多くの研究により、アレルギー疾患は自然免疫の活性化だけではないことが確認されています 2
Sep 01, 2022
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3. ディスカッション
アトピー性皮膚炎 (AD) の病因は完全には理解されていませんが、この疾患は、皮膚バリア機能障害における異常な免疫グロブリン E (IgE) 免疫応答によって媒介されます。 その中でも、マスト細胞(MC)は、ADを含むIgE媒介性アレルギー疾患を引き起こす可能性があります。 マスト細胞が活性化されると、膜に結合した細胞質粒子を放出し、さまざまな分子が放出されます。 これらの分子は、AD の病因と宿主防御において重要な役割を果たします [27]。 マスト細胞の活性化または脱顆粒を阻害すると、さまざまな IgE を介した過敏反応を調節するのに役立つため、マスト細胞は抗アレルギー薬を探索するための理想的な標的の 1 つです。 私たちの研究では、マスト細胞は、化合物 48/80 とカルシウム イオノフォア A23187、および抗 DNP/IgE と DNP/HSA に応答して脱顆粒されます。 参考文献はマスト細胞の脱顆粒効果を効果的に阻害し、その抗アレルギー反応を示すことがわかりました。 さらに、細胞内カルシウムの増加およびMAPKの活性化は参照により阻害された。 さらに、DNCB によって引き起こされる皮膚マスト細胞の浸潤と、化合物 48/80 によって引き起こされる引っ掻き行動も減少しました。 したがって、ネフェリンの抗アトピー性皮膚炎のメカニズムは、ケラチノサイトとマスト細胞に相乗効果をもたらします。
La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variantad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la pategénesis de la EA y la defensa del huésped [27]。 Debido a que la inhibición de la activaciono desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hypersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideaes para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y alionoforo de calcio A23187, y 抗 DNP/IgE プラス DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activacion de MAPK fueron inhibidos por referencencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tieene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.
組織に見られるマスト細胞の細胞質は、あらかじめ形成された炎症メディエーターの大きくて密な粒子で満たされています[28]。 マスト細胞の分泌顆粒からこれらのメディエーターを放出するプロセスは、脱顆粒と呼ばれます。 マスト細胞の脱顆粒を阻害すると、さまざまな IgE を介した過敏反応を調節できるため、マスト細胞は抗アレルギー薬を探索するための理想的な標的の 1 つです [29,30]。 私たちの結果は、抗原、受容体刺激因子、またはイオノフォアの使用に関係なく、参照がマスト細胞の脱顆粒に非常に良い効果があることを示しています。 これは、リファレンスが潜在的な抗アレルギー剤であることを示しています (図 2)。
すべての事前に保存された顆粒、新しく合成されたメディエーター、さらには顆粒とそのコンポーネントを MC 活性化インジケーターとして使用できます [31]。 さらに、標準的な方法は、細胞内 Ca4t 濃度の測定です。 実験室で一般的に使用されている MC 分泌促進物質 (抗原、化合物 48/80 など) のほとんどは、細胞内 Ca2+ 濃度の増加を引き起こしました。 実際、細胞内 Ca2+ 濃度の増加も MC 脱顆粒を引き起こす可能性があります。 通常、細胞内 Ca4t の増加は、タプシガルギン (具体的には Sarco/小胞体 Ca2 プラス ATPase、SERCA をブロックする) ポンプおよびイオノフォア (すなわち、イオノマイシンおよび A23187) などの化合物で MC を活性化することによって誘導される [32,33]。 したがって、Ca2t 依存性 MC 活性化では、Ca2t 流入の測定も MC 活性化条件を決定する方法と見なされます。 MC 研究では、Fura-2 は細胞内 Ca2 プラス変化の測定に広く使用されています。 私たちの実験では、活性化マスト細胞の蛍光強度は、リファレンスで処理した後に大幅に抑制されることがわかりました (図 3)。 以前の報告では、細胞内 Ca4t 濃度の増加はヒスタミンの放出に応じていることが示されました [34]。 したがって、参照の処理によってヒスタミンの放出も抑制されると推測されます。 この仮説を検証するには、さらなる実験が必要です。
マスト細胞は、大きく異なる機能出力を持っています。シスタンケ投与量redditこれらには、脱顆粒、アラキドン酸前駆体の形成、走化性、およびサイトカイン産生が含まれ、興奮剤に関係なく、すべてカルシウムシグナルにある程度依存しています [32] 活性化された MC は、アレルギーや炎症性疾患の主な媒介物質であるサイトカインを放出します [ 35]。 活性化マスト細胞によるサイトカインの産生は、これらの細胞におけるサイトカイン遺伝子転写の誘導の結果です。 マスト細胞の刺激は、NF-kB および AP-1 の活性化と、多くのサイトカインの産生につながります [36]。MAPK カスケード シグナル伝達経路は、サイトカインの発現の調節において重要な役割を果たします。 PI による PKC の活性化によるこれらの経路の活性化は、IL-1、IL-6、および TNF などの炎症性サイトカイン遺伝子を含むさまざまな遺伝子の活性化をもたらします [37]。 私たちの最近の研究は、参照がケラチノ サイトの活性化によって放出されるサイトカインを阻害できることを示しています。 同時に、MAPK の経路活性化も参照の処理によって阻害されることもわかりました [18]。 私たちの現在の研究では、参考文献がマスト細胞におけるMAPK活性化の阻害を通じてサイトカインの発現を減少させる可能性があることを示しました(図4および5)。 MAPK 活性化の阻害により、NFkB の活性化も低下します (図 6)。
ニシンはアンチエイジングできる
多くの研究で、AD 患者のさまざまなサイトカインが上昇し、ケラチノサイトによって分泌されるサイトカインや Th2- 由来のサイトカインなど、皮膚バリア機能不全につながることが報告されています [38,39]。 さらに、これらの分泌されたサイトカインは、フィラグリン (FLG)、ロリクリン (LOR)、およびインボルクリン (IVL) を含むタイトジャンクション (T] タンパク質および最終分化遺伝子の発現をダウンレギュレートすることもできることが報告されている [39,40 ](プロ) フィラグリンの発現は AD で減少し、逆に MC トリプターゼおよび IL-6 と関連しています [41]。 IL-1 は、皮膚バリアが損なわれたマウスの慢性炎症を媒介します [35]。 以前の研究では、NC/Nga マウスの背部皮膚に DNCB を塗布した後、FLG、IVL、および LOR の発現がダウンレギュレートされることが報告されました [42,43]。 本研究では、FLG、IVL、および LOR の発現は、対照群の背部皮膚でかなり減少しており、これは表皮バリアが損なわれていることを示しています。 参照の投与は、DNCB の治療後に FLG、IVL、および LOR の発現の減少を大幅に回復しましたが、参照の投与は、対照群と比較して IVL および LOR の発現をわずかに増加させました (図 8)。 化合物 48/80 は、皮膚マスト細胞の効果的な活性化剤であることが知られています。 化合物 48/80 によって刺激される皮膚反応は、マスト細胞からヒスタミンを放出することにより、引っ掻き行動を誘発する可能性があります [44]。 活性化されたマスト細胞から放出されるヒスタミンは、化合物 48/80 によって引き起こされる血管透過性の増加に重要な役割を果たします。 ヒトのかゆみ時には、さまざまな刺激によってマスト細胞から放出されるヒスタミンも考えられます。 重要なメディエーターになることができました。 したがって、マスト細胞の脱顆粒を阻害することは、ひっかき行動中のヒスタミン放出を調節する重要なステップです。 この研究化合物では、48/80 が皮膚マスト細胞の効果的な活性化を引き起こしました。 ただし、リファレンスを使用した前処理により、マスト細胞の脱顆粒レベルが大幅に低下しました (図 2)。シスタンシェ抽出物の利点これらの結果は、リファレンスのアンチスクラッチ行動効果が、マスト細胞の脱顆粒を調節することによる血管透過性の低下による可能性があることを示しています (図 9)。
AD患者は、皮膚バリア機能障害、皮膚炎症、またはその両方を患っていることが一般的に確立されているため、適切な治療法を見つけることは困難です. したがって、通常は併用療法が推奨されます。 私たちの最近の研究は、免疫調節機能とバリア修復能力を決して持っていないことを証明しました. したがって、今後のAD治療において参考となる重要な特徴は、皮膚機能の維持と皮膚の水分補給とバリア修復の改善です。 参照は、アレルゲンや刺激物によって引き起こされる引っ掻き行動を減らすこともできます. また、アトピーマーチは段階的に発生・進行する現象性疾患です。 アトピー性皮膚炎は乳幼児期に多く見られます。 食物アレルギーは、1-2歳以降に発生することがよくあります。 アレルギー性鼻炎は、多くの場合、学校の前後に始まります。 喘息の症状はさまざまな時期に現れますが、ほとんどはアレルギー性鼻炎の後です。 小児期を過ぎると、アトピー性皮膚炎や特定の食物アレルギーが改善または消失することがあります。 アレルギー性鼻炎と喘息は簡単には治りません[45,46]。 したがって、それらは病気の併存現象です。 参照を含む天然物は併存疾患の治療の可能性があり、関連疾患におけるそれらの有効性は将来的に研究する価値があります.
