酸素種 (ROS) と腫瘍壊死因子 (TNF-) を放出して、標的細胞を殺します。 異なる好中球からのROSおよびTNF-の産生（図2e、f）は、細胞溶解の増加とよく一致しました。 予想通り、正常なSVG p12グリア細胞と共培養した後の異なる好中球からのROSおよびTNF-の産生は、陰性対照群と同じくらい低いままでした（補足図3a、b）。 さらに、CAR好中球の抗腫瘍細胞毒性の増強は、U87MG、初代成人GBM43、および小児SJ-GBM2細胞を含むGBM細胞との共インキュベーションでのみ観察され（補足図3c）、CLTXの高い特異性を示しています。 -車。 注目すべきことに、CAR好中球は、正常なSVG p12グリア細胞、hPSC、およびhPSC由来細胞と高い生体適合性を示しました（補足図3d）。これは、不活化された初代好中球が健康な細胞を殺さないという以前の観察と一致しています16。 まとめると、hPSC 由来 CAR 好中球、特に CD3ζ 担持 CAR 好中球は、in vitro で抗腫瘍細胞毒性が増強され、より多くの ROS と TNF を産生し、標的免疫療法におけるそれらの可能性が強調されました。

図1|CAR好中球と腫瘍微小環境応答性ナノ薬物の併用免疫療法を使用した、抗神経膠芽腫の有効性の強化の概略図。 ヒト多能性幹細胞はCARで操作され、二重免疫化学療法として、低酸素標的化チラパザミン（TPZ）または他の薬物を含む粗シリカナノ粒子（SiO2 NP）が負荷されたCAR好中球に分化した。 b 全身投与されたCAR-好中球@R-SiO2- TPZ NPは、まず免疫シナプスを形成することによって外部の正常酸素状態の腫瘍細胞を攻撃し、食作用によって腫瘍細胞を死滅させます。 アポトーシスの後、CAR好中球はR-SiO2-TPZ NPを放出する可能性があり、これは腫瘍細胞によって追い抜かれます。 その後、ナノプロドラッグは低酸素の腫瘍微小環境に反応し、効果的に腫瘍細胞を殺します。 TEOS オルトケイ酸テトラエチル、BTES ビス[3-(トリエトキシシリル) プロピル] テトラスルフィド、TPZ チラパザミン、BTZ ベンゾトリアジニル。

CAR好中球は免疫抑制腫瘍微小環境下で優れた抗腫瘍活性を維持した

マクロファージと同様に、腫瘍関連好中球の抗腫瘍 N1 表現型と前腫瘍 N2 表現型が免疫抑制腫瘍微小環境内で見つかりました 17。 前腫瘍 N2 好中球は腫瘍の血管新生、転移、免疫抑制において重要な役割を果たしていますが、この細胞型を治療標的とすることは困難でした。

全身的な枯渇戦略 22 ではなく、ここでは好中球の抗腫瘍表現型の維持における CAR 工学の可能性を評価しました。 CAR hPSC 由来および PB 好中球を、腫瘍微小環境の免疫抑制に寄与する低酸素 (3% O2​​) および TGF で処理し 37,38 、それらの持続的な殺腫瘍活性を評価しました。 PB好中球は、免疫抑制条件下でGBM細胞に対して細胞溶解の大幅な減少を示しましたが、CAR好中球は高い腫瘍殺傷活性を維持しました（補足図4a）。 同様の観察は、免疫抑制条件および正常条件下でのPBまたはCAR好中球からのTNF放出およびROS生成でも行われました（補足図4b、c）。 低酸素およびTGF条件下での好中球の表現型をさらに確認するために、フローサイトメトリーによって、単離された好中球上のN1-特異的iNOSおよびN2-N2-特異的アルギナーゼの発現を測定しました（補足図。 4d–f)。 正常酸素状態、免疫抑制性低酸素状態、および TGF と比較して、PB 好中球では iNOS の発現レベルが大幅に低下し、アルギナーゼのレベルが増加しましたが、CAR 好中球では iNOS の高い発現レベルが維持されました。 以前の研究では、Syk-Erk シグナル伝達経路の活性化が ROS 産生につながることが示されています 39-42。 したがって、未修飾好中球とCAR好中球におけるSyk-Erk活性化を検出して比較しました。その結果、低酸素下でCAR好中球におけるSyk-Erk経路の活性化が著しく高いことが示唆されました（補足図5a〜d）。低酸素下でのCAR好中球の変化しないROS産生。 まとめると、CAR好中球は抗腫瘍表現型を維持し、in vitroでの腫瘍微小環境を模倣した条件下で高い抗腫瘍活性を維持したことから、標的免疫療法におけるCAR好中球の可能性が強調されました。

図2|好中球媒介抗腫瘍活性が強化された好中球特異的キメラ抗原受容体 (CAR) 構造のスクリーニング。 さまざまなCAR構造の概略図。 b CAR #1 コンストラクトとヒト多能性幹細胞 (hPSC) の AAVS1 セーフハーバー遺伝子座における標的ノックイン戦略の概略図。 垂直矢印は、AAVS1 ターゲティング sgRNA を示します。 赤と青の水平矢印は、それぞれターゲティング効率とホモ接合性をアッセイするためのプライマーを示します。 HDR：相同組換え修復。 c 化学的に定義された条件下での hPSC からの最適化された好中球分化の概略図。 d U87MG 神経膠芽腫細胞に対する細胞毒性アッセイは、示された好中球を使用して、好中球対腫瘍標的のさまざまな比率で実行されました。 データは、5 つの独立した生物学的複製の平均 ± SD、両側スチューデント t 検定として表されます。 U87MG細胞と共培養した後の異なる好中球からの活性酸素種(ROS)生成(e)およびTNF放出のELISA分析(f)を測定した。 n=5 個の生物学的に独立したサンプル。 データは、平均値 ± SD、両側スチューデント t 検定として表されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

チラパザミン (TPZ) 含有 SiO2 ナノ粒子をロードした hPSC CAR 好中球の調製と特性評価

PB 好中球は、画像診断薬や治療薬を脳腫瘍に送達するための細胞担体として使用されています 8-10 が、標的を絞った好中球浸潤には手術または光誘発炎症が必要であり、オフターゲット薬物送達が懸念される可能性があります 11。 CAR好中球の抗腫瘍活性をさらに向上させるために、化学療法薬または放射線薬を好中球にロードするために、粗いまたは滑らかな表面を備えたシリカナノ粒子（SiO2-NP）を調製しました。 透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、両方のSiO2ナノ粒子がよく分散し、均一なサイズの球形形態を示していることを実証しました（図3a、補足図6a）。 エネルギー分散型X線分光法（EDS）を用いた走査型TEM（STEM）による組成分布分析により、硫黄（S）元素が粗いSiO2ナノ粒子（R-SiO2）全体に均一に分布していることがわかりました（図3b）。 窒素（N2）吸脱着等温線と対応する細孔サイズ分布分析を使用して、R-およびSSiO2 NPの細孔サイズはそれぞれ25 nmおよび35 nmと測定されました（図3c、補足図6b）。 高い表面積と大きな細孔サイズを考慮すると、低酸素応答性プロドラッグチラパザミン（TPZ）で例示されるように、治療薬はR-およびS-SiO2 NPの両方に効果的にロードされる可能性があります（図3d、補足図6c）。 。 TPZの負荷後、TEMおよび動的光散乱分析を使用したR-SiO 2- TPZの分散性、形態、およびサイズに大きな変化は観察されませんでした（補足図6d、e）。 R-SiO2 NP に組み込まれたテトラスルフィド結合は還元環境に敏感であり、腫瘍細胞内に存在する大量のグルタチオン (GSH) によって急速に分解される可能性があります 43。 次に、それぞれ癌細胞、正常細胞、細胞外環境の細胞内条件と同じ10 mM、1 mM、および10 μM GSHの存在下でのR-SiO2-TPZ NPのGSH応答分解性を決定しました43。 10 mM GSH処理すると、R-SiO2-TPZ NPの初期の球状構造は24時間後にひどく破壊されました（補足図6f、g）。 ナノ粒子は48時間後に完全に小さな破片に崩壊し、その結果、GSH応答性の様式でTPZが放出されました（図3e）。 R-SiO2 NP の破片は、in vitro で試験した細胞に対して重大な細胞毒性を引き起こさず（補足図 6h）、R-SiO2 NP の相対的な安全性を示しています。

カンカ チューブロサ - 免疫システムを改善する

Cistanche Enhance Immunity 製品を表示するにはここをクリックしてください

【さらに質問する】 メール:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

次に、治療効果の向上を達成するための併用化学免疫療法として、SiO2-TPZ NP を使用して CAR 好中球に治療薬をロードする実現可能性を評価しました。 遠心分離後、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリー分析を使用して好中球によるSiO2-TPZ NPの細胞取り込みを測定し（図3f、g）、S-SiO2-よりもR-SiO2-TPZ NPのより有意な細胞取り込みが検出されました。好中球によるTPZ NP。 好中球の細胞Si含有量は、誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）によって、滑らかなSiO2 NPと粗いSiO2 NP@TPZでそれぞれ11.3および19.1 ng Si/ugタンパク質として測定されました（図3h）。 好中球における高い負荷能力を考慮して、R-SiO2-TPZ NP をその後の実験に使用しました。 次に、R-SiO2-TPZ NPをロードした後のCAR好中球の生理学的機能をテストしようとしました。 R-SiO2の負荷前後のCAR-好中球の細胞生存率（図3i、補足図6i）、トランスウェル遊走能力（図3j）、走化性、および対応する速度（図3k、l）には変化は観察されませんでした。 –TPZ NP、高い生体適合性を実証。 時間依存性のナノ薬物負荷分析も実行され、細胞NPインキュベーションの1時間後に最大負荷量に達しました（補足図7a）。 95％を超えるCAR好中球にR-SiO2-TPZ NPが正常にロードされました（補足図7b）。 炎症性分子刺激時の接着および遊走機能を媒介する好中球表面タンパク質であるCD11bの発現レベルは、R-SiO2-TPZ負荷の有無にかかわらずCAR好中球で変化しませんでした（補足図7c、d）。 スーパーオキシドまたは活性酸素種 (ROS) が活性好中球から放出され、微生物や腫瘍細胞を殺します 44。 予想通り、CAR好中球によるROS生成はN-ホルミルメチオニン-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)処理後に有意に増加し、R-SiO2-の負荷前後でCAR-好中球によるROS生成に有意差は観察されなかった。 TPZ（図3m）。 まとめると、我々のデータは、R-SiO2-TPZをロードしたCAR好中球が野生型好中球の生理活性を維持し、炎症刺激に向かって積極的に移動できることを実証し、標的癌化学免疫療法におけるそれらの可能性を強調しました。

R-SiO2-TPZ ナノ粒子が充填された CAR 好中球は膠芽腫細胞を効果的に殺す

次に、CAR 好中球の腫瘍殺傷能力に対する R-SiO2-TPZ の効果を評価しました。 緊密なエフェクターと標的の相互作用は、好中球媒介細胞溶解の前提条件でした。 予想通り、CAR-好中球@R-SiO2-TPZは2時間以内に腫瘍細胞と免疫シナプスを形成し、薬物を含まないCAR-好中球と同様のエフェクターと標的の相互作用数を示しました（図4a、補足図8）。 。 特に、CAR-好中球@RSiO2-TPZと非癌性体細胞の間に観察可能な相互作用は見つかりませんでした（補足図8）。これは、脳腫瘍に対するCLTX-CARの特異性を強調しています。 さらに、共培養の12時間後にR-SiO2-TPZ NPが好中球から培地に放出され（補足図9a、b）、残りの腫瘍細胞に入りました（図4a）。 SiO2-TPZ NP を負荷した CAR 好中球と腫瘍細胞の共インキュベーションから 24 時間後、腫瘍細胞の最大 95% に R-SiO2-TPZ NP が含まれており（図 4a、補足図 9c）、成功したことを示しています。輸送カスケードには、エフェクター細胞機能を発揮してアポトーシスを起こすキャリア好中球が関与し、それによって R-SiO2-TPZ NP が受動的に標的腫瘍細胞に放出されます 45。 また、TPZからのラジカル生成の電子常磁性共鳴（EPR）分光分析（補足図9d）および腫瘍上のTOPRO-3のフローサイトメトリー分析によって、腫瘍細胞内のプロドラッグTPZの低酸素応答機能と細胞毒性を検証しました。低酸素および正常酸素下の細胞（補足図9e）。 R-SiO2-TPZ NP を負荷した CAR 好中球の細胞溶解を決定するために、in vitro 正常酸素-低酸素腫瘍再攻撃モデルを実装しました (図 4b)。 正常酸素共培養の24時間後、R-SiO2-TPZ NPを負荷したCAR好中球または負荷しなかったCAR好中球は、同様の抗腫瘍細胞毒性を示し（図4c）、両方ともRを負荷したPB好中球よりも高かった-SiO2- TPZ NP の有無、および R-SiO2- TPZ NP のみ。 細胞毒性の増強は主に、CAR 操作後の好中球の腫瘍標的化能力の増加によるものです。 腫瘍細胞とさらに12時間および24-時間の低酸素共培養後、R-SiO2-TPZ NPを負荷したCAR好中球は、他のグループと比較して優れた抗腫瘍能力を示しました（図4d、e）。 さらに、R-SiO2-TPZ NPを負荷したCAR好中球は、再播種された新鮮な腫瘍細胞に対して優れた細胞溶解を示し（図4f）、放出されたR-SiO2-TPZの抗腫瘍能力を示しています好中球アポトーシス後のナノ粒子。

