ストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種の抗酸化および澱粉加水分解酵素阻害特性

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概要：穀物から得られる健康上の利点のほとんどは、それらの生物活性化合物に起因しています。 この研究では、生物活性化合物のレベルと酸化防止剤およびでんぷん加水分解酵素6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種（コード化AS 1828-1、4、6、8、9、11）のinvitroでの阻害特性。 トウモロコシの雑種は、ナイジェリアの国際熱帯農業研究所（ITA）で栽培されました。 生物活性化合物（総フェノール類、タンニン、フラボノイド、およびフィチン酸塩）レベル、抗酸化剤（DPPH "およびABTSの除去能力と還元力）、およびデンプンの加水分解酵素（-アミラーゼおよびx-グルコシダーゼ）トウモロコシ雑種の阻害活性は、分光光度法によって決定された。 同時に、逆相HPLCシステムを使用してカロテノイドを定量しました。 生物活性化合物の範囲は次のとおりです。11。25-14。14mgGAE / g（総フェノール類）、3。62-4。67 mg QE / g（総フラボノイド）、3。{{1 { {34}}}}。29mg/ g（タンニン）、3。66-4 .31パーセント（フィテート）、8。92-12。11ug / g（総キサントフィル）、2。{{19 }}。89ug/ g（総カロチン）および3。17-3。77ug / g（総プロビタミンAカロテノイド）。トウモロコシ雑種の抽出物はDPPHを除去しました "（SC5 0：9。 07-26。35mg/ mL）およびABTS *（2。{{30}}。68TEACmmol / g）、Fe3plusをFe2plus（0.25±0。64-0に削減.43±0.01mgGAE/ g）、および阻害された-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ、IC50範囲はそれぞれ26。28-52。55 mg/mLおよび47。72-63。98mg/mL。トウモロコシ雑種の6つのクローンの中で、AS 1828-9が最も高かった（p<0.05)levels of="" tannins="" and="" phytate="" and="" the="" strongest="">酸化防止剤およびデンプン加水分解酵素阻害活性。 総フェノール類と以下の間に有意な相関が観察されました：ABTS *（p<0.01, r="0.757)," dpph"sc50=""><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase=""><0.01,r=-0.836) and="" α-glucosidase=""><0.05, r="-0.582).Hence," the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids(especially="" as1828-9)="" may="" be="" beneficial="" for="" alleviating="" oxidative="" stress="" and="" postprandial="">

キーワード：総フェノール類; 総フラボノイド; タンニン; カロテノイド; フィチン酸; α-グルコシダーゼ阻害アッセイ; α-アミラーゼ阻害アッセイ

1.はじめに

栄養失調とそれに関連する病気がもたらす課題に取り組むためには、高収量で栄養価が高く健康的な食用作物の提供が不可欠です。 したがって、栄養価が改善された耐病性ステープルの育種などのさまざまな体系的アプローチが、急速に増加する世界人口の食餌ニーズを満たすために植物育種研究プログラムで採用されてきました。 これは、環境汚染、地球温暖化、および

新しいバイオ燃料源[1]。 サハラ以南のアフリカでは、トウモロコシ（Zea mays L.）が低所得世帯の食料安全保障と貧困削減に貢献していることが示されています[2]。

黄橙色のトウモロコシの遺伝子型は、カロテノイド、ポリフェノール化合物、フィチン酸[3-5]、トコフェロール[6]などの生物活性化合物が含まれているため、栄養と健康を促進する優れた品質でよく知られています。 しかし、サハラ以南のアフリカでのトウモロコシ生産の増加による食糧安全と栄養改善の見通しは、根の半寄生植物であるStriga hermonthica（Del。）Benthによって脅かされています。寄生による栄養素[7,8]。 その結果、S。hermonthicaは、サハラ以南のアフリカでのトウモロコシ生産に非生物的制限を課し、休耕期間の延長を伴う従来の農業用穀物システムからのパラダイムシフトから生じています。 このような伝統的な穀物栽培システムは、土壌中のストライガ種子バンクのレベルが植物に耐えられることを保証しました9]。 S.hermonthicaの蔓延によって引き起こされるトウモロコシの収量と品質の低下を軽減するための最善の管理方法は、Striga耐性トウモロコシの遺伝子型を植えることです。 この戦略は、特に他の管理手法と組み合わせて、簡単に適応できます[10]。

私たちの最近の研究は、ストライガ耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種がカロテノイド、ポリフェノール、およびフィチン酸を含むことを明らかにしました[3]。 これらの生理活性化合物は、抗酸化剤として作用し、食後の高血糖を抑制することが知られており、他の健康上の利点もあります[4、5、11、12]。 オレンジのトウモロコシ粒に含まれる生物活性化合物の中で、抗酸化剤[13,14]と消化酵素阻害活性[15]は、主に結合型で存在するフェノール化合物に依存することが報告されています。 さらに、フェノール化合物は、キサンチンオキシダーゼおよびアンギオテンシン1-変換酵素の阻害など、他のいくつかの生物活性を有することが知られており、これらはそれぞれ痛風およびレンニン依存性高血圧の病因に関与している[11]。他の生物学的活性の中でも、炎症性、抗菌性、抗癌性、抗アルツハイマー性、および抗アレルギー性の特性[16]。 したがって、食事源からのフェノール化合物は、人間の健康に役立つため、科学者と消費者の両方から大きな注目を集めています[16]。

この研究の目的は、in vitroでの6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種の生物活性化合物のレベル、および抗酸化剤とデンプン加水分解酵素の阻害特性を評価することでした。 この研究では、生物活性成分間の関連性もテストされました。酸化防止剤6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種のデンプン加水分解酵素阻害活性。

2.結果と考察

2.1.6本のパイプラインストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種の生物活性成分

6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種（AS 1828-1（AS1）、AS 1828-4（AS4）、AS 1828-6（AS6）、AS {{ 8}}（AS8）、AS 1828-9（AS9）、AS 1828-11（AS11））この研究では、総フェノール類が含まれていました。フラボノイド、タンニン、カロテノイド、およびフィチン酸。 総フェノール類、総フラボノイド、タンニン、およびフィチン酸のレベルを表1に示します。総フェノール類は、AS4およびAS9でそれぞれ11.25〜14.14 mg GAE/gの範囲でした。 総フラボノイドは、AS11とAS6でそれぞれ3.62から4.67 mg QE/gの範囲でした。 タンニン含有量は、AS1とAS9でそれぞれ3.64から6.29 mg/gの範囲でした。 フィチン酸含有量は、AS6の3.66パーセントからAS1の4.47パーセントの範囲でした。

したがって、AS9には最高の（p<0.05)total phenolics="" and="" tannin="" levels,="" while="" as6="" had="" the="" highest="" total="" flavonoids="" content.="" the="" total="" phenolic="" concentrations="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" are="" higher="" than="" the="" values="" previously="" reported="" in="" yellow="" maize="" hybrids,="" including="" 2.15="" mg="" gae/g[15]and="" 2.08="" mg="" gae/g[17].="" similarly,="" the="" levels="" of="" total="" flavonoids="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" in="" this="" study="" are="" higher="" than="" the="" 0.93±="" 0.03="" mg="" oqe/g="" recently="" reported="" in="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour="" [17].="" although="" the="" tannin="" levels="" are="" within="" the="" range(2.1-7.3="" mg/g)previously="" reported="" in="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" [3],="" the="" values="">

色素性トウモロコシの遺伝子型で報告されている縮合型タンニンの範囲（33.7 0〜158.55 mg / 100g、0.34〜1.59 mg / gに相当）よりも比較的高い[13]。

非Striga耐性黄色トウモロコシ遺伝子型におけるこれらのポリフェノールの既存の文献の値と比較して、6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシハイブリッドで観察された総フェノール類、総フラボノイド、およびタンニンのより高いレベルは、それらの遺伝子構成の違い[3]。 ポリフェノールおよび他の植物の二次代謝産物の生合成は、ストレッサーの存在下で、不利な条件に耐えるための植物による細胞防御および/または適応メカニズムとして増加することはよく知られています[16、18]。 さらに、ストライガ種子の発芽は、トウモロコシ植物の根でのストリゴラクトン（植物ホルモン）の生成によって刺激され、植物はストレス下で放出します[19]。 したがって、S。hermonthicaに対する耐性の特性が、寄生虫に耐えるためにトウモロコシのポリフェノール化合物の生合成をアップレギュレーションした可能性があります。 これは、S。hermonthicaへの付着後の耐性が、植物細胞壁の肥厚と、植物細胞内に密に染色された多くの小さな液胞とフェノール沈着物の蓄積を伴うという以前の報告によって裏付けられています[20]。

フェノール化合物は、一重項酸素の消光剤、水素の供与体、および還元剤として機能することを可能にする酸化還元特性により、抗酸化活性で注目に値します[21]。 さらに、フェノール化合物は、個々の酵素への非特異的結合を介して、膵臓リパーゼ、-アミラーゼ、およびα-グルコシダーゼを含む消化酵素を不活性化することも報告されています[22]。 Villiger et al。によって以前に報告されたように[23]フェノール化合物は、水素および疎水性結合を介してタンパク質に対して高い親和性を持ち、タンパク質の変性によって-アミラーゼや-グルコシダーゼなどの酵素を阻害する能力を高めます。

The phytic acid contents were comparable (p>0 .05）6つのパイプラインのうち、Striga耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種。 この範囲は、Striga耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種のフィチン酸含有量に関する以前の報告[3]と一致しています。 フィチン酸は、腎臓結石の発生を抑制する効果[24]に加えて、抗酸化作用と抗ガン作用[25]を持っています。 生物活性成分、特にストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種のフェノール成分（フラボノイドとタンニン）の抗酸化特性は、トウモロコシの一部の内因性栄養素の酸化分解を防止および/または減速する可能性があります。不飽和脂肪酸やビタミンなどの酸化[16]。 さらに、Striga耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種の生物活性成分は、いくつかの有毒な酸化生成物が形成される速度を低下させ、栄養価を維持し、それらから作られた食品の貯蔵寿命を延ばす可能性があります[26]。

The carotenoid content in the Striga-resistant yellow-orange maize hybrids is presented in Table 2. Total β-carotene (9-cis-β-carotene + 13-cis-β-carotene + all-trans-β-carotene) ranged from 2.42 to 2.89ug/g; total xanthophylls (lutein+zeaxanthin) ranged from8.92 to 12.11l ug/g; and total provitamin A carotenoids(β-cryptoxanthin+β-carotene+α-carotene） ranged from 3.17 to 3.77 μg/g,in AS6 and AS9,respectively. There were no significant differences(p>0 .05）Striga耐性黄橙色のカロテノイド含有量

トウモロコシ雑種。 この研究で得られたカロテノイドの範囲は、プロビタミンAバイオ強化黄色トウモロコシ雑種についてAlamuらによって以前に報告されたものを確認します[27]。 さらに、総キサントフィルは、Striga耐性黄橙色トウモロコシ雑種の総プロビタミンAカロテノイドよりも値が高く、Ortizらの発見を裏付けています。 [28]。

カロテノイドは、報告されている生物活性に従って、ストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種のフェノール化合物の抗酸化およびデンプン加水分解酵素阻害活性を補完している可能性があります。 たとえば、カロテノイドは、健康上の利点の根底にある主要なメカニズムとして抗酸化作用を持っていると報告されています[29]。 また、癌[30]や心血管疾患[31]などの非感染性慢性疾患に対する保護効果ももたらします。 また、β-クリプトキサンチンは、2型糖尿病（T2D）のリスクを大幅に軽減し、インスリン抵抗性を軽減することが報告されています[32,33]。

2.2。 6本のパイプラインストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種の抗酸化活性

ストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種の抗酸化活性（表3）は、6つのパイプラインクローンがすべて、フリーラジカル（ABTS度プラスおよびDPPH *）を除去し、第二鉄イオン（Fe3プラス）を第一鉄イオンに還元することによって抗酸化活性を示すことを明らかにしました。 （Fe2 plus）。 抗酸化活性は大幅に変化しました（p<0.05) among="" the="" hybrids,="" with="" as9="" having="" the="" strongest=""><0.05) free="" radicals="" scavenging="" abilities(7.28="" teac="" mmol/g="" and="" sc50,="" 9.07±="" 0.27="" mg/ml="" for="" abts+="" and="" dpph,="" respectively)and="" ferric-reducing="" power="" (0.43="" mg="" gae/g).="" it="" is="" pertinent="" to="" recall="" that="" as9-9="" also="" had="" the="" highest="" level="" of="" total="" phenolics="" and="" tannins,="" as="" presented="" earlier="" in="" table="" 1.="" the="" dpph°scavenging="" abilities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" obtained="" in="" this="" study="" (sc50:="" 9.07="" to="" 26.35="" mg/ml)="" are="" more="" potent="" than="" those="" reported="" by="" rodriguez-salinas="" et="" al.="" [13]="" for="" pigmented="" maize="" genotypes(ic50:="" 31="" to="" 52="" mg/ml)="" since="" a="" lower="" sc50="" or="" ic50="" is="" indicative="" of="" a="" stronger="" activity="" [34].="" however,="" vitamin="" c,="" a="" standard="" antioxidant="" with="" a="" lower="" sc50(4.63±0.28="" mg/ml),="" had="" a="" stronger="" dpph*scavenging="" activity="" than="" all="" of="" the="" six="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids.="" similarly,="" the="" abts·+="" scavenging="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" (2.65-7.68="" teac="" mmol/g)is="" higher="" than="" the="" value="" (294.81±="" 2.23="" umol="" teac/g)reported="" by="" irondi="" et="" al.[17]="" for="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour.="" the="" stronger="" antioxidant="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" over="" the="" non-striga-resistant="" pigmented="" maize="" genotypes="" may="" be="" attributed="" to="" the="" increased="" deposition="" of="" polyphenolic="" compounds="" in="" their="" defense="" against="" s.="" hermonthica="" [20],="" which="" may="" have,="" consequently,="" enhanced="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

ストライガ耐性の黄橙色トウモロコシ雑種のフリーラジカル捕捉能力と鉄還元力は、フリーラジカルと活性酸素種によって引き起こされる酸化的攻撃から体を保護するのに有益である可能性があることを示唆しています。 したがって、Striga耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの体内の生体分子の酸化的損傷[35]や、酸化ストレスに関連する慢性疾患[36]に対する保護効果をもたらす可能性があります。 。

2.3。6本のパイプラインストライガ耐性バイオ強化黄橙色トウモロコシ雑種のデンプン加水分解酵素阻害活性

6本のパイプラインのデンプン加水分解酵素（-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ）阻害活性Striga耐性黄橙色トウモロコシ雑種（IC50（酵素活性を50％阻害した抽出物濃度））を表4に示します。IC50 -アミラーゼおよび-グルコシダーゼでのStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種の値は、AS9およびAS4でそれぞれ26.28〜52.55 mg / mLおよび47.72〜63.98 mg/mLの範囲でした。 したがって、6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種の中で、-アミラーゼと-グルコシダーゼの両方のIC50値が最も低いAS9が最も強い（p<0.05)inhibitory activity="" on="" these="" two="" enzymes.="" interestingly,="" there="" was="" no="" significant="" (p="">0。05）-アミラーゼのAS9とアカルボース（標準的な抗糖尿病薬）のIC50値の違い。これは、AS9とアカルボースの-アミラーゼ阻害能力が同等であることを示しています。 しかしながら、アカルボースのそれと同等であったAS9の-アミラーゼ阻害能力を除いて、アカルボースの-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ阻害活性は、Striga耐性黄橙色トウモロコシ雑種のものよりも強かった。 デンプン加水分解酵素（-グルコシダーゼ）活性を阻害するさまざまな色素性（黄色、紫色、赤色、および黒色）トウモロコシ遺伝子型の能力がFabila-Garciaらによって報告されました。 [15]。 彼らの発見は、イエローコーン抽出物がトウモロコシの遺伝子型の中でパーセンテージ（69.8パーセント）として表される最も高い-グルコシダーゼ阻害活性を持っていることを明らかにしました。 さらに、Irondietal。 [17]最近報告された、プロビタミンA黄色トウモロコシ粉のo-アミラーゼおよび-グルコシダーゼIC50値はそれぞれ237.12±2.60および157.18±1.05ug/mLです。 平均IC50値がそれぞれ218.4および221.4ug/ mLでα-アミラーゼおよび-グルコシダーゼを阻害すると報告されたコーンシルク抽出物と比較して、6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種はより弱い阻害効果を示しました。 c-アミラーゼとx-グルコシダーゼについて。

c-アミラーゼとo-グルコシダーゼの両方が食事の炭水化物の消化に関与しています。 小腸の-アミラーゼはデンプン-1、4結合を加水分解してオリゴ糖と二糖を放出しますが、小腸のブラシ境界の-グルコシダーゼはオリゴ糖と二糖をさらに加水分解してグルコースを含む吸収性単糖を生成することにより消化を完了しますおよびフルクトース[38]。 したがって、これら2つの消化酵素の阻害は、2型糖尿病管理における食後高血糖を緩和するための確立された治療アプローチであり、主要な作用機序です。

薬物、天然物、機能性食品を含む多くの抗糖尿病薬[39]の。 さらに、ストライガ耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種は、-グルコシダーゼよりも-アミラーゼに対してより実質的な阻害効果を示した。 デンプン加水分解酵素阻害のこのパターンは、有益な治療上の意味を持ち、以前の研究で報告されたパターンと一致しています[17、A0]。 したがって、6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種、特にAS9は、食後高血糖を制御する上でいくつかの利点がある可能性があります。

2.4。 6つのパイプラインストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種の生物活性成分、抗酸化剤およびデンプン加水分解酵素阻害活性の間の相関関係

生物活性成分の中で、総フェノール類はABTS・plus（p<><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase="" ic50=""><0.01,r=-0.836)and α-glucosidase="" ic50=""><0.05,r=-0.582) (table="" 5).="" as="" earlier="" stated,="" lower="" dpph"="" scs0="" and="" enzyme="" ics0="" values="" are="" indicative="" of="" stronger="" scavenging="" and="" inhibitory="" activities="" of="" a="" given="" sample="" on="" dpph*="" and="" enzymes,="" respectively="" [34].="" thus,="" when="" taken="" together,="" the="" negative="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" dpph·sc50,="" α-amylase="" ic50="" and="" α-glucosidase="" ic50,="" as="" well="" as="" the="" positive="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" abts="" scavenging="" ability="" and="" reducing="" power,="" suggest="" that="" phenolic="" compounds="" may="" have="" contributed="" majorly="" to="" the="" observed="" antioxidant="" and="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

3.材料と方法

3.1。 化学薬品および試薬

トロロックス、ケルセチン、L-アスコルビン酸、没食子酸、ABTS（2,2'-アジノ-ビス-（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸））、DPPH（2、2-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル）、Bacillus stearothermophillusの-グルコシダーゼ、p-ニトロフェニルグルコピラノシド（PNPG）、-アミラーゼ、可溶性デンプン、およびアカルボースはSigma（St. Louis）から購入しました。 他のすべての化学物質および溶媒の分析グレードが使用されました。

3.2。 サンプルコレクション

すべてサミナカ（8度39'E、1 0）で栽培された6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種（コード化AS 1828-1、4,6,8,9,11）の乾燥種子サンプル度34'N;高度760m;年間降雨量1149mm;温度18。1-37。3度;土壌タイプ、Dystric Nitosols）およびZaria（7度45'E、11度8'N ;標高622m;年間降雨量1076mm;平均気温13.9-35。5度;土壌タイプ、鉄ルビソル）は、国際熱帯農業研究所（IITA）のトウモロコシ改良プログラムから収集されました。ナイジェリアのイバダン。 ハイブリッドは、雨季の間に3つの複製でランダム化された完全なブロックデザインで2シーズンの間5月に植えられました。 サンプルは、Perten Laboratory Hammer Mill（3102、USA）を使用して小麦粉（0.50 mmのふるいサイズ）に粉砕され、さらに実験室で分析するために不透明なサンプルバッグに密閉されました。

3.3。 サンプル抽出物の準備1

ストリガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種小麦粉から抽出物を調製するために、小麦粉1gを蓋をした50mL遠心分離管内の10mLのメタノールに、断続的に振とうしながら一晩（12時間）浸しました。 続いて、混合物を3000rpmで10分間遠心分離し、次に上澄み（メタノール抽出物）を収集し、分析まで-4℃で保存した[41]。

3.4。総フェノール含有量の決定

Singletonetal。によって記述されたFolin-Ciocalteu法。 [42]は、Striga耐性黄橙色トウモロコシ雑種の小麦粉抽出物の総フェノール含有量を決定するために採用されました。抽出物の一部（300 uL）を試験管に分注しました（3回）。 その後、1.5 mLのFolin-Ciocalteu試薬（蒸留水で10倍に希釈したストックFolin-Ciocalteu試薬）と1.2 mLのNa2CO3溶液（7.5％w / v）を添加し、混合物を暗所で30分間インキュベートしました。室温。 その後、ブランクに対して765nmで吸光度を読み取った。 総フェノール含有量は、没食子酸の検量線を使用して計算され、mg / gサンプル中の没食子酸当量（GAE）として表されました。

3.5。 総フラボノイド含有量の決定

Kaleらによって記述されたプロトコル。 [43]は、Striga耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種の小麦粉抽出物の総フラボノイド含有量を決定するために使用されました。 簡単に説明すると、0.5mlの抽出物を試験管に分注しました。 続いて、1.5 mLのメタノール、0。1 mlの塩化アルミニウム（1 0パーセント）、0.1mLの1M酢酸カリウム、および2.8mLの蒸留水を添加しました。 反応混合物をボルテックスし、室温で30分間インキュベートした後、514nmで吸光度を読み取った。 抽出物の総フラボノイド含有量は、mg / gサンプルのケルセチン当量（QE）として表されました。

3.6。 Tan1nin含有量の決定

ストリガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種の小麦粉抽出物のタンニン含有量は、Joslyn [44]によって以前に記載された比色法によって、わずかな変更を加えて定量化されました。 サンプルの一部（0 .5 g）をメタノール中の1％HCl 5 mLに分散させ、15分間放置しました。 その後、混合物を3 {{1 0}} 00rpmで10分間遠心分離しました。 上澄み液0.1mLの一部を、蒸留水7.5 mLを含む試験管に分注し、続いてFolin-Dennis試薬0.5mLとNa2CO3（35％）溶液1 mLを加え、容量を蒸留水0.9mLを含む10mL混合後、反応混合物を室温で30分間インキュベートし、760nmで吸光度を読み取りました。 mg / gサンプルのタンニン酸当量（TAE）として表されるタンニン含有量は、タンニン酸標準曲線から計算されました。

3.7。 サンプルのカロテノイド含有量の定量化

ストリガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種のカロテノイド含有量は、Howe andTanumihardjo[45]によって記述された方法を採用することによって決定されました。 カロテノイドは、0 .6gのサンプルを6mLのエタノール（0。1パーセントのブチル化ヒドロキシルトルエンを含む）と混合することによって小麦粉から抽出されました。 混合物を85度の水浴に5分間入れた。 次に、混合物中の干渉油を、水浴中で５分間、８５度で水酸化カリウム（８０パーセントｗ ／ ｖ）で鹸化した。 次に、懸濁液をボルテックスマシンを使用して混合し、さらに5分間水浴に戻した。 直ちに氷浴に移し、3mLの冷脱イオン水を加えた。混合物からのカロテノイド含有量を、1000rpmで10秒間遠心分離することにより3mLのn-ヘキサンで3回連続して分離した。 混合物の上層を50mLの濃縮管に分注した。 合わせたヘキサン画分を脱イオン水で3回洗浄し、ボルテックスし、1000rpmで10秒間遠心分離しました。 窒素ガス下でTurboVap（LIV）濃縮器を使用してn-ヘキサン画分を25分間乾燥させた。 乾燥した抽出物をメタノール/ジクロロメタン（1 mL、50：50 v / v）で再構成し、100μLのアリコートをHPLCシステムに注入して、カロテノイドを定量しました。 HPLCシステム（Water Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード）は、ガードカラム、C30 YMCカロテノイドカラム（4.6×250 mm、3μM）、バイナリHPLCポンプ（Waters 626）、オートサンプラー（Waters 717）、およびフォトダイオードアレイ検出器（Waters 2996）。 システムはEmpower1ソフトウェア（Waters Corporation）で動作しました。 移動相は、10 mmol / L酢酸アンモニウムを含むメタノール：水（92：8 v / v）を含む溶媒Aと、100％メチルターシャリーブチルエーテルを含む溶媒Bで構成されていました。 勾配溶出は、次の条件下で1 mL / minの流量で実行されました：83％から59％Aまでの29分の線形勾配; 59％から30％Aまでの6分の線形勾配;30での1分間の保持パーセントA;30パーセントから83パーセントAまでの4分間の線形勾配と4-分は83パーセントで保持されます。 カロテノイドのクロマトグラムは450nmで生成され、特定のカロテノイドは、純粋な標準からの検量線と吸収スペクトルの比較、および標準カロテノイドとの共溶出に基づく外部標準法を使用して識別および定量化されました。

3.8。 フィチン酸含有量の測定

Wheeler and Ferrel [46]の方法を使用して、小麦粉のフィチン酸含有量を測定しました。 小麦粉1gと3％トリクロロ酢酸（TCA）25 mLの混合物を1時間機械的に振とうすることにより抽出を行い、懸濁液を35 00rpmで15分間遠心分離しました。 上澄みの10mLアリコートを4mLの塩化第二鉄溶液と混合し、混合物を沸騰水浴中で45分間加熱した。 得られた懸濁液を3500rpmで15分間遠心分離し、上澄みを注意深くデカントした。 その後、沈殿物を２５ｍＬの３パーセントＴＣＡに分散させ、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより２回洗浄し、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。 蒸留水で沈殿物の体積を30mLにし、混合物を沸騰水浴で30分間加熱した。 熱い懸濁液をワットマン濾紙（No 2）を用いて濾過し、沈殿物を60mLの熱蒸留水で洗浄して完全に濾過した。 次に、濾紙に保持された沈殿物を40mLの熱3.2MHNO3で100mLメスフラスコに溶解しました。 0.5 mLのアリコートを遠心分離管に移し、7 mLの蒸留水で希釈した後、2mLの1.5M KSCNを添加し、0.5mLの蒸留水で容量を10mLにしました。 480 nmで吸光度を（1分以内に）読み取った。 小麦粉のフィチン酸含有量は、4：6のFe/P原子比を使用して計算されました。

3.9。 2、2-アジノビス（3-エチル-ベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）ラジカルカチオン（ABTS・プラス）ScaOengingアッセイ/

ストリガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種「小麦粉抽出物がABTSを除去する」能力は、Reet al。[47]によって報告された手順を採用することによって調査されました。ABTS*と作業試薬は、等量の水溶液を完全に混合することによって調製されました。 ABTS plus（7ミリモル/ L）およびK2S2Os（2.45ミリモル/ L）および混合物のインキュベーション

暗い食器棚で室温で16時間。 その後、試薬の吸光度を734 nmのエタノール（95％）で0.70±0。02に調整しました。 次に、0.2mlの抽出物と2.0mLのABTS *試薬を試験管に分注し、よく混合し、暗条件で室温で15分間インキュベートしました。 最後に、吸光度を734 nmでUV-Visible分光光度計（Milton Roy Company、USA）で読み取りました。 小麦粉抽出物のABTSeと除去能力は、後でTrolox標準曲線から計算され、Trolox等価抗酸化能（TEAC）として表されました。

3.10。 2、2-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジルラジカル（DPPH "）スカベンジングアッセイ

Cervatoらによって報告されたプロトコル。 [48]は、参照抗酸化剤としてビタミンC（アスコルビン酸）を使用して、小麦粉抽出物がDPPHを除去する能力を決定するために使用されました。 、24、32 mg / mL）の抽出物（またはビタミンC）と3。0 mlのDPPH度溶液（60μM）を暗所で室温で30分間インキュベートしました。その後、吸収517 nmで読み取り、抽出物のDPPH「除去能力（パーセント）」を計算し、DPPHの50％を除去した抽出物の濃度（SC50）として表した。

3.11。 還元力アッセイ

小麦粉抽出物がFe3plusをFe2plusに還元する能力は、Oyaizu[49]によって記述されたプロトコルを採用することによってテストされました。 簡単に説明すると、抽出物（2.5 mL）、2 0 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.6）（2.5 mL）、および1％フェリシアン化カリウム（2.5 mL）の混合物を50度で20分間インキュベートしました。 、その後、2.5mLの10パーセントトリクロロ酢酸を加えた。 次に、混合物を650×gで10分間遠心分離した。 上澄み液2.5mLを試験管に分注し、蒸留水2.5mLと0.1％塩化第二鉄1mLを加えてよく混合し、700nmで吸光度を読み取った。 最後に、抽出物の還元力を計算し、サンプル1グラムあたりの没食子酸換算ミリグラムで表した。

3.12。 アルファ-アミラーゼ阻害アッセイ

アルファアミラーゼ阻害アッセイは、クォンらによって記載された手順を採用することによって実施された。 [50]。 このアッセイでは、ブタ膵臓-アミラーゼ（EC3.2.1.1）と可溶性デンプン（基質）を使用しました。 小麦粉抽出物のさまざまな希釈液、合計5 0 0μL、および500μLの0。02Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.9 0.5mg / mL-アミラーゼ溶液を含む0.006MNaCl）を混合し、37度で10分間インキュベートした。 その後、０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の１パーセントデンプン溶液５００μＬを加え、反応混合物を３７度で１５分間インキュベートした。 続いて、-アミラーゼが触媒するデンプンの加水分解を、1.0mLのDNSA着色試薬（1パーセントの35-ジニトロサリチル酸、および0.4MのNaOH中の12パーセントの酒石酸カリウムナトリウム）を加えることによって終了させた。 その後、反応混合物を沸騰水浴中で５分間インキュベートし、室温に冷却し、１０ｍＬの蒸留水で希釈した。 混合物の吸光度を540nmで読み取った。 小麦粉抽出物を除外した参照テストが実験に含まれていました。 その後、アミラーゼ阻害率を以下のように計算した。

（A540R-A540S）×100％抑制= A540R

ここで、A540Rはリファレンスの吸光度の読み取り値です。 A540Sは、サンプルの吸光度の読み取り値です。

3.13。 α-グルコシダーゼ阻害アッセイ

Alpha-glucosidase inhibitory activity of the flours extracts was conducted by adopting the procedure reported by Kim et al. [39], using Bacillus stearothermophillus α-glucosidase (EC3.2.1.20) and para-nitrophenylglucopyranoside (PNPG) as the substrate. Five (5)units of an aliquot of α-glucosidase were incubated with 20 μg/mL of the extract for 15 min. The hydrolytic reaction was initiated by adding 3 mM PNPG prepared in 20 mM phosphate buffer, pH6.9, which served as a substrate. The hydrolytic reaction was allowed to proceed for 20 min at37°C, after which 2 mL of 0.1 M Na>CO：を加えて反応を停止させた。 小麦粉抽出物を使用しない参照テストが実験に含まれていました。 PNPGのα-グルコシダーゼ触媒による加水分解から放出された黄色のp-ニトロフェノールの吸光度を400nmで読み取り、o-グルコシダーゼ阻害のパーセンテージを次のように計算しました。

（A400R-A400S）×100％抑制= A400R

ここで、A400Rはリファレンスの吸光度の読み取り値です。 A400Sisサンプルの吸光度の読み取り。

3.14。 データ分析

この研究で得られたデータ（3回の測定から）は、平均値±標準偏差（SD）として表されました。 SPSS統計ソフトウェアパッケージ（第16バージョン）を使用して、データに対して一元配置分散分析（ANOVA）を実行し、pでのテューキーの事後検定を使用して平均値を比較しました。<0.05. the="" associations="" between="" the="" bioactive="" components,="" the="" antioxidant,="" and="" the="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" were="" calculated="" using="" the="" pearson="" correlation="" test.="" column="" representations="" of="" the="" mean="" values="" were="" done="" using="" graphpad="" prism="" (5th="">

4.結論

6つのパイプラインStriga耐性黄橙色トウモロコシ雑種には、重要な生物活性成分（総フェノール類、総フラボノイド、タンニン、フィチン酸、およびカロテノイド）が含まれていました。 それらの抽出物は強力な抗酸化活性を示し、デンプン加水分解酵素（-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ）を阻害しました。 ストライガ耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種の中で、AS1828-9は最も強力な抗酸化作用とデンプン加水分解酵素阻害作用を持っていました。 総フェノール含有量とABTS*に加えて、ストライガ耐性黄橙色トウモロコシ雑種のDPPH度の除去能力、還元力、-アミラーゼ、および-グルコシダーゼ阻害活性との間に有意な相関関係が観察されました。 抗酸化およびデンプン加水分解酵素の阻害活性は、Striga耐性の黄橙色のトウモロコシ雑種（特にAS 1828-9）が酸化ストレスおよび食後高血糖の予防および/または緩和に有益である可能性があることを示唆しています。