トランスクリプトームプロファイリングによるレオントポジウムアルピナム(エーデルワイス)カルス培養抽出物のアンチエイジング効果パート2
May 06, 2022
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2.9. 皮膚弾力性の測定
皮膚の弾力性は、キュートメーターMPA 580(Courage & Khazaka, Köln, Germany)を用いて分析した。試験のために直径2mmのプローブをこの装置に取り付けた。測定条件としてモード1または時間ひずみモードを用いた。次に、オンタイム2.0sおよびオフタイム2.0sをモード1条件(450bar)の指定された負圧に適用し、3回連続して測定を行った。R2(総弾性)、R5(正味弾性)、およびR7(生物学的弾性)の3つの異なるパラメータ値が測定された。
2.10. 真皮密度と皮膚厚さの測定
頬の真皮密度と皮膚厚は、皮膚の内層の変化を非侵襲的に観察するのに非常に有用な20MHzの超音速波を用いた高解像度イメージングマシンであるDermascan-C(Cortex Technology、デンマーク、ハズンド)を用いて分析した。我々の研究では、B走査画像を用いた。cistanche nzまず、超音速波の速度を20MHzに設定し、試験用の接触ゼリーを広げ、プローブを皮膚に対して直角に置き、わずかに押すと頬の面積が測定されました。皮膚の厚さおよび真皮密度は、Dermascan−Cソフトウェアシステムによって計算された。
シスタンチェはアンチエイジングが可能
顔の画像は、同じ光、高解像度のデジタルカメラ、写真家など、同じ撮影条件で撮影されました。その後、顔の画像からモアレ解析を用いて口角で顔浮きを調べた。皮膚のたるみが目立つ口角を試験領域として選択しました。画像を用いて、水平線と口の角に描かれた輪郭線との間の角度(R)を、画像解析ソフトウェア(ImagePro Plus、Rockville、MD、米国)を用いて計算した。
2.11.統計検定
対照サンプルと試験サンプルとの比較のために一元配置分散分析を実施した。結果は、平均および標準偏差(SEM±平均)で示した。p 値 p<0.05 (*),=""><0.01(*), and=""><0.001 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" declared="" statistically="" significant="" at="" the="" 0.05="" level.="" we="" used="" ibm="" spss="" statistics="" version="" 21.0="" (spss,="" chicago,="" il,="" usa)="" for="" the="" statistical="">
2.12. RNA-Seqおよび次世代シーケンシングのためのライブラリの準備
トランスクリプトーム解析のために、1ウェルあたり1×10°細胞の密度のHaCaT細胞を6ウェルプレートで24時間インキュベートした。その後、ヒトケラチノサイト細胞を終濃度1%LACCE抽出物で24時間処理し、モック条件(コントロール)を滅菌水で処理した。各条件について、3つの異なる生物学的試料を採取した。RNeasyミニキット(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)を用いて、製造元の指示に従って全RNAを抽出した。各サンプルから全RNAを抽出した後、製造元の指示に従って、TruSeq鎖mRNA LTサンプル調製キットによってRNA-Seq用の6つの異なるライブラリを調製した。6つの異なるライブラリは、イルミナのNovaSeq 6000システム(マクロゲン、ソウル、韓国)によってペアエンドシーケンシングされました。得られた生の配列データを、SRR9127735、SRR9127736、SRR9127737、SRR9127738、SRR9127738、SRR9127733、およびSRR9127734のそれぞれのアクセッション番号とともに、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)配列読み取りアーカイブ(SRA)データベースに寄託した。
2.13. 発現差遺伝子のマッピング、正規化、同定
各ライブラリから読み取った生の配列を、デフォルトのパラメータ(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)を持つBBMapアライナーを使用して、ヒト参照転写産物バージョンGRCh38(https://sourceforge.net/projects/bbmap/)にマッピングしました。bbmap を使用する。shオプションとして、各転写産物のキロベース百万(FPKM)値あたりの断片を計算しました。各条件から得られたFPKM値は、発現差遺伝子(DEG)の正規化と解析のためにDEBrowserに供された[19]。シスタンチェペニスサイズ1 未満の FPKM 値は削除されました。TMM正規化法と最も正確な型を用いたEdgeRを用いて、0.001未満の調整p値およびlog2変換されたフォールド変化が1つ以上あるに従って、発現差のある遺伝子を同定した。
2.14. 遺伝子オントロジー (GO)用語エンリッチメント解析
GO項エンリッチメント分析では、0.05未満の調整されたp値と0.5を超えるlog2変換されたフォールド変化に基づいてDEGを特定しました。その結果、22のアップレギュレーション遺伝子と13のダウンレギュレート遺伝子が同定された。各遺伝子セットは、デフォルトパラメータ(http:/cbl-gorilla.cs.Technion.ac.il/)を持つGORILLAプログラムを用いて濃縮解析を行った[20]。我々は、バックグラウンドセットとして11,290個の発現遺伝子を使用して、実行モードとして2つのランク付けされていない遺伝子リストを選択した。
3. 成果
3.1. エデルワイスからのLACCEの調製
図1に示すようにLACCEが得られた。簡単に言えば、エーデルワイス種子は、最初に滅菌され、発芽した(図1A)。発芽種子の葉からカルスを誘導し(図1B)、浮遊細胞培養を行った(図1C)。浮遊細胞をバイオリアクターで培養し、LACCEを大規模生産した(図1D)。シスタンチェパウダー培養細胞を回収し、さらなる研究のために凍結乾燥した(図1E)。LACCEは熱抽出により調製した。異なるLACCE濃度を、インビトロ(0.1%、0.5%、および1%)、インビボ(1%)、およびトランスクリプトーム(1%)分析の複数のアッセイに使用した。
図1.実験手順は、バイオリアクターを用いてエデルワイスカルスからレオントポジウム・アルピナム・カルス培養抽出物(LACCE)を得た。(A)エーデルワイスの種子を滅菌し、発芽させた。(イ)カルスはエーデルワイスの葉組織から誘導された。(ハ)誘導されたカルスは懸濁培養した。(D)得られた細胞をバイオリアクター内で培養した。(e)カルス細胞を回収し、大量に凍結乾燥した。
3.2. 抗老化剤としてのLACCEのインビトロ評価
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを実施し、LACCEによる処理後の細胞生存率を観察した。本研究では、以下の理由から初代ヒト皮膚細胞の代わりに不死化細胞を用いた。不死細胞株には、取り扱いが容易であること、安価であること、および材料の無制限の供給を含む多くの利点があります。シスタンチェサルサエキスさらに、ヒト組織の使用に関連する多くの倫理的問題をスキップすることができます。さらに、不死化細胞株は、RNA-シーケンシング(RNA-Seq)などの基本的な生物学的プロセスの研究に優先的に使用されます。2つの異なる細胞株、HaCaTおよびDetroit551を、3つの異なるLACCE濃度(0.1%、0.5%、および1%)で処理した。LACCEによる処理後のHaCaTおよびDetroit551細胞の両方の細胞生存率は、対照の細胞生存率に匹敵した(図2)。詳細には、HaCaT細胞の細胞生存率は、LACCEの濃度が増加するにつれて、98.61%(0.1%LACCE)から94.72%(1%LACCE)にわずかに減少した(図2A)。対照的に、Detroit551細胞の細胞生存率は、LACCEの濃度が増加するにつれて、95.99%(0.1%LACCE)から99.95%(1%LACCE)にわずかに増加した(図2B)。
図2.抗老化剤としてのLACCEのインビトロ評価は、細胞毒性および抗酸化活性を含む。MTTアッセイによるHaCaT細胞(A)およびDetroib551細胞(B)におけるLACCEの3つの異なる濃度(0.1%、0.5%、および1%)の細胞生存率。灰色のバーは、蒸留水で処理した細胞を示す。(ハ)HaCaT細胞を過酸化水素で処理した。3つの異なるLACCE濃度についての細胞生存率は、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイによって測定した。N-アセチルシステイン(NAC)を陽性対照として用いた。(d)異なるLACCE濃度の抗酸化活性をDPPHアッセイにより測定した。ビタミンC(Vit. C)を陽性対照として用いた*および**は、それぞれ0.05および0.01未満のp値で統計的有意性を示す。シスタンチェステム(e)過酸化水素で処理した各試料における細胞形態をメチレンブルー染色で可視化した。
さらに、過酸化水素(H2O2)誘導MTTアッセイを実施した。一般に、過酸化水素はネガティブコントロールと比較して強い細胞傷害(細胞生存率の42.52%)を引き起こしたが、細胞内の抗酸化物質であるN-アセチルシステイン(NAC)の添加は、過酸化水素(細胞生存率の60.24%)によって引き起こされる細胞傷害を阻害した。LACCEの濃度が上昇するにつれて、過酸化水素に応答して細胞生存率は45.54%(0.1%LACCE)から60.37%(1%LACCE)に増加した(図2C)。特に、1%LACCE抽出物に対する活性酸素種(ROS)阻害率は、NACのそれと同程度であった。また、メチレンブルーによる染色後にも細胞形態が観察され、LACCE由来の細胞生存率の増加を示した(図2E)。
次に、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカル消去アッセイを用いて抗酸化アッセイを行った(図2D)。DPPHラジカル消去活性は、LACCE抽出物の濃度が増加するにつれて、2.85%(0.1%LACCE)から20.47%(1%LACCE)に増加した。ビタミンC(14.05%)と比較して、0.1%および0.5%のLACCE濃度はいずれも低いラジカル消去活性を示し、LACCE抽出物の1%濃度はより高いラジカル消去活性を示した。
3.3.In 抗炎症剤としてのLACCE抽出物の体外評価
LACCEの抗炎症効果を調べるために、COX-2および誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)をコードする2つの炎症マーカー遺伝子の発現を、それぞれリアルタイムRT-PCRで定量した(図3A、B)。一般に、UVB照射は、炎症を誘発するタンパク質をコードするCOX−2遺伝子の発現をアップレギュレートした(図3A)。陰性対照と比較して、HaCaT細胞へのLACCEの添加は、COX-2遺伝子の発現を有意に抑制した。しかしながら、異なるLACCE濃度間で有意差はなかった。デキサメタゾン(Dex)を含有する陽性対照と比較して、LACCEは(0.1%〜1%)非常によく似た抗炎症効果を示した。iNOS遺伝子の発現は、DexおよびLACCEを含む陽性対照によって抑制された(図3B)。LACCE抽出物の濃度が上昇するにつれて、iNOS遺伝子の発現は徐々に低下した。
図3.リアルタイムRT-PCRによる抗炎症剤、保湿剤、および抗シワ剤としてのLACCEのインビトロ評価。UVB処理サンプルに応答した異なるLACCE濃度における2つの炎症マーカー遺伝子であるCOX2(A)およびiNOS(B)の相対発現を、リアルタイムRT-PCRによって測定した。デキサメタゾン(Dex)を陽性対照として用いた。灰色および青色のバーは、それぞれ、UVB処理なしおよびUVB処理を伴うHaCaT細胞を示す。(ハ)保湿効果の陽性マーカーであるAOP3の相対的発現は、異なるLACCE濃度で行った。(D)細胞増殖マーカーであるMMP−2の相対的発現は、UVBに応答して異なるLACCE濃度で。個々の遺伝子の発現をGAPDH遺伝子発現に正規化した*および*は、それぞれ0.05および0.01未満のp値で統計的有意性を示した。
この記事はGenes 2020, 11, 230から抜粋したものです。DOI:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes
