人間の皮膚の長寿のためのサブスタンス P ベースのハイドロゲルのアンチエイジングの可能性

キーワード:物質 カンゾウ; アンチエイジング効果; 抗炎症効果; 皮膚吸収; 人間の皮膚の 3D モデル。化粧品成分

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1.はじめに

肌の老化内部要因 (細胞代謝、ホルモン変化、遺伝子変異) や外部要因 (毒素、化学物質、紫外線 (UV) 放射) など、さまざまなプロセスによって発生します [1–3]。老化肌生物学的には、細胞外マトリックス (ECM) の成分が一般的に減少し、コラーゲンとエラスチンが乱れ、減少することを特徴としています [4,5]。 さらに、炎症現象通常は老化肌に誘発される、原因真皮のシワと肥厚と表皮. 炎症細胞から放出される炎症性メディエーターマトリックス メタロプロテイナーゼ (MMP) と呼ばれるコラゲナーゼの活性化を促進し、コラーゲンの分解を引き起こします [6–8]。 コラーゲン合成を促進する能力を持つ多くのアンチエイジング素材が最近提案されています. よく知られている材料の 1 つは成長因子です。 成長因子は、皮膚の創傷治癒のために広く研究されています [9]。 血小板由来増殖因子 (VEGF)、上皮増殖因子 (EGF)、ケラチノサイト増殖因子など、それらの多くは、細胞間および細胞内シグナル伝達経路のネットワークを介してコラーゲン合成に直接影響します [9,10]。 しかし、局所的に適用された成長因子は、分子サイズが大きく、タイトな角質層に浸透する能力が制限されているため、アンチエイジング剤としてはあまり役に立ちませんでした [11]. 成長因子に加えて、低分子量の多くのアンチエイジング ペプチドも開発されています。 例えば、パルミトイル トリペプチドは、MMP1 や 3 などのコラゲナーゼによるコラーゲンの減少を妨害することにより、コラーゲンの分解を防ぎます [12]。 さらに、最もよく調べられているペプチドである銅トリペプチドは、プロコラーゲン合成を刺激することが示されています [13]。

いくつかの研究は、成長因子とペプチドの局所適用によるコラーゲン合成の促進を示していますが、抗炎症効果のないコラーゲン合成の単一の効果は、アンチエイジングのパフォーマンスを臨床的に改善するのに十分ではないかもしれません. より明白な効果を得るには、化合物を皮膚の深層まで届ける必要があります。 そのため、コラーゲンの合成と抗炎症作用を併せ持ち、皮膚への吸収性を高める新素材の開発が強く求められています。 サブスタンス Cistanche (CP) は、11 個のアミノ酸からなる小さなサイズのペプチドであり、細胞増殖の誘導、コラーゲン合成、および抗炎症効果を介して発揮される、潜在的な創傷治癒活性を示します [14–16]。 しかし、CP の治療への応用は、安定性が低いために制限されており、治癒特性を遅らせる可能性があります [17–19]。 以前の研究では、CP ゲルとして知られる CP の新しい製剤を開発しました。これは、さまざまな保存条件下で CP の安定性を高めます [20]。 その安定性に加えて、CP ゲルはケラチノサイトと線維芽細胞の増殖を促進することにより、CP 単独よりも効果的な創傷治癒を示しています。 現在の作業では、CP ゲルの特性を拡張し、アンチエイジング パフォーマンスのためのコラーゲン合成の促進と抗炎症効果を実証しました。 CPジェルによる皮膚への吸収と色素沈着もさらに調べました。 私たちの調査結果は、CP単独よりもCPゲルのアンチエイジングの可能性が高く、皮膚吸収効果が増加しているため、化粧品の適用範囲が広いことを示しています.

2. 結果

2.1. CP ゲルの in-vitro 毒性

CP ゲルがアンチエイジング用途であるためには、人間の皮膚に対する低毒性と組み合わされた高活性が望ましいでしょう。 したがって、CP ゲルの in vitro 毒性は、ヒト皮膚線維芽細胞 (HDF) と再構築された 3D ヒト皮膚、keraskin®-FT を使用して評価されました。 最初に、HDF を使用した乳酸脱水素酵素 (LDH) アッセイにより、CP 単独の場合と比較して、細胞膜に対する CP ゲルの損傷効果を評価しました (図 1A)。 以前の3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル テトラゾリウム ブロマイド (MTT) に加えて、LDH アッセイをさらに使用しました。 CP ゲルのより正確な毒性測定のためのアッセイ [20]。 結果は、CP ゲルも CP 単独も、試験したすべての濃度で HDF に対する細胞膜損傷を示さないことを示しました。 さらに、CP を欠くビヒクルでの処理は、PBS のみを含む培地と比較して、細胞膜に影響を与えませんでした。 CP ゲルによる人間の皮膚への潜在的な刺激をさらにテストするために、CP ゲルをさまざまな濃度で、全層皮膚モデルの keraskin®-FT (図 1B、C) に合計 24 時間適用しました。 組織の生存率に対する影響を比較するために、既知の刺激物質である 5% のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を陽性対照として使用しました。 CP ゲル (1 ～ 10 µg/mL) は、MTT アッセイ (図 1B) で示されるように、keraskin®-FT に対して無毒であり、コントロール (PBS 処理) と比較して潜在的な皮膚刺激がないことを示しています。 さらに、組織学的検査により、keraskin®-FT は CP ゲルによってまったく損傷を受けていないことが明らかになりました (図 1C)。 CP単独で治療した群でも同じ結果が得られました（図S1）。 これらの結果に基づいて、高濃度の CP ゲル (CP の 10 μg/mL) でも無毒であると結論付けられ、皮膚刺激を引き起こしません。

図 1、HDF および in-vitro で再構成された 3D ヒト皮膚、keraskin@-FT の生存率に対するサブスタンス Cistanche (CP) ゲルの効果。(A) 細胞膜に対する CP ゲル製剤の損傷効果について、HDF を PBS で処理しました。 (Con; コントロール)、CP 単独、または CP ゲル (1-10 ug/mL) で 24 時間、細胞生存率を LDH アッセイで測定しました。 (B、C) CP ゲル (1-10 ug/mL) を使用して、in vitro で再構成された 3D ヒト皮膚、keraskin@-pT で皮膚刺激性をテストしました。 CP ゲル処理群の組織生存率は、MTT アッセイ (B) および組織学的検査 (C) によって分析され、PBS はコントロールとして使用され、値は 3 つの独立した実験からのミアプラス SD を表します。 Student's st-test を使用して、各値をコントロールと比較しました (** p < 0.01)。 スケールバー=500 うーん。 HDF、ヒト皮膚線維芽細胞。 LDH、乳酸脱水素酵素MTT、3-(4.5-ジメチルチアゾール-2-vl)-2 .5-臭化ジフェニルテトラゾリウム: PBS、リン酸バター生理食塩水SDS、ドデシルナトリウム硫酸塩。

2.2. EffCPジェルのコラーゲン生成効果

皮膚のコラーゲン合成に対する CP ゲルの効果を調べるために、HDF を CP ゲルで処理しました。 私たちの結果は、1–10 µg/mL の CP を含む CP ゲルが、I 型プロコラーゲン産生を 128.05 ± 5.19、145.19 ± 6.80、および 150.68 に有意に (p < 0.01) 増加させることを示しました。コントロール処理 (PBS) と比較して、± 16.70% (図 2A)。 それ以外の場合は、図 2A に示すように、1 μg/mL の CP のみで処理した HDF 全体で、I 型コラーゲン産生に顕著な違いは観察されませんでした。 CP 単独では 5 ～ 10 µg/mL の濃度でコラーゲン産生にある程度の効果がありましたが (119.96 ± 3.8 および 124.77 ± 8.87 パーセント)、この効果は CP ゲルよりも有意に (p < 0.01) 低くなりました。

図 2. HDF における CP ゲルのコラーゲン増加効果。 タイプ 1 コラーゲン (A)MMP-1 (B)、および TIMP-1 (C) に対する CP ゲルの効果を HDF で測定しました。 HDF を PBS (Con; コントロール)CP のみ、または CP ゲル (1-10 ug/mL) で 24 時間処理し、タイプ [プロコラーゲン、MMP-1、および TIMP{{8 }} は、それぞれプロコラーゲン タイプ IC-ペプチド (PIP) EIA キット、ヒト MMP{{10}} ELISA キット、および IIMP-1 ELISA キットを使用して測定されました。 コントロールとしてPBSを使用した。 値は、3 つの独立した実験から平均プラス SD を表します。 * p < 0.05、** p < 0.01 対 CP なしの PBS 含有培地、# p < 0.05# y < 0.01 対 CP のみ。 HDE、ヒト皮膚線維芽細胞。 PBS、リン酸緩衝生理食塩水。 MMP-1マトリックスメタロプロテイナーゼ-1; TIMP-1、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤-1; EL ISA、酵素結合免疫吸着アッセイ。

続いて。 CPwegel で処理した HDE のコラーゲン分解に関連するレベルを評価しました。 私たちの結果は、1-10 ug/mL の CP を含む CP ゲルが、MMP-1 レベルを 62.88 プラス 6.54、59.54 プラス 8.35、および 57.44 プラスに有意に (p < 0.01) 阻害したことを明らかにしました。 7.69%、対照の HDF (PBS 処理) と比較して (図 2B)。 予想どおり、1-10 ug/mL の CP を含む CP 単独でも、MMP-1 のレベルを 80.18 プラス 2.88、78.48 プラス 6.19、および 79.84 プラス 15.08% に抑制しましたが、これらの効果は有意に低かったです。 CPジェルよりも CP ゲルで処理した HDF では、CP 濃度 1-10 ug/mL で、MMP-1 の阻害を引き起こすメタロプロテイナーゼ (IIMP) -1 の組織阻害剤の発現レベルは、 113.41 プラス 4.74、116.76 プラス 3.31、および 115.8 プラス 10.13 パーセントに増加し、対照処理 (PBS) と比較しました (図 2C)。 これらの結果は、CP ゲルが MMP-1 を阻害し、HDF での TIMP-1 発現を増強することにより、I 型プロコラーゲンの産生を促進できることを示唆しています。 CP ゲルと CP 単独の比較分析により、CP ゲルは CP 単独よりもコラーゲン産生の誘導に効果的であることが明らかになりました。

2.3. Eフィ皮膚炎症におけるCPジェルの効果

効果を調べるには炎症性サイトカインの発現に対する CP ゲルの影響を調べるために、IL-1 アルファまたは -6 を減少させ、IL-10 または形質転換成長因子 (TGF) を増加させることにより、CP ゲルが抗炎症の役割を果たしているかどうかを調べました。 )-SDS 誘導ヒト表皮ケラチノ サイト (HEKs) のベータ 1。 PBSで処理した細胞は陰性対照と見なされ、SDSで刺激された細胞は陽性対照として機能しました。 図に示すように3CPジェルで24-時間治療（5µg/CP ゲル中の CP の mL) 有意に (p < 0.01) は、IL-1 アルファおよび IL-6 の SDS 誘導性発現を減少させました。 一方、CPゲルは大幅に（p < 0.01) は、IL-10 および TGF-ベータ 1 の SDS 誘導発現を増加させました (図3B）。 これらの結果は、抗炎症効果を示唆していますHEKs 上の CP ゲルの。

図 3.SDS 刺激 HEK における CP ゲルの抗炎症効果。 HEK を 0.00 15% SDS および CP ゲルと同時に 24 時間インキュベートしました。 細胞培養上清を回収し、炎症因子のレベルをELISAキットで測定しました。 炎症誘発性因子である IL-1 アルファおよび IL-6 (A)、ならびに抗炎症性因子である IL-10 および TGF-ベータ 1 (B) の相対的な倍増が検出されました。実験手順で説明されているように。 コントロールとしてPBSを使用した。 すべての値は、3 つの独立した実験の平均値と SD を表しています。 ** p < 0.01 対。 CP なしの PBS 含有培地。# p < 0.01 対 SDS 処理 HEK のみ。 HEK、ヒト表皮角化細胞。 SDS、ドデシル硫酸ナトリウム。 ELISA、酵素免疫測定法。 PBS、リン酸緩衝生理食塩水。 IL、インターロイキン、IGF、トランスフォーミング増殖因子。

2.4. インビトロでの CP ゲルの皮膚吸収特性

アンチエイジング特性に対する CP ゲルの臨床応用の可能性を評価するために、皮膚の最外層である角質層 (SC) に吸収され、表皮と真皮に入る CP ゲルの能力を調査しました。 この側面に対処するために、5 ug/mL のフルオレセイン イソチオシアネート (FITC) 標識 CP を含む CP ゲルを、再構築された 3D 人間の皮膚、keraskin@-FT (図 4A) に局所的に適用しました。 図 4B に示すように、アプリケーションの 1 時間後、FlTC 標識 CP 含有ゲルで処理された皮膚切片は、表皮全体に有意な緑色蛍光を示し、真皮組織の拡散蛍光とともに、CP ゲルが吸収される能力を示唆しています。 SCに入り、表皮と真皮に取り込まれます。 6 時間後と 24 時間後、CP ゲルで処理した皮膚切片の表皮と真皮で、より顕著な緑色の蛍光が観察されました。 対照的に、PBSのみを局所的に適用した場合、有意な蛍光は観察されませんでした。

図 4. インビトロで再構成された 3D ヒト皮膚、keraskin@-FI への CP ゲルの皮膚吸収。 （ＡＰＢＳまたはＣＰゲル（ＦＩＴＣ標識ＣＰを含む）をケラスキン（登録商標）−ＦＴＢの角質層に適用した）蛍光画像は、ＣＰゲルの吸収の程度を示した。 PBS (未処理) または FITC 標識 CP を含む CP ゲル) を指定された期間局所的に適用しました。 皮膚の問題の凍結切片を蛍光顕微鏡で観察しました。 スケールバー=1 mm

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