次に、CAR発現とR-SiO2-TPZ NPによる好中球の抗腫瘍細胞溶解の増強の根底にある潜在的な分子機構を解明するために、腫瘍細胞に対してRNAシーケンス（RNA-seq）分析を実施しました。 遺伝子発現解析により、コントロールおよび R-SiO2- TPZ NP と比較して、R-SiO2- TPZ NP の有無にかかわらず負荷された CAR 好中球は、腫瘍細胞における細胞質および膜遺伝子の発現が有意に減少することが実証されました（補足の図10a、図4g）は、共培養時の腫瘍細胞の貪食作用をさらに裏付けています。 すべての実験グループが腫瘍細胞の細胞酸化ストレスを増加させましたが、R-SiO2-TPZを負荷したCAR好中球は、酸化ストレスシグナル伝達の誘発において他のグループより優れていました。 さらに、R-SiO2-TPZ を負荷した CAR 好中球は、腫瘍細胞のアポトーシスを大幅に促進し、増殖を減少させました。 R-SiO2-TPZ を負荷した CAR 好中球の抗腫瘍活性の強化をさらに理解するために、我々は、食作用阻害剤であるサイトカラシン D と活性酸素種 (ROS) スカベンジャーである N-アセチルシステイン (NAC) を適用しました。腫瘍と好中球の共培養に対する ROS 阻害剤 GSK2795039。 CAR好中球による腫瘍細胞の細胞溶解は、5μMサイトカラシンD、5mM NAC、および100nM GSK2795039によって大幅に減少し（補足図10b、c）、CAR好中球媒介腫瘍細胞における食作用とROSの顕著な役割を示しています。殺すこと。 好中球および NAC または GSK2795039 の存在下での残りの 40%-50% の腫瘍細胞溶解は、好中球媒介の腫瘍死滅における ROS 非依存性機構の関与を示しており、さらなる研究の価値があります。

図3|チラパザミン (TPZ) 含有 SiO2 ナノ粒子をロードした hPSC CAR 好中球の調製と特性評価。 a–e 粗い SiO2 ナノ粒子の透過型電子顕微鏡 (TEM) (a) およびエネルギー分散型分光法 (EDS) 元素マッピング画像 (b) を示します。 c 粗SiO2ナノ粒子の窒素吸脱着等温線とBarrett-JoynerHalenda（BJH）細孔径分布プロットが示されています。 生物学的三重実験は独立して実施された。 SiO2 ナノ粒子中の TPZ 負荷量 (d) およびグルタチオン (GSH)-- 反応性 TPZ 放出 (e) を指定の時間に測定しました。 n=3 個の生物学的に独立したサンプル。 (e) の一元配置分散分析 (ANOVA)。 滑らかなおよび粗いSiO2-TPZがロードされた好中球の蛍光画像（f）およびフローサイトメトリー分析（g）。 生物学的三重実験は独立して実施された。 h hPSC 由来 CAR 好中球の細胞 SiO2 含有量を測定しました。 n=5 個の生物学的に独立したサンプル、両側スチューデント t 検定。 細胞生存率 (i)、n=3 個の生物学的に独立したサンプル、遊走 (j)、n=5 個の生物学的に独立したサンプル、化学誘引能力 (k, l)、n=20 個の生物学的に独立したサンプル、および粗SiO2-TPZを負荷した、または負荷していないhPSC由来CAR好中球のROS生成能(m)を、n=5個の生物学的に独立したサンプル、両側スチューデントt検定で示した。 PMA: ホルボールミリステート酢酸塩。 この図のすべてのデータは平均値 ± SD として表されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

生体模倣神経膠芽腫モデルを用いた in vitro でのナノ薬物を負荷した CAR 好中球の機能評価

R-SiO2-TPZ NP負荷CAR好中球の活性をさらに評価するために、ヒト脳微小血管内皮細胞を使用したトランスウェルベースの血液脳関門（BBB）腫瘍モデルを実装しました（図5a、補足図） .11a)。 予想通り、R-SiO2-TPZ NPをロードしたCAR好中球は、インビトロBBBモデル全体で優れた遊走能力を示し（図5b）、正常酸素条件と低酸素条件の両方で遊走後に標的腫瘍細胞を効果的に死滅させました（図5c） 、d）、さらに多くの炎症性サイトカインを放出し（図5e）、他のエフェクター細胞を引き付けて腫瘍細胞を殺す可能性があります。 さらに、CAR好中球は遊出後の内皮細胞の生存率に有意な影響を与えませんでした（補足図11b）。 R-SiO2-TPZ NPをロードしたCAR好中球は、2回目の遊出実験中に優れた遊出能力を保持し（図5f）、他のグループと比較して優れた抗腫瘍能力を保持しました（図5g）。 次に、三次元（3D）腫瘍回転楕円体モデルを使用して、R-SiO2-TPZ NPを負荷したCAR好中球の腫瘍透過能力を評価しました（図5h）。 CAR好中球は徐々に腫瘍スフェロイドの中心に向かって移動し、8時間のインキュベーション後にスフェロイド内に均一に分布しました（図5i）。 CAR好中球とR-SiO2-TPZ NPの間の高度な共局在が観察され（補足図12a〜c）、R-SiO2-TPZ NPがCARに安定してカプセル化されたことを示しています-細胞溶解前の腫瘍浸潤中の好中球。 好中球を介した送達がなければ、R-SiO2-TPZ NP は腫瘍回転楕円体の外層でのみ見つかりました。 R-SiO2-TPZ NPおよびCAR好中球と比較して、R-SiO2-TPZ NPを負荷したCAR好中球は、3D腫瘍モデルにおいて優れた抗腫瘍細胞溶解性を示しました（図5j）。 CAR-好中球@R-SiO2 NPは、臨床テモゾロミド（TMZ）やJNJ- 64619187などの他の薬物を3D腫瘍モデルに送達し、GBM細胞を効率的に殺すために使用することもできます（補足図12d–f）。 総合すると、CAR好中球とナノ薬剤の組み合わせは、生体外の条件を模倣した生体模倣腫瘍微小環境において優れた抗腫瘍活性を示し、好中球に基づく併用化学免疫療法の治療可能性を強調した。

カンカ チューブロサ - 免疫システムを改善する

CAR 好中球によって送達された R-SiO2- TPZ ナノ粒子の生体内分布

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >投与されたナノドラッグの 20% が CAR 好中球によって脳腫瘍に送達されたのに対し、遊離ナノドラッグによる送達は 1% であり、これは以前の報告と一致しています 6。 CAR好中球によるBBBを通った宿主脳へのR-SiO2-TPZ NPの標的送達は、組織学分析によっても確認された（図6d）。 反対に、R-SiO2-TPZ NP 単独では主に肝臓と脾臓に蓄積しました。 まとめると、我々のデータは、腫瘍部位に追加の炎症を誘発することなく、CAR好中球によるR-SiO2-TPZ NPの標的送達が強化されたことを実証し、がん治療における好中球ベースの化学免疫療法の実現可能性と安全性を強調した。

CAR-好中球とR-SiO2-TPZナノ粒子の併用化学免疫療法は、生体内で優れた抗神経膠芽腫活性を示した

R-SiO2-TPZ NP を負荷した CAR 好中球の治療効果を確認するために、ルシフェラーゼ発現 U87MG 細胞を使用して、NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) マウスで神経膠芽腫の in situ 異種移植モデルを確立しました。 腫瘍担持マウスに毎週 5 × 106 個の好中球を静脈内投与し (図 7a)、宿主の腫瘍量を測定および定量化しました (図 7b、c)。 PBS または PB 好中球で治療したマウスと比較して、CAR 好中球および CAR 好中球@R-SiO2-TPZ NP での治療は腫瘍の増殖を効果的に遅らせました。 CAR好中球@R-SiO2-TPZ NPは、他の実験グループよりもはるかに高い抗腫瘍細胞毒性を示しました。 逆に、PB好中球は脳内の腫瘍増殖を有意に促進し、その結果、23日目には腫瘍担持マウスが死亡しました（図7d）。これは、改変されていない好中球がさらなるリスクを引き起こす可能性があることを示唆しています。 次に、さまざまな実験マウスグループの血漿中のヒトサイトカイン放出を測定しました（図7e）。 すべての非 PBS 実験グループは、5 日目から 26 日目まで血漿中に検出可能な TNF および IL-6 を生成し、腫瘍刺激によるヒト好中球の活性化を示唆しました。 観察されたより高い腫瘍増殖速度と一致して、未修飾の好中球は徐々により多くのIL-6とTNFを放出しました。これは患者にサイトカイン放出症候群を引き起こす可能性があり、IL-6遮断薬のより詳細な安全性研究が必要です46,47 。 特に、CAR-好中球@RSiO2-TPZ NPは、後の時点（19日目および26日目）でサイトカイン産生能力の低下を示し、CAR-好中球ベースの化学免疫療法で治療された患者におけるサイトカイン放出症候群のリスクが潜在的に低いことを示唆しました。 CAR-好中球と R-SiO2-TPZ NP の組み合わせの生体適合性は、毎週の体重測定とマウスの主要臓器の病理学的変化のモニタリングを通じて評価されました。 CAR好中球@R-SiO2-TPZ NP処理マウスと他の実験グループの間で体重に差は観察されず（図7f）、全身毒性が最小限であり、R-SiO2-TPZ NP内のCAR好中球の優れた生体適合性を示しています。 28日間の治療。 30日目にマウスからスライスした主要臓器の組織学的分析により、CAR-好中球@R-SiO2-TPZ NP処理マウスが心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓に顕著な異常や臓器損傷を引き起こさないことが示されました（補足図1）。 13)、CAR-好中球と R-SiO2-TPZ の組み合わせの NP の安全性がさらに確認されました。

図4|R-SiO2-TPZ ナノ粒子が充填された CAR 好中球は、膠芽腫細胞を効果的に殺します。 6、12、および24時間でのCAR好中球と腫瘍細胞の間の界面での極性F-アクチン蓄積によって示される免疫学的シナプスの代表的な画像が示されました。 腫瘍細胞の貪食によりCAR好中球から放出されたR-SiO2-TPZナノ粒子は、腫瘍細胞によって取り込まれた。 三重実験を独立して実施した。 b 好中球媒介抗腫瘍細胞毒性アッセイの概略図。 U87MG 神経膠芽腫細胞に対する細胞毒性は、24 時間 (c)、36 時間 (d)、48 時間 (e)、および 72 時間 (f) で示された好中球を使用して、好中球対腫瘍標的のさまざまな比率で実行されました。 n=3 個の生物学的に独立したサンプル。 データは平均 ± SD、一元配置分散分析 (ANOVA) として表されます。 g バルク RNA シーケンス分析を、さまざまな条件下で U87MG 細胞に対して実行しました。 ヒートマップは、指定された神経膠芽腫細胞における選択された細胞質、膜、酸化ストレス、アポトーシス、および増殖関連遺伝子の発現レベルを示します。 n=2 個の生物学的に独立したサンプル。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

図5|in vitro での生体模倣神経膠芽腫 (GBM) モデルを使用した、R-SiO2- TPZ ナノ粒子を負荷した CAR 好中球の機能評価。 a 血液脳関門（BBB）を備えた GBM の in vitro 腫瘍モデルの概略図。これは、細胞挿入膜上の内皮細胞と同じトランスウェルの底部の腫瘍細胞で構成されています。 b 12時間での好中球のトランズウェル遊走分析が示されています。 24 時間 (c) および 36 時間 (d) での示された好中球の抗 GBM 細胞毒性を測定および定量しました。 e 36時間後に示された好中球から放出されたIL-6およびTNFのELISA分析を実行しました。 f 48時間後の異なる好中球の2回目の遊走が示されています。 g 60時間での示された好中球の抗GBM細胞毒性を測定および定量した。 h – j in vitroでの好中球浸潤三次元（3D）腫瘍モデルの概略図を（h）に示します。 3D 腫瘍モデルにおける浸潤好中球の代表的な蛍光画像が示されました。 DAPI を使用して細胞核を染色し、CD45 を使用して好中球を染色しました。 スケールバー、200 μm。 生物学的三重実験は独立して実施された。 j 示された好中球の対応する腫瘍殺傷能力は、細胞毒性キットを使用して測定および定量化されました。 データは、5 つの独立した生物学的複製の平均 ± SD、一元配置分散分析 (ANOVA) として表されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

CAR-好中球@R-SiO2-TPZ NPは異種移植マウスの腫瘍増殖を大幅に遅らせましたが、CAR-好中球、SiO2-TPZ NPおよびCAR-好中球@R-SiO2-TPZ NPの実験群における動物生存率の差はわずかです。 (p > 0.05)、これはおそらく細胞の調製および注入中の短命な好中球の死によるものと考えられます。 次に、これらの3つのグループに焦点を当て、細胞調製時間の短縮とCAR好中球およびナノ薬物の用量の増加が動物の生存率に何らかの違いをもたらすかどうかを判断しました（図7g）。 6回全身投与すると、CAR-好中球@R-SiO2-TPZ NPは腫瘍担持マウスの寿命延長において他の2つのグループを上回りましたが（図7h）、CAR-好中球とSiO2-のグループでは動物の生存率に差が見られました。 TPZ NP は依然として有意ではありませんでした。 これら 2 つの独立した動物実験の間で R-SiO2- TPZ グループの同様の生存曲線が観察されましたが、最初の 4 つの好中球では、細胞の単離と注射の準備にかかる時間が合計約 4 時間から 1 時間に短縮されました。まとめると、我々のデータは、好中球治療薬の将来の臨床応用における好中球の調製と用量の最適化の重要性を実証しました。

議論

マウス好中球は、炎症を起こした術後脳腫瘍にナノ薬物を効率的に送達する強力なキャリアとして実証されています 8,9。 それでも、薬物送達におけるヒト好中球の使用の実現可能性と安全性は依然としてわかりにくい。 治療効果を得るためにこれらの研究で使用された大量のマウス好中球（マウスの循環好中球の総数の10倍11）は、がん患者からの大量の好中球の抽出が好中球減少症や症状を引き起こす可能性があるため、臨床応用をさらに妨げる可能性があります。その他のリスク。 これらの課題に対処するために、我々は、自己複製する hPSC の力を利用して、無制限の de novo ヒト好中球を取得しました 29。 我々は、CAR エンジニアリング 29 を用いて、生体にインスピレーションを得た強力な好中球媒介ドラッグデリバリーシステムを開発し、顕著な抗腫瘍活性を持つナノキャリアとして操作されたヒト CAR 好中球を使用しました。 CAR好中球キャリアでは、粗面SiO2 NPは平滑SiO2 NPよりもよく機能し、好中球が粗面微生物病原体を優先的に貪食するという以前の観察と一致しています30。 好中球は神経膠腫細胞の増殖と進行を促進することが報告されています48。 我々は、動物実験において未修飾好中球の同様の腫瘍促進効果を観察し、薬物送達や他の治療用途における安全性を確保するための好中球のCCAR操作やその他の修飾の必要性を強調しました。 特に、CAR好中球を介した薬物送達は、増幅された手術後の炎症シグナルではなく、GBM本来の化学誘引能力のみに依存しており、深部に浸潤した神経膠腫の根絶における薬物送達システムの高い特異性と治療可能性を示唆しています。手術では取り除くことができないもの。 GBM12の主な臨床介入は外科的切除と補助化学療法/放射線療法であるため、CAR好中球ナノキャリアと手術/放射線療法の併用療法は最適な治療効果を達成する可能性があり、さらなる研究の価値がある。 T 細胞および NK 細胞に特異的な CAR 構築物は、T 細胞および NK 細胞の抗腫瘍活性を増強するために広く使用されていますが、好中球の抗腫瘍機能を向上させる好中球特異的な CAR については記載されていません。 CD4ζ および CD4 キメラ免疫受容体は、in vitro で HIVenv トランスフェクト細胞に対する好中球の細胞溶解を増強することが以前に報告されています。 それでも、エフェクター対ターゲット (E:T) 比 10:128 では、溶解効率はわずか約 10% でした。 Fc RIIA (CD32a) は、単量体 IgG の低親和性単鎖膜貫通受容体であり、好中球で高度に発現され (細胞あたり 30,000 ～ 60,000 分子 31)、そのライゲーションにより Fc -好中球の依存性機能（顆粒内容物の放出、Ca2+ 動員、抗腫瘍細胞毒性、食作用など）49。 好中球の活性化と機能における CD32a の顕著な役割を考慮して、我々は CD32a ベースの CAR 構築物を設計し、テストしました。 しかし、我々の結果は、hPSC由来好中球で発現させた場合、CD3ζがCD32aよりも有意に良好な細胞溶解を媒介することを実証した。これは部分的には、CD3ζにおけるITAMのコピーがCD32aよりも多く、それぞれ3コピーと1コピーであることと、好中球の細胞表面よりも ζ 28。 CD32a と同様に、Fc RIII (CD16b) は単量体 IgG に対する別の低親和性受容体であり、好中球上では CD32a よりもはるかに高いレベルで発現されます 31。 CD16b の架橋は Ca2+ の動員と脱顆粒のみを誘導し、好中球の食作用と細胞溶解は誘導しません 28,50 が、CD3ζ- と CD16b の能力を体系的に比較することは将来の研究で依然として興味深いでしょう。 -好中球の抗腫瘍機能を誘発および強化するCAR。

図6|CAR好中球によって送達されたR-SiO2-TPZナノ粒子（NP）の生体内分布。 in vivo細胞追跡研究用に静脈内投与されたCy5-標識CAR好中球@R-SiO2 NPおよびR-SiO2 NPの概略図。 5 × 105 個のルシフェラーゼ (Luci) 発現 U87MG 細胞を NRG マウスの右前脳に定位的に移植しました。 4日後、マウスをPBS、5×106 Cy5-標識CAR好中球@R-SiO2 NPおよびR-SiO2 NPで静脈内処理しました。 b 全身、脳、および他の臓器におけるCy5+好中球の時間依存性生体内分布を、指定された時間に蛍光イメージングによって決定および定量しました。 c 注射後24時間のマウスにおけるCAR好中球@R-SiO2 NPおよびR-SiO2 NPの体内分布を、Si元素に基づく誘導結合プラズマ発光分析法（ICP-OES）によって分析し、データをパーセンテージとして表しました。組織 1 グラムあたりの注入量 (%ID/g)。 n=5 個の生物学的に独立したサンプル。 データは平均±SDとして表されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 d 腫瘍担持マウスから単離された、示された神経膠芽腫異種移植片における CD45 および SiO2 の代表的な蛍光画像が示されました。 スケールバー、100μm。 生物学的三重実験は独立して実施された。

図7|CAR-好中球と R-SiO2- TPZ ナノ粒子 (NP) の組み合わせの in vivo 抗腫瘍活性を静脈内注射によって評価しました。 in vivo 腫瘍死滅研究用に静脈内投与された PBS、PB-好中球、CAR-好中球、CAR-好中球@R-SiO2-TPZ NP の概略図。 5 × 105 個のルシフェラーゼ (Luci) 発現 U87MG 細胞を NRG マウスの右前脳に定位的に移植しました。 4 日後、マウスに指定の好中球を 1 か月間毎週静脈内投与しました。 時間依存性の腫瘍量を、示された日に生物発光イメージング (BLI) によって測定 (b) し、定量化 (c) しました。 データは、(b) のマウスの平均 ± SD (n=5)、一元配置分散分析 (ANOVA) です。 d 示された実験グループ（n=5）の生存を示すカプランマイヤー曲線が示されました。 異なるマウス群の末梢血中の放出されたヒト腫瘍壊死因子-(TNF)およびIL-6(e)および体重(f)を、示された日に測定した。 データは平均値 ± SD、n=5 個の生物学的に独立したサンプルです。 g、h CAR好中球およびRSiO2-TPZ NPの投与頻度の増加による抗腫瘍活性を評価した。 g インビボ腫瘍死滅研究のための静脈内投与されたCAR-好中球、R-SiO2-TPZ NP、およびCAR-好中球@R-SiO2-TPZ NPの概略図。 h 示された実験グループの生存を示すカプランマイヤー曲線が示されました (n=5)。 カプラン・マイヤー曲線はログランク検定によって分析されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

我々はまた、他のヒト疾患を治療するための他の好中球ベースの取り組みをサポートするために、将来的に再設計および調整される可能性がある、モジュール式で汎用性の高いhPSC好中球薬物送達プラットフォームをここで紹介した。 まず、CAR エンジニアリングは、初代免疫 T 細胞や好中球よりも hPSC の方が利用しやすいです。 さまざまな CAR の安定かつ均一な発現を達成するには、1 回のゲノム編集のみが必要です 29。 CLTX CARに加えて、ユニバーサル抗フルオレセイン（FITC）51または抗PD-L1 CAR52を発現する安定したhPSC株も構築しました。どちらも、ユニバーサル固形腫瘍を標的とするナノキャリアCAR好中球を取得するために利用できます。 抗FAP CAR53を標的とした線維症などの他の遺伝子改変も、好中球ナノキャリアを脳外傷や心臓線維症などの致命的な変性疾患の治療に向けて行うために実行できます。 さらに、CAR 発現 hPSC は、CAR-T 細胞または CAR-NK 細胞の産生にも容易に適応でき 29、これらの免疫療法と CAR 好中球ナノキャリアとの組み合わせにより、最適な抗腫瘍治療上の利点が得られる可能性があります。 最後に、当社の生物由来の腫瘍グルタチオン (GSH) 応答性ナノドラッグ システムは、臨床 TMZ、JNJ64619187、およびプロドラッグ TPZ に例示されるように、標的薬物送達のために有望な化学療法薬または放射性薬剤を CAR 好中球にロードするモジュール式の多用途プラットフォームです。 他のナノ粒子の試験に関する将来の研究により、好中球への薬物負荷が最適化され、生体内での治療効果を最大化できる可能性がある。

我々は、CAR好中球を使用してBBB全体の脳腫瘍に化学療法薬を特異的かつ効率的に送達するという治療概念を実証しましたが、この研究にはいくつかの制限があります。 まず、4- 日の腫瘍細胞接種では、治療研究の臨床シナリオを模倣する腫瘍を確立するには十分ではない可能性があり、さまざまな患者における膠芽腫の発達と治療反応のさまざまな段階を再現するには、さまざまな腫瘍接種期間を用いた今後の研究が必要です。患者54,55。 第二に、ここで使用した免疫不全マウスは適応免疫を欠いており、in vitroで産生されたCAR好中球の安全性と有効性をより適切に評価するには、自然発症神経膠腫を有するペットの犬など、完全な免疫系を備えた他の前臨床モデルが必要です56。 特に、サイトカイン放出症候群、神経毒性、CAR-T 細胞で観察されるオンターゲットのオフ腫瘍毒性など、注入動物にナノ薬物を負荷した場合としない場合の CAR 好中球のオフターゲット毒性プロファイリングが、寿命が短いにもかかわらず必要とされています57。好中球の。 移植片対宿主病 (GvHD) の潜在的なリスクを回避するために、低免疫原性ユニバーサルドナー hPSC の操作 58 ～ 61 やヒト白血球抗原 (HLA) ホモ接合性 hPSC ライブラリーのバンク作成 62 などの実現可能なアプローチが容易に利用可能ですが、前臨床動物モデルでは、好中球治療薬の翻訳可能性を評価するには、完全な免疫系が依然として必要です。 最後に、CAR-好中球ナノ薬物治療薬の限定的な抗腫瘍細胞毒性と動物寿命の延長が観察されました。 したがって、CAR-好中球治療薬の最大の抗腫瘍効果を達成するには、より効果的な化学療法薬や放射線増感剤、古典的なCAR-Tと外科的切除との併用療法の将来の探索が不可欠です。 たとえば、メカニズムに基づいた設計に関する最近の研究により、臨床TMZ薬63で観察される獲得耐性を克服する、より効果的な薬剤KL-50が得られ、これを当社のモジュラーCAR-好中球ナノドラッグプラットフォームに組み込んで、潜在的な治療効果を得ることができます。より良い治療効果。 CLON-G（カスパーゼ - リソソーム膜透過化 - 酸化剤 - ネクロトーシス阻害 + 顆粒球コロニー刺激因子 64）処理および/または CAR 好中球における長期制御薬物放出システムの使用により、好中球の保存期間を 5 日間に延長することも可能性があります。好中球アポトーシス後も持続的な in vivo 抗腫瘍効果を達成します。 まとめると、我々の発見は、R-SiO2-TPZを負荷したCAR好中球が抗腫瘍N1表現型を維持し、in vitroでのさまざまな腫瘍ニッチ様条件下​​で腫瘍細胞を効率的に死滅させることができることを明確に示しました。 また、機能性CAR好中球を遺伝子操作されたhPSCから大量に産生して、腫瘍微小環境に応答するナノ薬物を生体内でGBMを標的に正確に送達することも可能であり、強力で特異的な抗GBM活性と最小限のオフターゲット薬物送達を備えた併用化学免疫療法につながる可能性がある。腫瘍を持つマウスの寿命が延びる。

参考文献

1.ヤン・F.ら。 IL-6 と CD40 の二重標的による神経膠芽腫の相乗免疫療法。 ナット。 共通。 12、3424 https://doi.org/10.1038/s41467-021-23832-3 (2021)。

2. Lim, M.、Xia, Y.、Bettegowda, C.、Weller, M. 膠芽腫に対する免疫療法の現状。 ナット。 クリン牧師。 オンコル。 15、422–442 (2018)。

3. アグリアルディ、G. 他。 腫瘍内 IL-12 送達は、神経膠芽腫の前臨床モデルにおける CAR-T 細胞免疫療法を可能にします。 ナット。 共通。 https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021)。

4. 新たな治療標的としての Németh, T.、Sperandio, M. および Mócsai, A. 好中球。 ナット。 Rev.DrugDiscov. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0054-z (2020)。

5. Subhan, MA および Torchilin, VP 癌治療の新たな治療標的およびツールとしての好中球。 生命科学。 https://doi.org/10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021)。

6. Cheng, YH、He, C.、Riviere, JE、Monteiro-Riviere, NA、Lin, Z. 生理学的に基づいた薬物動態モデリングとシミュレーションのアプローチを使用した、腫瘍へのナノ粒子送達のメタ分析。 ACS Nano 14、3075–3095 (2020)。

7. ウィルヘルム、S. 他。 腫瘍へのナノ粒子送達の分析。 ナット。 メーター牧師。 1、1–12 (2016)。

8. Xue、J.ら。 術後の悪性神経膠腫の再発を抑制するための好中球を介した抗がん剤送達。 ナット。 ナノテクノロジー。 12、692–700 (2017)。

9. ウー、M.ら。 外科的に治療された神経膠腫の標的療法のための炎症活性化型改変好中球の MR 画像追跡。 ナット。 共通。 9、1–13 (2018)。

10. Chu, D.、Dong, X.、Zhao, Q.、Gu, J. & Wang, Z. 腫瘍微小環境の光増感プライミングにより、好中球浸潤を介したナノ治療薬の送達が向上します。 上級 メーター。 29、(2017)。

11. Osuka, S. & Van Meir, EG がん治療: がんナノドラッグにおける好中球の移動。 ナット。 ナノテクノロジー。 12、616–618 (2017)。

12. Lin、YJ、Wei、KC、Chen、PY、Lim、M.、およびHwang、TL 神経膠腫および脳転移における好中球の役割。 フロント。 イムノール。 https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021)。

13. フリドレンダー、Z. 他。 TGF-βによる腫瘍関連好中球表現型の二極化:「N1」対「N2」TAN。 がん細胞 (2009)。

14. ブレイズデル、A. 他。 好中球は、低酸素腫瘍細胞の壊死組織切除を介して子宮上皮発癌に対抗します。 Cancer Cell 28、785–799 (2015)。

15. マヒディン、K. 他。 腫瘍の低酸素状態が緩和されると、好中球の殺腫瘍能力が解放されます。 Ｊ．クリン． 投資 130、389–403 (2020)。

16. ヤン、J. 他。 ヒト多形核好中球は、癌細胞を特異的に認識して殺します。 オンコイン免疫学 3、e950163 (2014)。

17. ジャイヨン、S. 他。 腫瘍の進行と治療における好中球の多様性と可塑性。 ナット。 Rev. Cancer 20、485–503 (2020)。

18. リー・エックスら。 神経膠腫の免疫微小環境における神経膠腫幹細胞に関する研究の進展。 フロント。 薬理学。 https://doi.org/10。 3389/fphar.2021.750857 (2021)。

19. Gieryng A.、Pszczolkowska, D.、Walentynowicz, KA、Rajan, WD & Kaminska, B. 神経膠腫の免疫微小環境。 研究室 調査します。 https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017)。

20. Jung E.ら。 神経膠腫における重要な微小環境ニッチにおける腫瘍細胞の可塑性、不均一性、および耐性。 ナット。 共通。 https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021)。

21. ダン GP 他 悪性神経膠腫に対する新たな免疫療法: 免疫ゲノミクスから細胞療法まで。 ニューロ。 オンコル。 （2020年）。 https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. イー・PP 他 好中球誘導性のフェロトーシスは、膠芽腫の進行における腫瘍壊死を促進します。 ナット。 共通。 11、(2020)。

23. サギブ、JY 他。 癌における循環好中球部分集団における表現型の多様性と可塑性。 Cell Rep. 10、562–573 (2015)。

24. Li, Y.、Hermanson, DL、Moriarity, BS & Kaufman, DS キメラ抗原受容体を用いて操作されたヒト iPSC 由来のナチュラルキラー細胞は、抗腫瘍活性を強化します。 Cell Stem Cell 23、181–192.e5 (2018)。

25. キム、GB 他 高親和性変異体インターロイキン-13を標的としたCAR T細胞は、クリック可能な生分解性蛍光ナノ粒子の神経膠芽腫への送達を強化します。 バイオアクト。 メーター。 5、624–635 (2020)。

26. Nguyen, V. 他 IL13R 2 腫瘍限定バイオマーカーを非侵襲的に視覚化し、治療的に利用するための新しいリガンド送達システム。 ニューロ。 オンコル。 14、1239–1253 (2012)。

27. 王 D. 他 神経膠芽腫を特異的かつ効果的に標的とするクロロトキシン指向性 CAR T 細胞。 科学。 翻訳。 医学。 12、(2020)。

28. ロバーツ、MR 他。 ゼータまたはガンマシグナル伝達ドメインを持つキメラ免疫受容体を発現する好中球およびNK細胞による抗原特異的細胞溶解。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 161、375–384 (1998)。

29. Chang, Y. 他 標的癌免疫療法のためにヒト多能性幹細胞からキメラ抗原受容体好中球を操作する。 Cell Rep. 40、111128 (2022)。

30. サファリ H. 他 好中球は、急性炎症性疾患における選択的標的化の機会となる細長い粒子を優先的に貪食する。 科学。 上級 6、(2020)。

31. Wang, Y. & Jönsson, F. 好中球 Fc 受容体の発現、役割、および調節。 フロント。 イムノール。 https://doi.org/10.3389/fimmu。 2019.01958 (2019)。

32. ネメス・T. 他 好中球活性化およびインビボ自己免疫性関節炎におけるfc受容体鎖ITAMチロシンの重要性。 フロント。 イムノール。 https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019)。

33. ヒト IgG1- および IgG3- オプソニン化細菌および赤血球の食作用における好中球 Fc RIIa (CD32) および Fc RIIIb (CD16) 多型の役割。 輸血。 医学。 改訂版 https://doi.org/10.1016/s0887-7963(05)80094-x (1995)。

34. Tsuboi, N.、Asano, K.、Lauterbach, M. & Mayadas, TN ヒト好中球 Fc 受容体は、抗体媒介炎症性疾患において特殊な非重複的な役割を開始し、果たします。 免疫。 https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008)。

35. Chang, Y. 他 化学的に定義されたヒト造血内皮細胞および最終的な造血前駆細胞の生成。 バイオマテリアル 285、121569 (2022)。

36. ブロック・ヴォルチャンスカヤ、VS 他。 ETV2-修飾 mRNA を使用した人工多能性幹細胞からの機能的好中球の効果的かつ迅速な生成。 Stem Cell Rep. 13、1099–1110 (2019)。

37. エマミ・ネジャド・A. 他 腫瘍微小環境およびがん幹細胞の発生における低酸素の役割: 治療法開発への新しいアプローチ。 がん細胞内部 https://doi.org/10.1186/s12935-020-01719-5 (2021)。

38. ルキュー A. 他 免疫チェックポイントの発現に対する低酸素腫瘍微小環境と腫瘍細胞の可塑性の影響。 キャンサーレット。 （2019年）。 https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39。 高野 哲、佐田 圭、山村 博。B 細胞の酸化ストレスシグナル伝達におけるプロテインチロシンキナーゼ Syk の役割。 抗酸化物質のレドックスシグナル。 https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002)。

40. Zhang J. 他。 ROS および ROS を介した細胞シグナル伝達。 オキシダット。 医学。 細胞。 長寿。 https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016)。

41. 川上裕也 他 プロテインキナーゼＣのＳｙｋリン酸化に依存するＲａｓ活性化経路。Ｐｒｏｃ． 国立 アカド。 科学。 アメリカ合衆国。 https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003)。

42. Mócsai, A.、Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ SYK チロシンキナーゼ: 多様な生物学的機能における重要な役割。 ナット。 イミュノール牧師。 https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010)。 43. Liu B.ら。 硫化水素ガスおよび三峰性強化酵素動的療法のための腫瘍微小環境応答性ナノ複合材料。 上級 メーター。 https://doi.org/10.1002/adma。 202101223（2021年）。

44. Nguyen、GT、Green、ER & Mecsas、J. ROScue への好中球: NADPH オキシダーゼ活性化と細菌耐性のメカニズム。 フロント。 細胞。 感染する。 微生物。 https://doi.org/10.3389/fcimb.2017。 00373 (2017)。

45. Che J. 他 好中球は、炎症を起こした骨格筋および虚血心臓への局所的かつ非侵襲的なリポソーム送達を可能にします。 上級 メーター。 32、(2020)。

46. Le、RQ 他。 FDA承認の概要：キメラ抗原受容体T細胞誘発性の重度または生命を脅かすサイトカイン放出症候群の治療のためのトシリズマブ。 腫瘍学者 23、943–947 (2018)。

47. Morris, EC、Neelapu, SS、Giavridis, T. & Sadelain, M. がん免疫療法におけるサイトカイン放出症候群および関連する神経毒性。 ナット。 イミュノール牧師。 22、85–96 (2022)。

48. Liang, J. 他 好中球は、S100A4 を通じて悪性神経膠腫の表現型を促進します。 クリン。 がん研究所 20、187–198 (2014)。

49. ナガラジャン S. 他。 好中球CD32Aリガンド結合機能の細胞特異的、活性化依存性制御。 血液 https://doi.org/10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000)。

50. Fanger, MW、Shen, L.、Graziano, RF & Guyre, PM IgG に対するヒト Fc 受容体によって媒介される細胞毒性。 イムノール。 今日。 https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989)。

51. リー、YG 他 低分子量アダプターを使用した、CAR T 細胞媒介サイトカイン放出症候群様の毒性の制御。 ナット。 共通。 10、2681 (2019)。

52. 籠谷裕他 JAK-STATシグナル伝達ドメインを含む新規キメラ抗原受容体は、優れた抗腫瘍効果を媒介します。 ナット。 医学。 24、352–359 (2018)。

53. アガジャニアン H. 他。 改変された T 細胞による心線維症の標的化。 自然。 https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019)。

54. Zhang C. 他。 神経膠芽腫の標的療法のための ErbB2/HER2- 特異的 NK 細胞。 J.Natl. がん研究所 https://doi.org/10.1093/jnci/djv375 (2016)。

55. アカヴァン D. 他 脳腫瘍に対する CAR T 細胞: 学んだ教訓と今後の道のり。 イムノール。 改訂版 https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019)。

56. オマール、NB 他。 IL-12を発現する遺伝子操作された腫瘍溶解性HSV-1であるM032を、散発性神経膠腫を患う愛犬に頭蓋内投与した後の安全性と暫定生存データ。 脳神経外科。 フォーカス 50、1–11 (2021)。

57. Larson, RC & Maus, MV CAR T 細胞の機構と機能における最近の進歩と発見。 ナット。 Rev. Cancer 21、145–161 (2021)。

58. ワン、B. 他。 遺伝子操作された同種異系ヒト人工多能性幹細胞からの低免疫原性 T 細胞の生成。 ナット。 バイオメッド。 工学 5、429–440 (2021)。

59. Deuse、T. 他。 人工多能性幹細胞の低免疫原性誘導体は、完全に免疫能を有する同種異系レシピエントにおいて免疫拒絶を回避します。 ナット。 バイオテクノロジー。 37、252–258 (2019)。

60. ハン・Xら。 低免疫原性ヒト多能性幹細胞の生成。 https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. クォン YW 他 HLA DR ヒト iPSC における TALEN を用いたゲノム編集により、免疫寛容樹状細胞が生成されました。 幹細胞インターナショナル https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021)。

62. 森實 A. 他 MHC マッチングにより、ヒト以外の霊長類における iPSC 由来ニューロンの生着が向上します。 ナット。 共通。 https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017)。

63. リン、K. 他。 薬剤耐性神経膠腫を選択的に標的とする薬剤のメカニズムに基づいた設計。 科学。 (80-。) 377、502–511 (2022)。

64. ファン Y. 他 複数の細胞死経路を標的とすることで保存期間が延長され、ヒトおよびマウスの輸血用好中球の機能が維持されます。 科学。 翻訳。 医学。 13、(2021)。

65. Chang Y. 他 ヒト多能性幹細胞の細胞周期相を連続的かつ系統特異的に報告するための蛍光インジケーター。 バイオテクノロジー。 バイオエンジ。 ビット.27352。 https://doi.org/10.1002/bit。 27352 (2020)。

66. Jung, J. 他 化学的に定義されたヒト最終造血幹細胞および前駆細胞の生成。 スタープロトコル 4、101953 (2023)。