4.材料と方法
4.1.ラット好塩基性白血病細胞
ラット好塩基球性白血病細胞 (RBL-2H3) は、台湾桃園市長庚大学の TLHwang から寄贈されました。 RBL-2H3 細胞は、抗原またはカルシウム イオノフォアによる脱顆粒、細胞内 Ca4t、およびシグナル伝達の研究に使用される粘膜マスト細胞です [29]。 細胞は、ペニシリンとストレプトマイシンを含む 10% FBS を含む EMEM で 37 度、5% CO2 で培養されました。 Iscove 改変ダルベッコ培地 (IM) およびウシ胎児血清 (FBS) は、Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM、ニューヨーク、ニューヨーク、米国) から購入しました。
4.2.MTT アッセイ
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム ブロマイド (MTT) アッセイを使用して測定細胞の代謝活動。 RBL-2H3 細胞を 24- ウェル培養プレートに 5 × 10 プラス / ウェルで播種しました。 24時間の薬物処理後、ウェルあたり30μLのMTIを添加し、37度の細胞インキュベーターに2-4時間置いた後、紫色のホルマザン結晶をDMSOで溶解しました。 ELISAリーダーを使用して、細胞生存率試験として波長550 nmでの吸光度を測定しました。
4.3.細胞内Ca2+レベルの測定
[Ca2t] I は以前に記載されたように fura-2 で測定した [47]。 30分。 Fura-2 をロードした後、ケラチノ サイトをペレット化し、新鮮な DMEM に再懸濁しました。 アリコート (2 mL) を、1.2 mM CaCl2 を含む撹拌キュベットに移しました。Fura-2- Ca 蛍光を、PerkinElmer LS{{19 }} 分光蛍光光度計 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences)。 データは 5 秒間隔で記録されました [47]。
4.4. 定量的ポリマー連鎖反応 (qPCR)
RBL{{0}}H3 細胞を 3.5 cm 培養皿に植えました。 細胞が 90% まで増殖した後、細胞を静的な状態で 24 時間増殖させました。 細胞を基準で20分間前処理した後、TNF-α/IFN-γでそれぞれ1時間または24時間刺激した。 細胞を掻き取り、遠心分離（１６、｛｛１２｝｝×ｇ、１０分、４度）し、上清を抽出した。 全ＲＮＡ単離キット（ＧｅｎｅＤｉｒｅｘ（登録商標）、ベガス、ネバダ州、米国）を使用してＲＮＡを精製した。 script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD) の操作手順に従い、試薬を順番に添加し、示された条件に従って操作して RNA を cDNA に変換しました。さらに、PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) を使用しました。 合計７．５μＬのｄｄＨ２Ｏ、２μＬのｃＤＮＡ、０．２５μＬのフォワードおよびリバースプライマー、および１０μＬのＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮを添加し、均一に混合した。 プライマー配列を表 1 および 2 に示します。次に、ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System を使用して RNA を定量しました。
4.5. ウエスタンブロットアッセイ
ウェスタンブロッティングは、細胞内のさまざまなタンパク質の変化を分析するために使用されます。 RBL{{0}}H3 細胞を 3.5 cm 培養皿に播種しました。 細胞が 90% まで増殖し、24 時間飢餓状態になった後、参照で 20 分間前処理し、次に TNF-α または IFN-γ でそれぞれ 30 分間または 1 時間刺激しました。 掻き取った後、超音波で粉砕し、遠心分離 (13,200 rpm、10 分、4 度) しました。 遠心分離後、上清を取り、タンパク質をPierceタンパク質アッセイキット（Pierce、Rockford、IL、USA）で定量化しました。 これを10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、PVDFメンブレンで電気穿孔した。 転写が完了した後、PVDF メンブレンを 5% 脱脂粉乳を含む TBS-T (Tris 緩衝生理食塩水/0.05% tween 20) 溶液に入れ、非特異的結合を避けるために 1 時間振とうしました。 次に、TBS-Tを使用して、各回10分間、3回洗浄しました。 次に、一次抗体 (1:1000 希釈) を加え、4 度で一晩置き、10 分ごとに TBS-T で 3 回洗浄しました。 二次抗体 (1:1000 希釈) を 1 時間添加した後、PVDF 膜を TBS-T で 10 分間ずつ 3 回洗浄しました。 最後に現像液を加え、メンブレンを化学発光抽出装置（バイオステップ・セルビン）にセットして撮影した。
