厳選されたタイ植物の抗酸化作用と抗皮膚老化作用: in vitro 評価と in silico 標的予測 パート 1

概要: 皮膚は体のさまざまな必須機能を実行する最大の器官です。 老化の過程で皮膚の構造と機能が損なわれると、私たちの健康と幸福に重大な影響を与える可能性があります。 広範な証拠は、活性酸素種が、関連する分解酵素の活性化を通じて皮膚の老化に基本的な役割を果たすことを示唆しています。 ここでは、タイの薬用植物 16 種が潜在的な抗皮膚老化特性についてスクリーニングされました。 すべての抽出物について、フェノールおよびフラボノイドの総含有量、抗酸化作用、抗エラスターゼ作用、および抗チロシナーゼ作用、さらには分子ドッキングによる化合物の標的酵素との結合能力について調査されました。 スクリーニングされたすべての植物の中で、A. occidentale と G. zeylanicum の葉は、強力な抗酸化物質と、エラスターゼとチロシナーゼに対する阻害を示しました。 その他の可能性のある植物には、それぞれ比較的高い抗エラスターゼ活性と抗チロシナーゼ活性を持つ S. alata の葉と A. catechu の果実が含まれます。 これらの結果は、これらの植物に由来する化合物のドッキング研究とも一致しています。 この阻害作用は、フラボノイドよりもフェノール類とより高い正の相関があることが判明しました。 総合すると、我々の発見は、いくつかのタイの植物が、抗酸化物質の天然源およびエラスターゼとチロシナーゼの強力な阻害剤としての候補化合物とともに、皮膚老化治療のための有望かつ効果的な薬剤として開発される可能性があることを明らかにしている。

また、シスタンケのグリコシドは、心臓および肝臓組織の SOD の活性を高め、各組織のリポフスチンおよび MDA の含有量を大幅に減少させ、さまざまな活性酸素ラジカル (OH-、H2O2 など) を効果的に消去し、引き起こされる DNA 損傷から保護します。 OHラジカルによる。 Cistanche フェニルエタノイド配糖体は、フリーラジカルの強力な消去能力、ビタミン C よりも高い還元能力を持ち、精子懸濁液中の SOD の活性を向上させ、MDA の含有量を減らし、精子膜機能に一定の保護効果をもたらします。 Cistanche 多糖類は、D-ガラクトースによって引き起こされる実験的老化マウスの赤血球および肺組織における SOD および GSH-Px の活性を高めることができるほか、肺および血漿中の MDA およびコラーゲンの含有量を減少させ、エラスチンの含有量を増加させることができます。 DPPHに対する優れた除去効果、老化マウスの低酸素状態の延長、血清中のSOD活性の改善、実験用老化マウスの肺の生理的変性の遅延 細胞形態学的変性を伴うCistancheには優れた抗酸化能力があることが実験で示されています皮膚の老化疾患を予防および治療する薬になる可能性があります。 同時に、Cistancheに含まれるエキナコシドは、DPPHフリーラジカルを捕捉する顕著な能力を有し、活性酸素種を捕捉してフリーラジカルによるコラーゲン分解を防ぐ能力があり、また、チミンフリーラジカルアニオン損傷に対する優れた修復効果もあります。

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キーワード: 植物医学; 老化防止; 酸化防止剤。 抗エラスターゼ; 抗チロシナーゼ; プロアントシアニジン; アレカ・カテチュ。 アナカルディウム・オクシデンタル。 グロキディオン・ゼイラニクム。 セナ・アラタ

1. はじめに

皮膚は人体の中で最大かつ最も複雑な器官です。 皮膚は体と外部環境の間の障壁として機能し、さまざまな機能を果たします [1]。 水分の損失や微生物感染から体を守ることに加えて、美容上の重要な役割もあります[2]。 さらに、免疫系、神経系、内分泌系など、体の他の部分をサポートする働きもあります [1]。 若さと美しさの外観は、人々の社会的行動や人生にプラスの影響を与える可能性があります[1、2]。 したがって、加齢に伴って生じる皮膚の構造と機能の障害は、私たちの健康と幸福に深刻な影響を与える可能性があります[2、3]。 皮膚の薄さ、乾燥、弾力性の欠如、きめの粗さ、しわ、濃い色素はすべて、高齢の皮膚によく見られる特徴です[4]。 現在、多くの研究者が、潜在的な抗老化薬や化学物質、特に皮膚の老化治療のための天然源由来の薬剤や化学物質の生成に取り組んでいます。

一般に、人間の皮膚は 2 つの方法で老化します。内部的 (経時的な老化の結果として) と外部的 (環境要因の影響を受けた環境変数の結果として) です [5]。 広範な証拠は、活性酸素種 (ROS) の形成を介した酸化ストレスが、内因性と外因性の両方の皮膚老化において基本的な役割を果たすことを示唆しています [6]。 ROS は、核酸、酵素タンパク質、膜脂質などの必須高分子に損傷を与えることで皮膚細胞に酸化的損傷を引き起こし、その結果、細胞機能不全や細胞死が引き起こされます [7]。 酸化ストレスはまた、ECM 成分の合成 (エラスチンなど) を抑制し、ECM 分解酵素 (エラスターゼなど) を活性化することにより、細胞外マトリックス (ECM) の分解にも寄与し、その結果、皮膚の弾力性が失われます [2,8,9]。 さらに、ROS はケラチノサイトでメラノサイト刺激ホルモン (-MSH) の生成を誘導し、それによってチロシナーゼ酵素の活性化を引き起こし、メラノサイトでのメラニン合成を促進することにより、皮膚に不規則な色や暗い色を引き起こす可能性があります [10,11]。 したがって、ROS を除去し、エラスターゼおよびチロシナーゼの活性を阻害することは、皮膚の老化の治療または予防に役立つ可能性があります。

天然物は現在、老化や加齢に伴う衰えだけでなく、いくつかの病気を治療するための代替薬の可能性として多くの関心を集めています[8、12、13]。 熱帯植物は、皮膚の老化治療における可能性を探る上で興味深いかもしれません。 以前に報告されたように、いくつかのアンデスおよびヒマラヤの植物は、老化防止成分として使用できる可能性のある化合物の供給源とみなされています [14,15]。 タイは多種多様な熱帯植物を栽培することで知られていますが、その多くは十分に研究されていません。 この研究の目標は、皮膚の老化に対する新しい治療法を開発するための潜在的な天然資源を見つけることでした。 タイの薬用植物 16 種の抽出物について、フェノールおよびフラボノイドの総含有量、フリーラジカル消去、抗エラスターゼ、抗チロシナーゼ活性など、皮膚の老化防止に関連する特性について in vitro で研究されました。 また、相関分析とインシリコ分子ドッキングアプローチをさらに実行して、エラスターゼまたはチロシナーゼ酵素に対して強力な阻害を持つ3つの最も効果的な植物に含まれる有望な植物化学化合物を明らかにしました。

2. 結果

2.1. 抽出収量

表 1 は、この研究で使用したタイの植物の学名、使用部位、供給源、抽出方法/溶媒、および収率を示しています。 抽出物の収率は 2.0 パーセントから 36.3 パーセントの範囲でした (表 1)。 C. カレンダーの抽出収率が最も高く (36.3 パーセント)、次に M. カルデラ (18.2 パーセント) と A. オクシデンタル (16.0 パーセント) が続きましたが、H. undatus の収率は最も低かった (2.{{ 13}} パーセント）。

2.2. タイの植物の総フェノール含有量

植物抽出物は、抽出物乾燥重量 g あたり 14.06 ± 1.55 ～ 320.14 ± 7.95 mg の没食子酸当量 (GAE) の範囲のさまざまな総フェノール含有量を示しました (表 2)。 G. zeylanicum (抽出物 1 g 乾燥重量あたり GAE 320.14 ± 7.95 mg) は、すべての抽出物中でフェノール含有量が最も高く、次いで A. catechu (抽出物 1 g 乾燥重量あたり GAE 295.79 ± 11.97 mg) および M. caldera (抽出物 1 g あたり GAE 210.99 ± 10.40 mg) が続きました。抽出物乾燥重量 g あたりの GAE 量）をそれぞれ示します。 最低レベルは C. カレンダーで見つかり、乾燥重量抽出物 1 g あたり 14.06 ± 1.55 mg GAE でした。

2.3. タイの植物の総フラボノイド含有量

植物抽出物の総フラボノイド含有量は植物種によって異なり、抽出物乾燥重量 g あたりケルセチン当量 (QE) 2.61 ± 0.42 ～ 84.48 ± 18.32 mg の範囲でした (表 2)。 すべての抽出物の中で、フラボノイド含有量が最も高いのは M. caldera (乾燥重量抽出物 1 g あたり 84.48 ± 18.32 mg の QE)、次いで G. zeylanicum (乾燥重量 抽出 1 g あたり 52.54 ± 7.25 mg の QE) と P. dulce でした。 (抽出物乾燥重量 g あたり 28.01 ± 4.39 mg の QE)。 一方、最低レベルは E. Americana で見つかり、乾燥重量抽出物 1 g あたり 2.61 ± 0.42 mg の QE でした。

2.4. DPPH タイ植物のラジカル消去活性

DPPH アッセイは、安定した DPPH ラジカルを捕捉する化合物の水素供与能力に基づいています [16]。 植物抽出物の抗酸化能力は、DPPH ラジカル消去活性のパーセント、抽出物乾燥重量 g あたりのビタミン C 等価抗酸化能力 (VCEAC) の mg、および最大半値阻害濃度 (IC50) として表されました (表3)。 0.1 mg/mL の抽出物では、DPPH 消去活性の割合は 6.40 ～ 93.18 パーセントの範囲でした。 4 つの植物抽出物: G. zeylanicum (93.18 パーセント)、M. caldera (90.61 パーセント)、A. occidentale (89.01 パーセント)、および A. catechu (88.12 パーセント) は、80 パーセントを超える DPPH 除去活性を示しました。 対照的に、C. ternatea は 6.40 パーセントで最も低い除去活性を示しました。 この順位は、相対的な VCEAC 値に基づいて比較した場合も同じでした。 ただし、IC50 値によれば、上位 4 つの植物抽出物の抗酸化能力は次の順序で変化しました: G. zeylanicum > A. catechu > A. occidentale > M. caldera。 DPPH アッセイで得られた結果は、G. zeylanicum が最も高い除去活性パーセンテージと最も低い IC50 値を備えた最も強力な抗酸化能力を示したことを示しています。

2.5. ABTS タイの植物のラジカル消去活動

ABTS アッセイは、安定した ABTS ラジカル カチオンを中和するために水素原子を移動させる化合物の能力に基づいています。 植物抽出物の抗酸化能力は、ABTS ラジカル消去活性のパーセント、抽出物乾燥重量 g あたりの VCEAC の mg、および IC50 として表されました (表 4)。 0.1 mg/mL の抽出物では、ABTS 除去活性の割合は 13.93 パーセントから 99.37 パーセントの範囲でした。 8 つの植物エキス: G. zeylanicum (99.37 パーセント)、A. catechu (99.31 パーセント)、A. occidentale (99.23 パーセント)、M. caldera (98.88 パーセント)、E. Americana (95.62 パーセント)、Z. officinale (94.07 パーセント) )、P. dulce (83.99 パーセント)、および H. undatus (82.16 パーセント) は、80 パーセントを超える ABTS 消去活性を示しました。 対照的に、C.カレンダーは13.93パーセントで最も低い清掃活動を示しました。 VCEAC によると、上位 4 つの植物抽出物の抗酸化能力と IC50 値は、G. zeylanicum > A. catechu > A. occidentale > M. caldera と同様の順位で見つかりました。 注目すべきことに、ABTS アッセイの結果は、最高の除去活性パーセンテージと最低の IC50 値で表されるように、最も強い抗酸化活性をもつ抽出物は G. zeylanicum の葉であることも示しました。

2.6. タイの植物の抗エラスターゼ活性

植物抽出物のエラスターゼ阻害活性は、基質として N-スクシニル-トリアラニル-パラニトロアニリド (SANA) を用いたエラスターゼ阻害アッセイを使用して評価されました。 陽性対照として使用されたエピガロカテキンガレート (EGCG) (0.1 mg/mL) は、45.27 パーセントの阻害レベルを示しました。 抽出物のエラスターゼ阻害活性を表 5 に示します (表 S1 も参照)。 0.5 mg/mL の抽出物では、エラスターゼ阻害の割合は 1.33 パーセントから 88.31 パーセントの範囲でした。 A. catechu のエラスターゼ阻害効果は 88.31 パーセントで最も高く、次いで G. zeylanicum (87.43 パーセント)、A. occidentale (84.78 パーセント)、S. alata (73.95 パーセント) でしたが、S. asper bark のエラスターゼ阻害効果は最も低かったです。効果は 1.33% です。 バックグラウンド吸光度が高いため、活性が検出できない一部の植物抽出物は、0.1 mg/mL で再分析されました。 Z. officinale を除く、M. caldera、P. nigrum、Z. cassumunar、および S. asper の葉は、3.46 パーセントから 35.74 パーセントの範囲の低から中等度の阻害活性を示すことが判明しました。 それにもかかわらず、C. Calendars、C. asiatica、C. ternatea、E. americana、および H. undatus の影響は、より高濃度であっても観察されませんでした。

2.7. タイの植物の抗チロシナーゼ活性

植物抽出物のチロシナーゼ阻害活性を、基質として 3,4- ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン (L-DOPA) を用いたドーパクロム法を使用して評価しました。 陽性対照であるコウジ酸 (KA) (0.02 mg/mL) は、68.35 パーセントの阻害レベルを示しました。 抽出物のチロシナーゼ阻害活性を表 6 に示します (表 S2 も参照)。 1 mg/mL の抽出物では、チロシナーゼ阻害率は 4.80 パーセントから 91.51 パーセントの範囲でした。 G. zeylanicum が 91.51 パーセントで最も高いチロシナーゼ阻害効果を示し、次いで A. occidentale (81.01 パーセント)、M. caldera (76.12 パーセント)、A. catechu (75.38 パーセント) でしたが、P. nigrum のチロシナーゼ阻害効果は最も低かったです。 4.80パーセントで。 バックグラウンド吸光度が高いために活性が検出できなかった 2 つの植物抽出物を 0.1 mg/mL で再分析したところ、活性は 3.98 パーセント (Z. cassumunar) と 21.28 パーセント (Z. officinale) であることがわかりました。 しかし、P. dulce は濃度を高めても効果を示さなかった。

2.8. 相関分析

植物抽出物の潜在的なエラスターゼおよびチロシナーゼ阻害作用に関するこれまでのいくつかの報告[8、16、17]を考慮すると、抽出物は高い抗酸化能力を有し、強力なエラスターゼおよびチロシナーゼ阻害作用を有する傾向があると考えられます。 したがって、この研究ではそれらの関係を検証するために、ピアソン相関分析をさらに実行して、両方の酵素の阻害活性と抗酸化物質含有量のレベル、および使用した抽出物の抗酸化能力との関係を調査しました。 相関の強さは、相関係数 (r 値) によって次のように分布します: r=0.91{{10}} から 1.000 は非常に強い相関を示します。 r=0.710 ～ 0.900 は高い相関を示し、r=0.410 ～ 0.700 は中程度の相関を示し、r=0.210 ～ 0.400 は小さい相関を示し、r=0.000 ～ 0.200 はわずかな相関を示します [18]。 図 1a、c、d にそれぞれ示すように、エラスターゼ阻害は、総フェノール含有量、DPPH、および ABTS ラジカル消去活性と高​​い正の相関関係がありました。 同様に、チロシナーゼ阻害は、総フェノール含有量およびABTSラジカル消去活性に対して非常に強い正の相関を示しましたが(図2a、d)、DPPHラジカル消去活性に対しては高い正の相関を示しました(図2c)。 しかし、総フラボノイド含有量は、エラスターゼおよびチロシナーゼ阻害の両方と適度に正の相関がありました（図1bおよび2b）。 これらの結果は、フェノール化合物と抗酸化活性がエラスターゼとチロシナーゼ酵素の阻害に大きく寄与している可能性があることを実証しました。

2.9. 分子ドッキング

次に、エラスターゼまたはチロシナーゼ酵素に対して強力な阻害を示す 3 つの最も効果的な植物の植物化学化合物の能力を評価しました。 分子ドッキングは一般に、既知の阻害剤と比較して、タンパク質受容体または酵素に対する化合物の結合親和性を予測するために使用されます。 インビトロスクリーニングアッセイの結果によれば、IC50 値の順位では A. occidentale が最も強力なエラスターゼ阻害剤であり、次いで G. zeylanicum および S. alata であることがわかりました。 したがって、エラスターゼを阻害する能力を評価するために、これら 3 つの植物に由来する植物化学化合物を選択しました。 エラスターゼ (3HGP) と化合物間の相互作用の結果は、結合エネルギー、阻害定数、水素結合の数、アミノ酸相互作用、および結合長として表 S4 に示されています。 3HGP と化合物間の結合エネルギーは、-2.26 か​​ら -11.95 kcal/mol の範囲のスコアを示します (表 S4)。 ポジティブコントロールであるEGCGは、-9.69 kcal/molの結合エネルギーを示しました。 ドッキング結果によると、5 つの化合物はポジティブ コントロールよりも低い結合エネルギーを示しました。 プロアントシアニジンの四量体は最も低い結合エネルギー (-11.95 kcal/mol) を示し、これはエラスターゼ阻害において他の化合物と比較して最高の親和性を示し、次いでアメントフラボン、ルチン、アガチスフラボン、ケンフェロール 3-O-ゲンチオビオシドが続きます。 、結合エネルギーはそれぞれ -11.81、-10.12、-9.92、および -9.73 です。

さらに、チロシナーゼ阻害を伴う植物抽出物の IC50 値の順位は、エラスターゼ阻害とほぼ同様でした。 我々は、G. zeylanicum が最も高い阻害効果を有し、次に A. catechu、A. occidentale が続くことを発見しました。 したがって、これら 3 つの植物に由来する化合物を選択して、チロシナーゼを阻害する能力を調査しました。 チロシナーゼ (2Y9X) と化合物間の相互作用の結果は、結合エネルギー、阻害定数、水素結合の数、アミノ酸相互作用、および結合長として表 S5 に示されています。 2Y9Xと化合物間の結合エネルギーは、-4.56から-10.42 kcal/molの範囲のスコアを示しました（表S5）。 チロシナーゼのよく知られた阻害剤である KA は、-4.59 kcal/mol の結合エネルギーを示しました。 ドッキング結果に基づくと、他の化合物と比較した場合、o-クマリン酸 (-10.42 kcal/mol) とプロアントシアニジンの四量体 (-10.42 kcal/mol) がエラスターゼに対して最も低い結合エネルギーを示し、コーヒー酸、フェルラ酸、アレカタンニン A1 の結合エネルギーはそれぞれ -10.10、-10.00、および -9.94 です。 図 3 および 4 は、ポジティブコントロールのエラスターゼとチロシナーゼ、および結合エネルギーが最も低い 5 つの化合物のリガンドとタンパク質の相互作用の 2D 図を表しています。

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