インビトロでのウシ卵母細胞に対するウロリチンAのアンチエイジング効果
Aug 30, 2022
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概要：酸化ストレスとミトコンドリア機能不全は、卵母細胞の質の加齢に伴う低下と関連しており、それらの予防のための戦略が現在求められています。 ウロリチン A (UA) は、アポトーシス促進効果と抗酸化効果を持つ天然の代謝産物であり、さまざまな老化細胞における機能不全のミトコンドリアの蓄積を防ぐことができます。 UA は、ウシ卵母細胞でテストされたことはありません。 私たちの目的は、生殖能力に関連する重要な遺伝子の卵丘卵母細胞複合体 (COC) および顆粒膜細胞 (GC) 発現の発生能に対する UA の影響を研究することでした。 核成熟の進行、ミトコンドリア膜電位 (MMP)、および生理学的に成熟した卵母細胞 (22 時間) および in vitro で老化した卵母細胞 (IVM の 30 時間) の発達能力を、思春期前および成人の女性から得られ、UA を補充したかどうかにかかわらず評価した。 さらに、いくつかの遺伝子 (NFE2L2、NQO1、および mt-DN5) の mRNA の量と mt-ND5 DNA コピーの数を、思春期前および成体の女性の培養 GC で定量化しました。 私たちの研究は、核成熟の進行、MMP、発達能力、および遺伝子発現レベルに対する卵母細胞の老化の有害な影響を確認しました。 強化された in vitro 成熟中の UA 処理 (p<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">
キーワード:卵母細胞; エージング; ウロリチン A; 生殖補助医療
1.はじめに
女性の生殖能力の低下は、老化によって悪影響を受ける最初の生理学的機能の 1 つであり、世界中で新たな健康問題と見なされています [1,2]。 いくつかの病理学的問題に加えて、加齢に伴う女性の生殖能力の低下は、卵母細胞の卵巣予備能の低下が主な原因である [1,3-5] 卵母細胞の質の時間依存的な低下と関連している [2]。 この劣化プロセスは、排卵前に卵母細胞が老化した卵巣の微小環境にさらされることによって発生する可能性があります。 さらに、女性の配偶子は、受精プロセスが最適な期間内に起こらない場合、排卵後の老化にさらされることが多く、受精していない卵母細胞が受精前の卵管または体外に長期間留まります [6] の障害卵母細胞の品質は、生殖補助技術 (ART) の失敗に関連する重要な要因です。なぜなら、その品質は受精後の胚の発育能力の主な決定要因だからです [7,8]。 排卵の非同期性と老化した卵母細胞は、重要な経済的損失を意味する、牝馬、牛、および羊の人工授精および胚生産プログラムの成功を損なうことがしばしば報告されています[1,9,10]。 したがって、卵母細胞の老化の根底にあるメカニズムを研究することは、人間を含むいくつかの種の生殖能力を救うためのより良い治療アプローチを設計するために、また家畜の遺伝的改善のためのツールとしても非常に重要です。シスタンシェ・ウィルクング思春期前のウシの卵母細胞の発育能力の改善には、特に注意を払う必要があります。これは、遺伝的獲得を促進し、世代間隔を短縮するためによく使用されます。
老化した卵母細胞の発達障害の主な原因の 1 つは酸化ストレスの増加であり、これはミトコンドリア機能障害、DNA 損傷、紡錘体形成エラーを誘発し、卵母細胞の質に影響を与えます [1]。 フリーラジカルの生成の増加が、いくつかの慢性疾患や生殖生物学における細胞老化の原因であり、生殖能力の低下につながることは十分に確立されています [12]。 卵母細胞と顆粒膜細胞 (GC) を含む卵巣の微小環境は、酸化状態を調節し、酸化剤/抗酸化剤のバランスを維持できる抗酸化防御メカニズムを提供します [13]。 ただし、老化の過程で、活性酸素種 (ROS) を中和する抗酸化防御の効率が低下するため、酸化ストレスのレベルが上昇します。 Nrf2/Kelch 様 ECH 関連タンパク質 1 (Keap1) 経路としても知られる核因子 E2- 関連因子 2 (Nrf2 または NFE2L2) は、酸化ストレスによって活性化される優性応答カスケードです [14]。 この経路は、細胞が酸化ストレスの有害な影響に対処するために開発した細胞防御メカニズムです。 通常の条件下では、Nrf2 は Keap1 によって負に制御され、細胞質に保持され、低レベルに維持されます。 オキシダントにさらされると、Nrf2 は Keap1 から解離し、特定の DNA 配列に結合する核内での移行が可能になります。 抗酸化応答要素 (ARE) と名付けられたこれらの配列は、NAD(P)H: キノン酸化還元酵素-1 (NQO1)、ヘムオキシゲナーゼ-1 (HMOX1) などの細胞保護遺伝子の転写活性化につながります。 、およびグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット (GCLC) [15,16]。 以前の研究では、Nrf2-Keapl シグナル伝達経路の活性化が、ヒト GC およびマウス卵巣の抗酸化レベルを上昇させることにより、酸化ストレスによる損傷を減少させることが示されました [17,18]。 ただし、ミトコンドリアがこのプロセス中の ROS の主要な生産部位であることは明確に確立されていますが、女性配偶子の老化プロセスにおけるその役割はとらえどころのないままです [9,10]。
ニシンはアンチエイジングできる
逆に、ミトコンドリアはいくつかの重要な細胞機能に関与しており、卵母細胞の成熟とその後の胚発生中に必要なエネルギー生産の需要を満たすために不可欠です [19]。 有能なミトコンドリア活性は、ミトコンドリア DNA (mt-DNA) のより高い含有量と ATP 生成 [20]、より高いミトコンドリア膜電位 [21]、およびミトファジーによるミトコンドリアの質と量の維持 [22] と強く関連しています。 さらに、ミトコンドリアの活性は、胚の生存率と受精率の向上と直接相関していることが示唆されています [23]。 加齢に伴うミトコンドリアの変化が卵巣の老化を引き起こし、その後胚の生存率と着床の可能性が低下することを裏付ける証拠が増えています。 これらの変化には、mt-DNA コピー数の減少、ATP 生成の減少 [20]、ミトコンドリア遺伝子発現の変化 [24、mt-DNA 損傷 [25]、およびミトコンドリア膜電位の低下 [26] が含まれます。
ミトコンドリアを標的とした治療アプローチは、ミトコンドリア機能を高める大きな可能性があるため、老化に関連するいくつかの病状に大きな関心を集めました [27]。 この枠組みの中で、ウロリチン A (UA) (ザクロなどの食物の摂取とそれに続く腸内微生物叢による変換後に得られる天然の代謝産物) は、加齢に伴う機能不全のミトコンドリアの蓄積を防ぎ、ミトファジーを誘発し、ミトコンドリアを維持することが実証されています。生合成と呼吸能力[28,29]。 UAは、結腸直腸がんや前立腺がんなどの一部のがんを予防するための有望な治療薬として適用されています[30,31]。 さらに、UA には抗炎症作用 [32]、抗肥満作用 [33]、抗酸化作用 [34]、老化防止作用 [35] もあります。シトラスバイオフラボノイド最近の研究では、老化したヒト皮膚線維芽細胞への UA 補給が Nrf2-Keapl 経路の活性化に及ぼす影響が強調されており、抗酸化能力が強化されています。 この Nrf2-Keapl 経路の活性化は、Nrf2 下流の ARE 応答遺伝子 (SOD、NQO1、GCLC、および HMOX1) の発現のアップレギュレーションを通じて、ROS レベルを効果的に緩和し、有望なアンチエイジング効果を示しています [ 35]。
卵巣の老化を遅らせ、その結果、卵母細胞の質と生殖能力の結果を改善することを目的として、いくつかの研究が実施されています。 酸化ストレスが卵巣の老化プロセスやミトコンドリアの機能不全に寄与しているため、抗酸化物質の補給が有望な治療法として登場しています [36,37]。 しかし、ウロリチン A の補給が、不妊症の予防に寄与する卵巣の老化中に発生する損傷を回復させるかどうかは不明です. したがって、この研究の目的は、(1) 老化が卵丘-卵母細胞複合体 (COC) の発生能および Nrf2 シグナル伝達経路に関与する重要な遺伝子の GC の発現を変化させる可能性があることを実証すること、(2) UA がレスキューできるかどうかを判断することでした。老化したCOCおよびGCでアンチエイジング効果を示す女性の生殖能力; （3）Nrf2シグナル伝達経路に関与する遺伝子の発現レベルおよび卵母細胞の品質に対するUAの影響を評価する。
2。材料と方法
2.1. 実験計画
この研究は、欧州連合のガイドライン (no.86/609/EEC) に従って、国家獣医局の動物管理委員会 (N 度 08965DGAV) によって承認されました。 卵母細胞の質の変化に対する老化の影響と UA の潜在的なアンチエイジング効果を調査するために、思春期前および成熟した牛から収集した COC を使用したモデルを、体外老化 (30 時間の成熟) または生理学的成熟 (22 h) プロセスが適用された。
2.1.1.以前のアッセイ - 用量反応研究
ウシ COC 成熟プロセス中に使用する必要がある UA の濃度を決定するための以前のアッセイは、4 つのセッションでの用量反応研究に基づいて実行されました。 UAはウシの卵母細胞でテストされたことがないため、以前の用量は、いくつかの癌の予防と軽減にうまく適用され、さまざまな細胞株でUAのアンチエイジング効果を実証するために使用されました[28,39]。 思春期前および成熟した成牛 (n=978) から得られた COC を選択し、ランダムに 5 つのグループに分けて、さまざまな用量の UA をテストしました。 成熟期間の後、いくつかの卵母細胞 (n=154) を染色して、染色体の構成と成熟段階を決定しました。 残りの成熟卵母細胞は、凍結／解凍精液を用いたインビトロ授精にかけられた。 推定接合体を培養し、卵割率と胚盤胞率をそれぞれ培養 2 日目と 7 日目に測定しました。 得られた結果、すなわち有害な影響がなく、成熟と胚盤胞の発達が促進されるという結果に基づいて、1 uMの濃度のUAが選択されました。
2.1.2.実験1
この実験では、思春期前の COC (平均年齢=9 か月、n=660) と成人 (平均年齢 =39 か月、n=674) の両方の COC を 6 つのセッションで実施しました。卵母細胞の品質と、老齢および生理学的に成熟した卵母細胞の発達の可能性、および女性の生殖能力を救うためのUA効果を評価するために、牛が収集されました。 COC は 8 つのグループに無作為に分けられました: (1) 思春期前の対照グループ、22 時間成熟した思春期前の子牛からの COC (n=148);(2) UA 思春期前のグループ、1 μM の22 時間の UA (n=155);(3) 思春期前の 30 時間前のグループのコントロール、30 時間経った思春期前の子牛の 30 時間経った思春期前の子牛からの COC (n=149);(4) 30 時間の UA思春期前群、1 μM の UA(n=144) を添加した成熟培地で 30 時間インビトロで熟成させた思春期前の子牛からの COC;(5) 成体対照群、22 時間成熟させた成牛からの COC (n=155 );(6) UA 成牛群、1 uM の UA を添加した培地で 22 時間成熟させた成牛の COC (n=129);(7) 30 時間齢の対照群、成牛からの COC 30 時間の in oitro 成熟 (n=148); および (8) 30 時間齢の UA 成体群、1 uM の UA(n=138) を添加した成熟培地で 30 時間 oitro で熟成させた成牛の COC。シナモリウムの利点それぞれのインビトロでの成熟期間の後、卵母細胞は、解凍した受精能を持った雄牛の精液で授精された。 その後、胚の発生を評価し、切断された胚と生産された胚の両方の割合、およびそれらの品質を評価しました。
さらに、この実験では、核成熟段階を評価するために各グループから COC が取得されました (対照の思春期前のグループ、n=7; UA の思春期前のグループ、n =7; 30 時間の思春期前の対照グループ、n{ {3}}; UA 年齢 30 時間の思春期前グループ、n=6; コントロール成人グループ、n=16; UA 成人グループ、n=21; コントロール年齢 30 時間成人グループ、n{ {9}}; UA 年齢 30 時間の成人グループ、n=18) COC のミトコンドリア膜電位 (MP) も評価されました (コントロールの思春期前グループ、n=10; UA 思春期前グループ、n{ {13}};コントロール 30 時間の思春期前グループ、n=9;UA 年齢 30 時間の思春期前グループ、n=9;コントロール成人グループ、n=15; UA 成人グループ、n{ {19}}; コントロール 30 時間の成人グループ、n=10;UA 30 時間の成人グループ、n=14)。
2.1.3.実験2
GC は卵胞の成長と卵母細胞の発達に重要な役割を果たすため、NFE2L2、NQO1、および mt-ND5 の発現に対する年齢と UA の影響をさらに研究するために、2 回目の実験を 5 つのセッションで実施しました。 mt-ND5遺伝子のコピー数も評価した。 GC は、思春期前の卵巣 (平均月齢=10 か月) および成牛 (平均月齢 =62 か月) の卵巣から吸引された卵胞液の遠心分離後に得られました。 これらの細胞は、次の条件で培養されました。（1）思春期前のコントロール、思春期前の子牛のGCの培養。 (2) 思春期前 UA、1 μM UA を補充した思春期前の子牛の GC の培養。(3) 成体対照、成牛の GC の培養。 （４）成人ＵＡ、１μＭのＵＡを補充した成牛のＧＣの培養物。 培養 5 日目に GC が合流した後、それらは液体窒素でスナップ凍結され、その後 DNA と RNA が抽出され、その後 NFE2L2、NQO1、および mt-ND5 mRNA 転写産物と mt-ND5 コピー数の定量化が可能になりました。
2.2. 採卵と体外成熟
成牛および思春期前の牛の卵巣 (以前のアッセイ、n {{0}} および実験 1、n=1334) は、地元の食肉処理場で収集され、35-37 度で維持されました。 0.15 パーセントのウシ血清アルブミン (w/v、BSA) を添加し、0.05 mg mL-l のカナマイシンを添加したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。 実験室では、直径 2-8 mm の卵胞が 19- ゲージ針で吸引されました。 少なくとも 3 層のコンパクトな卵丘細胞と均一なオープラズムを含む COC のみを洗浄し、実験計画に従って成熟用に選択しました。砂漠のヒヤシンス成熟は、10%のウシ胎児血清、0.2mM ナトリウムを含む組織培養培地 199 (TCM) で構成される成熟培地で、加湿空気中 38.8 度、5% CO2 のインキュベーターで 22 または 30 時間行われました。ピルビン酸、10 ng mL-l の上皮成長因子、および 10 μL mL-l のゲンタマイシン【40】。
2.3.顆粒膜細胞の収集と培養
顆粒膜細胞は、200 x g で 10 分間遠心分離した後、回収された卵胞液から得られました [41]。 ペレットを 1 mL の培地 (TCM199 プラス 10% 血清) に懸濁し、さらに 5 分間遠心分離を行いました。 新しいペレットを、実験計画に従って１μＭのＵＡを補充したかまたは補充しなかった１ｍＬの培養培地に再懸濁し、細胞を分離するために少なくとも３０回、１９Ｇ針に取り付けた注射器でホモジナイズした。 GC の生存率 (トリパン ブルー色素、0.4 パーセント w/v) を評価した後、細胞を 2 x 105 生存細胞 mL-1 の濃度で播種し、38.8 度、5 パーセント CO2 の加湿環境で 5 日間培養しました。合流までの雰囲気。 48時間ごとに培地を排出し、新しいものでリフレッシュしました。 DNA および RNA 抽出のために、GC を収集し、200 x g で 10 分間遠心分離して洗浄しました。 細胞ペレットを 1 mL の PBS に再懸濁し、すぐに液体窒素で瞬間凍結し、-80 度で保存しました。
2.4. 卵母細胞の核成熟
核成熟段階は、体外成熟の 22 時間または 30 時間後に評価されました。フラボノイド抽出法pdf露出した卵母細胞を酢酸/エタノール (1:3、v/v) 溶液で固定し、4 度で 48 時間維持しました。 次に、卵母細胞を 1% アセトラクノイド溶液で染色し、Neubauer チャンバーにマウントし、位相差顕微鏡 (Olympus BX41) で観察しました。 卵母細胞は次のように分類されました: 胚胞 (GV)、凝縮染色体 I (CCI)、凝縮染色体 II (CCII)、ダイアキネシス、後期 I/終期 I (AI/TI)、および MII (中期 II) . クロマチン染色が見られる卵母細胞のみが考慮された[42]。
2.5。 ミトコンドリア膜電位の評価
ミトコンドリア活性の指標であるミトコンドリア膜電位 (MP) を測定するために、ミトコンドリアを 5, 6, 6'-テトラクロロ -1, 1', 3, 3' テトラエチルベンズイミダゾールカルボシアニン ヨージド (JC-1 、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）。 むき出しの卵母細胞を 5 ug mL-l の JC-1 [37] とともに成熟培地で 30 分間、38.8 度、5% CO2 の加湿空気中、暗所でインキュベートしました。 卵母細胞を PBS で 2 回洗浄し、すぐに予熱したスライド ガラスに移し、青色蛍光フィルター (BP 470-490 対物レンズ UPlanFI 20x/0.50) を使用して蛍光顕微鏡 (Olympus BX51) で観察しました。 次に、ミトコンドリア膜電位は、Image]ソフトウェア（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国）を使用して、測定された赤/緑蛍光の比として計算されました。 2.6.体外受精と胚培養
体外受精は、2 x 10 度の精子 mL-4.COCs の濃度で、Percoll 勾配 (45 および 90) メソッドを使用して以前に受精能獲得に提出された、ホルスタイン種雄牛の凍結融解精子で実施されました。精子は 38.8 度、5% CO2 の加湿空気中で 20 時間共培養されました。 次に、推定接合体を、BME および MEM アミノ酸、グルタミン、グルタチオン、BSA を添加した合成卵管液 (SOF) 培地の液滴に移しました [40]。 授精の 48 時間後、分割率 (全授精卵母細胞あたりの分割胚) を通過し、分割胚は、BSA および 10% のウシ胎児血清 (FBS) を添加した SOF で維持されました。 胚を 12 日間培養し [41,43]、胚盤胞発生率 (7、9、および 12 日目; 切断された胚あたりの D7 胚) および孵化した胚率 (D7 胚あたりの孵化した胚) およびそれらの品質を評価した [43]。 7 日目の胚は、グレード 1 (良い品質)、2 (普通の品質)、およびグレード 3 (悪い品質) に分類されました [4]。
2.7.DNA および RNA の抽出と定量化
製造元の指示に従って、High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche、バーゼル、スイス) および PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) をそれぞれ使用して、GC から全 DNA および RNA を分離しました。 これらのプロトコルには、RNA からゲノム DNA を除去するための処理として、高品質の全 DNA と RNA および DNase を分離するために使用されるスピンカラムの使用が含まれていました [40]。 抽出後、サンプルは-80度で保管されました。 DNA および RNA の濃度と品質は、NanoDropTM One/OneC 分光光度計 (ThermoFisher ScientificTM、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して測定しました。
2.7.1. 相補的 DNA 合成
RNA 分離株からの相補的 DNA (cDNA) の合成は、Xpert cDNA Synthesis Mastermix キット (GRiSP、ポルト、ポルトガル、製造元の指示に従って) を使用して実行されました。RNA は、cDNA 合成を実行するために各サンプルから抽出された RNA 500 ng を使用して逆転写されました。 2.7.2. プライマーの設計
この研究では、標的遺伝子 (NFE2L2 および NQO1) および内因性制御遺伝子 (6- アクチン) のプライマーは、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) のプライマー BLAST ソフトウェアを使用して設計されました (http://www .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/、2020 年 3 月 6 日にアクセス)。 参照遺伝子と標的遺伝子のプライマーの配列を表 1 に示します。さらに、この研究では mt-ND5 遺伝子が使用され、mt-ND5 プライマーに関する詳細は以前の研究から取得されました [45]。
2.7.3.定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
リアルタイム PCR 分析は、25 ng uL-1 の濃度の cDNA を使用して、QuantStudio 3 サーモサイクラー (ThermoFisher ScientificTM、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) で Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X と ROX を使用して実行されました。 ND5 遺伝子のミトコンドリア DNA (mt-DNA) コピー数の評価は、遺伝子の定量化と同じ装置を使用して、以前に抽出した DNA を介して qPCR によって実行されました。 ROX を含む Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X、各ターゲット遺伝子のプライマー (フォワードおよびリバース)、サンプル (cDNA/DNA)、および RNase フリー水で構成され、合計 10 μL の各最適化された反応が実行されました。 サンプルを二重に分析し、テンプレートの代わりに水を含む反応を陰性対照として含めました。 サンプルを、９５度で２分間の変性段階の最初のサイクル、続いて９５度で５５秒間の４０回の変性サイクル、６０度で３０秒間の４０回のアニーリングサイクルからなる増幅プロトコルにかけた（プライマー配列)、および 30 秒間 72 度での伸長期、そして最後に 72 度で 10 分間の最終伸長期。
遺伝子発現の定量化には、相対定量法を使用しました。 遺伝子発現の相対定量化のこの方法は、CT比較法によって、ハウスキーピング遺伝子で正規化された研究中の標的遺伝子の発現レベルで実施されました。 RT-qPCR による増幅が重複して実行されたため、各遺伝子の平均 CT 値が決定され、次の式を使用して発現レベルが計算されました。
ここで、△Ct=Ct ターゲット遺伝子 -Ct 内因性コントロール遺伝子。
コピーのmt-DNA数の定量化には、単位質量法に対して正規化された相対定量化が使用されました。 このメソッドは、UA で処理された GC の CT 値 (テストと呼ばれる) を使用して実行され、コントロール サンプル (現在はキャリブレーターとして指定されています) で正規化されています。 mt-ND5 コピー数が qPCR によって評価され、重複して実行されたため、テストおよびキャリブレータ サンプルの平均 CT 値が決定され、次の式を使用して比率が計算されました。
ここで、△Ct=Ct キャリブレータ-Ct テスト、E は効率です。
この記事は、Animals 2021 年 11 月 2048 号から抜粋したものです。