4.6.ジニトロクロロベンゼン(2,4-ジニトロクロロベンゼン、DNCB)はマウスでアトピー性皮膚炎様皮膚炎症を誘発した
まず、マウスを 4 つのグループに分けました: コントロール グループ、DNCB グループ (陰性グループ)、参照 (3 mg/kg および 10 mg/kg) と DNCB グループ、およびデキサメタゾン (0.2 mg/kg) とDNCBグループ（陽性グループ）。 デキサメタゾンは、腫れやアレルギー反応を抑えることができるコルチコステロイドホルモンです。 この in vivo 実験では、リファレンスとデキサメタゾンの両方が DMSO に溶解され、一方、DNCB は超音波衝撃によって 75% エタノールに溶解されました。 前者は腹腔内注射で投与し、後者は背中の皮膚に100μL、右耳に20μLを塗布した。 実験の 3 日前に、マウスに麻酔をかけ、背中の毛を取り除き、小さな測定用磁石 (SCT-MAG-TF) をマウスの後足の裏に埋め込んだ。チンギス・ハン3日間安静にした後、マウスの体調が良好で、背部脱毛部位の皮膚が正常であることを確認し、実験を開始しました。 実験中、皮膚の外観変化を記録するために写真を撮った。 最初の段階 ({{0}} 日) は、アレルギー性アトピー性皮膚炎の期間でした。 ＤＮＣＢ群、基準（３および１０ｍｇ／ｋｇ）およびＤＮＣＢ実験群、デキサメタゾン０．２ｍｇ／ｋｇおよびＤＮＣＢ実験群のマウスの基礎値を測定した後、１％のＤＮＣＢを背中の皮膚に均等に塗布し、右耳。 5日目に、薬物基準とデキサメタゾンを腹腔内注射した。 第 2 段階 (5 日目から 14 日目) は、アトピー性皮膚炎の再誘発でした。シスタンシェ ライフエクステンション3 つの実験グループでは、0.5% の DNCB がマウスの背中の皮膚と右耳に均一に塗られました。 翌日、皮膚の生理学的値と写真を撮影して記録しました。 15日目にマウスを過剰な二酸化炭素(CO2)で安楽死させた後、その後の実験分析のために背部皮膚組織を取り出した。
4.7. 化合物 48/80- による BALB/c マウスのひっかき行動
マウスの背中の皮膚の毛を切り、20μLの化合物48/80溶液を皮内注射した。 対照マウスには、代わりに生理食塩水を注射しました。 注射直後に、動物を観察ケージ (直径 11 cm、MicroAct、Neuroscience、東京、日本) に入れ、マウスの引っ掻き行動を自動的かつ客観的に検出して評価しました。 スクラッチ動作は 60 分間測定されました。 MicroAct は、次の分析パラメーターを使用して、マウスの連続的な引っかき行動に対応する波を検出します: しきい値、0.05 V。 イベント ギャップ、0.05 秒; 最小持続時間、0.25 秒。 最大周波数、30 Hz; 最小周波数、5Hz。 4.8.統計分析
Sigma-Plot ソフトウェア (バージョン 10.0) を統計分析に使用しました。チスタンシェ nzデータは平均 ± SEM として表され、(*) および (#) は注記として示されています。 データの統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定によって分析されました。0 未満の p 値。05 および 0.01 は有意と見なされました。
5。結論
この研究では、参照がマスト細胞の脱顆粒を効果的に阻害し、アトピー性皮膚炎のような症状を軽減し、皮膚バリアを回復し、皮膚の引っかき傷を減らすことができる炎症誘発性サイトカインの発現を減少させることを決定しました. さらに、参照が皮膚のケラチノ サイトに作用するだけでなく、マスト細胞の活性化にも影響を与えることが証明されました。 アレルギー性皮膚疾患や炎症性皮膚疾患への応用の可能性がさらに広がります。
この記事は Int. Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms
