鉄の補給は、ミトコンドリア機能の増強を通じて老化を遅らせ、細胞の寿命を延ばします

キーワード:鉄;経年劣化; 細胞寿命延長; ミトコンドリア; AMPK; サッカロマイセス・セレビシエ

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1.はじめに

の高齢人口は世界中で劇的に成長しています [1–3]. エージングがん、神経変性、心臓病、糖尿病、認知障害、免疫系の低下など、いくつかの慢性疾患の最大の危険因子です [4–8]。 代謝機能の漸進的な低下は、残りの人生の健康に影響を与える高齢者集団の加齢に伴う病状への脆弱性を高めます。 単細胞酵母から動物モデル系まで、さまざまな生物における最近の研究は、老化メカニズムが保存され、細胞代謝の高度に相互接続され機能的に冗長な遺伝子とタンパク質の相互作用ネットワークによって制御されていることを示しています[9–11]。 出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエその細胞プロセスの多くはヒトで保存されているため、老化の生物学を研究するための強力なモデル生物です。 酵母は扱いやすい短い寿命を持ち、さまざまな環境条件下でのハイスループットスクリーニングに適しています [9–12]。 [13–15]。 RLS は、母細胞が分裂して娘細胞を形成する回数を分析します。これは、幹細胞などの有糸分裂細胞の複製ヒト老化モデルです。 CLS は、ニューロンなどの有糸分裂後の細胞の経時的ヒト老化モデルである静止期で非分裂細胞が生存している時間です。 老化生物学研究における進行中の努力により、老化の生物学的プロセスを調節することによって老化を遅らせることが可能であることが実証されている [11,16]。 現在、最も有望なアンチエイジング介入はラパマイシンとメトホルミン薬です[11,16]。 ラパマイシンは、高度に保存されたラパマイシン複合体 1 (TORC1) のタンパク質キナーゼ代謝レギュレーター ターゲットを阻害します。 メトホルミンは、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ (AMPK) 活性を増加させます。 TORC1 は、タンパク質、ヌクレオチド、脂質の合成などの細胞同化プロセスを促進する [17,18]。 一方、TORC1 は、酸化的リン酸化やオートファジーなどの異化プロセスを阻害します。 しかし、AMPK は、異化プロセスを増強し、同化プロセスを阻害するため、反対の代謝機能を持っています [19]。 栄養素が制限された条件下では、AMPK が活性化され、TORC1 が阻害されます。 結果として生じる代謝反応は、同化プロセスにおけるATP利用の減少と協調する異化プロセスを誘導することにより、細胞のエネルギー生産を増加させる[19–21]。 ラパマイシンとメトホルミンは、アンチエイジング治療薬としての使用について臨床試験中です [16,22]。 鉄は重要な栄養素であり、人間を含むほとんどすべての生物にとって不可欠です [23–26]。 細胞の代謝において重要な役割を果たし、いくつかの酵素反応の補因子として機能します。 細胞代謝は老化の主要な決定因子であり、鉄はいくつかの多様な代謝機能にとって重要であるため、老化に対する鉄補給の効果を調査しました. 酵母のCLSに対する鉄補給の影響を調べました。 私たちは、鉄の補給が老化を遅らせ、細胞の寿命を延ばすことを発見しました. さらに、鉄分補給によるアンチエイジングのメカニズムは、ミトコンドリア機能の強化によるものであることも明らかにしました。 鉄の補給がミトコンドリアの機能を改善し、AMPK 変異体の短い寿命を救うことがわかりました。

2。材料と方法

2.1. 酵母菌株と遺伝子欠失

原栄養サッカロマイセス・セレビシエCEN.PK 野生型株は、細胞の増殖と生存に対するアミノ酸栄養要求性の影響を避けるために、すべての実験で使用されました [27,28]。 遺伝子ノックアウト株は、標的遺伝子の上流および下流のフランキング配列を含む増幅された選択マーカーによって遺伝子座全体が置き換えられるPCR媒介相同組換えによって生成された[29]。 PCRにより、増幅された選択マーカーの安定した組み込みが確認されました。2.2. 培地組成と化学物質リッチ培地 YPD は、1% 酵母抽出物、2% ペプトン、2% グルコース、YPD 寒天 (2.5% バクト寒天) を含み、SD 培地は、アミノ酸を含まない硫酸アンモニウムを含む 6.7 g/L 酵母窒素塩基 (Difco) を含み、 2パーセントのブドウ糖。 FeSO4.7H2O、FeCl3、CaSO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, 塩化マグネシウム2.6H2O、および BPS は Sigma から購入し、それらの原液は水で調製しました。 アンチマイシン A (シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国)、DiOC6(3) (3,30 -Dihexyloxacarbocyanine Iodide) (Invitrogen™、米国マサチューセッツ州ウォルサム)、および MitoTracker™ Deep Red ストック (Invitrogen™) 溶液は、ジメチルスルホキシド (Sigma) で調製しました。 DMSO の最終濃度は、どのアッセイでも 1% を超えませんでした。

2.3. 酵母の増殖条件

野生型および欠失株は、YPD の凍結グリセロール ストックから回収されました。寒天培地 30◦C. 酵母細胞をSD培地で一晩30℃で増殖させた◦Cと220 rpmで振とう。 一晩増殖させた細胞培養物を新鮮な SD 培地で OD600nm 約 0.2 に希釈し、96- ウェル プレートまたはフラスコで増殖アッセイを開始しました。化学物質と30でインキュベート◦C. 細胞増殖 (OD600nm) を異なる温度で測定しました。マイクロ プレート リーダーまたは分光光度計を使用して時点。

2.4. 経年劣化アッセイ

経時老化は、酵母細胞の経時的寿命 (CLS) を測定することによって決定された [30,31]。 CLS 実験は、{{0}} ウェル プレートで実行されました。 一晩細胞培養物を新鮮な SD 培地で OD600nm 約 0.2 に希釈し、異なる濃度の化学物質を含む 96- ウェル プレートに移し、30 ℃ でインキュベートしました。◦C. C. 細胞は、CLS 分析の 1 日目 (100% の細胞生存) と見なされる定常期まで増殖させました。 酵母細胞の生存は、成長アッセイによってさまざまな年齢の時点で定量化されました。 経年的に老化した細胞 (3µL) 異なる年齢の時点で、2 番目の 96- ウェル プレートに移しました。 YPD ミディアム (200µL) を 96- ウェル プレートに添加し、30 ℃ で 24 時間インキュベートしました。◦C. 細胞増殖は、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度 (OD600nm) で測定しました。 計算式: 生存率=[成長 OD600nm (年齢点)/成長 OD600nm (1 日目)] を使用して、異なる年齢点の細胞生存率を 1 日目 (100% 細胞生存率と見なす) と比較して定量化しました。× 100 2.5。 酸化抵抗アッセイ酵母細胞を SD 培地で定常期段階 (72 時間) まで増殖させました。 その後、細胞を洗浄し、異なる濃度のHを含むYPD培地でOD600nm〜0.2に希釈しました2O2 そして30歳で成長◦C. 酸化ストレス耐性は、H2O2- 処理細胞の細胞増殖を非処理対照と比較することによって分析しました。

2.6. RNA 抽出、cDNA 合成、および定量

リアルタイム PCR製造元の機械的破壊プロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した。 RNAの濃度と品質は、分光光度計（NanoDrop 2000 Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）によって決定されました。 通常、1µQuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen）を使用して、全RNAをcDNAに逆転写しました。 cDNAの合成中に、逆転写酵素およびRNAテンプレートを含まない2つのネガティブコントロールも実行されました。 すべての RT-PCR は、最終容量 20 で実行されました。µSYBR Fast Universal qPCR Kit (Kapa Biosystems、Boston、MA、USA) を使用して 20 ng の cDNA を含む L を、Quant Studio 6 Flex システム (Applied Biosystems、Waltham、MA、USA) を使用して分析しました。 RT-PCR 条件は {95 で 1 ホールドでした。◦C、180 秒}、続いて {95 の 40 サイクル◦C、1秒}、および{60◦C、20 秒} ステップ。 増幅後、融解曲線を実行して、PCR 特異性とプライマー二量体が存在しないことを確認しました。 各遺伝子の量的存在量は、ハウスキーピング転写物 ACT1 と比較して決定されました。 対照条件と処理条件の間の相対的な遺伝子発現は、2 を使用して計算されました。−∆∆カット方法 [32]。 RT-PCRに使用されるプライマーのリストは、補足表S1に記載されています。

2.7. ミトコンドリア膜電位と構造解析

酵母培養物を1で洗浄しました× PBS (リン酸緩衝生理食塩水) と培養暗闇の中で 30 分間 DiOC6(3) (100 nM) で。 インキュベーション後、細胞を洗浄し、1で再懸濁× PBS。 蛍光測定値 (482 nm で励起、504 nm で発光)のサンプルをマイクロプレートリーダーで測定しました。 それぞれの蛍光強度サンプルはOD600nmで正規化されました。 ミトコンドリア構造の分析のために、細胞は1で洗浄× PBS で、MitoTracker ディープレッド (100 nM) で 30 分間インキュベートします。暗い。 サンプルは、100 で FL 蛍光顕微鏡で可視化されました。× 倍率画像はImageJソフトウェアによって処理されました。

2.8。 ATP分析

150 µL 5% トリクロロ酢酸、Precellys のガラスビーズで溶解® 24 ホモジナイザー(Bertin Technologies、Montiny Le Bretonne、フランス)。 ATPレベルは、照度計でEnlitenルシフェリン/ルシフェラーゼ試薬キット（Promega、Madison、WI、USA）を使用して測定しました(Biotek、Winusky、VT、米国)。 ブラッドフォード試薬を用いてタンパク質濃度を推定した(Bio-rad、カリフォルニア州ヘラクレス)。 サンプルの ATP レベルは、総タンパク質に対して正規化されました。集中。

2.9。 統計分析

3. 結果

3.1. 鉄の補給は酵母の細胞寿命を延ばします

硫酸鉄（II）（FeSO4) 96- ウェル プレート内の酵母の経時的寿命 (CLS) に関する補足。 まず、細胞をさまざまな濃度のFeSO でインキュベートしました4 合成定義 (SD) 培地で、成長をさまざまな時点 (16 時間、24 時間、および 48 時間) で分析しました。 FeSO とインキュベートした後、細胞増殖は約24時間で飽和に達しました4 濃度（補足図S1a、b）。 次に、異なる濃度のFeSO でインキュベートした細胞のCLSを決定しました4. CLS分析の1日目として、48時間の静止期細胞培養を検討しました。 さまざまな時点での老化細胞の生存率を 1 日目 (100% 生存率) で正規化し、生存率グラフにプロットしました。 FeSO の濃度が異なることがわかりました4 培地への添加により、酵母の CLS が延長されました (図1a および S1c)。 また、塩化鉄（III）（FeCl3）、FeSO と同様の結果が見つかりました4 (図1b および S2a)。 FeSOかどうかを明らかにする4 とFeCl3 塩、それらの成分鉄（II）および鉄（III）、または硫酸塩および塩化物がCLSを拡張するため、他の硫酸塩および塩化物含有塩を調べました。 酵母細胞をCaSO でインキュベートしました4, MgSO4, CaCl2、および塩化マグネシウム2 FeSOを含む4, とFeCl3 SDメディアで。 異なる塩でインキュベートした細胞の増殖は、24時間後に飽和に達しました（補足図S2b）。 次に生存率を測定したところ、FeSO 以外は4 とFeCl3、他の硫酸塩または塩化物含有塩は、酵母の寿命を延ばしませんでした（図1c)。 これらの結果は、硫酸塩や塩化物ではなく鉄が酵母のCLSを延長することを明らかにした。 さらに検証するために、鉄を枯渇させ、酵母のCLSを分析しました。 バトフェ ナントロリンジスルホン酸 (BPS) は、鉄を隔離し、細胞内の鉄欠乏を引き起こす特定の鉄キレート剤化合物です [33]。 酵母細胞を、鉄および異なる濃度の BPS と共に SD 培地でインキュベートしました。 異なる濃度の細胞増殖は、24時間後に飽和に達しました（補足図S2c）。 さらに細胞の生存率を測定したところ、BPS を添加すると鉄を補給した細胞の寿命が短くなることがわかりました (図1d)。 全体として、これらの結果は、鉄の補給が酵母の寿命を延ばすことを確認しました.

図1。鉄の補給は、酵母の経時的な寿命を延ばします。 原栄養酵母株を、合成合成合成（SD）培地でさまざまな化学条件でインキュベートし、{{0}}ウェルプレートで30℃で増殖させました。 定常期まで増殖した細胞は、経時的寿命 (CLS) 分析の 1 日目 (100% の細胞生存) と見なされました。 細胞の生存は、成長アッセイによってさまざまな年齢の時点で定量化されました。 (a) 異なる濃度の FeSO4 を添加した細胞の CLS。 (b) 異なる濃度の FeSO4 および FeCl3 を添加した細胞の CLS。 (c) 100 µM の FeSO4、FeCl3、CaSO4、MgSO4、CaCl2、および MgCl2 を添加した細胞の CLS。 (d) 異なる濃度の BPS の存在下で 100 μM の FeSO4 を添加した細胞の CLS。 統計的有意性 (* p < 0.05) は、スチューデントの t 検定によって決定されました。