パート2：熱処理中の鉄の存在下および非存在下でのアスコルビン酸、5-カフェオイルキナ酸、およびケルセチン-3-ルチノシドの相互作用と抗酸化活性への影響
Mar 15, 2022
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https://www.xjcistanche.com/news/part 1- Interactions-of-ascorbic-acid -5-caffeo-54916714。html
3.ディスカッション
3.1。アスコルビン酸、5-カフェオイルキナ酸、ケルセチン-3-ルチノシドの構造活性相関
構造活性相関に応じてさまざまな物質について測定されたAOAの最初の指標は、官能基の数に起因していました。 分析した3つの物質すべてを比較すると、アスコルビン酸のAOAが最も低く、次に5-カフェオイルキナ酸が続きました。ケルセチン-3-ルチノシド最高のAOAに達しました。 Csepregietal。 [14]は、これら3つの化合物のAOAを比較したときに同じ順序を見つけました。 このランキングは、ヒドロキシ基の総量によって説明できます。ケルセチン-3-ルチノシドは10個、5-カフェオイルキナ酸は5個、そしてアスコルビン酸4つあります。 為にフラボノイド、ヒドロキシ基の総量とAOAのメカニズムに対するそれらの影響は、以前にBurdaとOleszekによって示されていました[15]。 ヒドロキシル基は、ジケトンに容易に酸化される可能性があるため、エンジオール構造で特に価値があります[8]。 分析された物質では、エンジオール構造は金属イオンと錯体を形成する能力にとっても重要です[16-18]。 エンジオール構造は、フェニル環のケルセチン-3-ルチノシドおよび5-カフェオイルキナ酸分子で発生します。これは、これらの化合物のより強力なAOAにも影響を与える可能性があります。 さらなる研究により、AOAは他の分子構造によっても影響を受ける可能性があることがわかりました。 フェノール酸は、カルボン酸基の影響を受ける可能性があります。たとえば、ヒドロキシフェニル酢酸（R-CH=CH-COOH）は、ヒドロキシ桂皮酸（R-CH、-COOH）と比較して弱い電子吸引基です。 5-カフェオイルキナ酸のカフェイン酸として[19]。 フラボノイドでは、アグリコンは対応する配糖体よりも高いAOAを示しました[20,21]。ケルセチン-3-ルチノシド、配糖体、アグリコンのAOAの場合ケルセチンその結果、より高くなります[14]。 AOAに影響を与える可能性のあるさまざまな官能基があり、その結果、単一電子移動（SET）、水素原子移動（HAT）、連続プロトン損失電子など、さまざまなメカニズムでさまざまなテストアッセイを使用することが重要です。検出のための転送（SPLET）。 それぞれのメカニズムと使用されたアッセイ試薬でさえ、生物活性化合物の異なる構造を検出することができます[22]。
3.2。ミネラル鉄の不在下での抗酸化活性に対する熱処理と構造的に異なる抗酸化剤の相互作用の影響
40分間の熱処理で安定したAOAは、熱劣化が当初の仮説よりも重要性が低いことを示しています。 さらに、HPLCデータは、純粋な5-カフェオイルキナ酸とケルセチン-3-ルチノシドが、熱処理中に最大20％の分解で安定していることを示しました。 以前の研究では、5-カフェオイルキナ酸の通常の沸点までの安定性が証明されました[23]が、DawidowiczとTypek [24]は、5-カフェオイルキナ酸を5時間加熱した後、9つの誘導体化合物を発見しました。還流。 アスコルビン酸濃度については、40分の調理後の劣化が見られました。 水溶液中の鉄なしでアスコルビン酸の分解をもたらす影響因子は、pH値、露光、酸化、温度、およびさまざまな濃度である可能性があります[25,26]。 この研究では、マイクロチューブ内のガススペースが最小限であるために酸化プロセスが最小限に抑えられたため、温度と濃度の要因が主な役割を果たした可能性が最も高いです。 残りの気相は、好気性条件下での分解に十分である可能性があります。 条件が異なると製品も異なります[27,28]。したがって、この研究では、40分の調理後、両方の条件の製品を見つけることができました。 YuanとChen[28]は、フルフラール、2-フロ酸、3-ヒドロキシ-2-ピロン、および未知の物質が、pH値に応じて水溶液中のアスコルビン酸の主要な分解生成物であると報告しました。 。 篠田ほか [29,30]オレンジジュースに含まれる分解生成物であるフルフラール、2-フロ酸、5-ヒドロキシマルトール、3-ヒドロキシ-2-ピロン、および5-（ヒドロキシメチル）フルフラール。 Hsuetal。 [31]エタノール溶液中のアスコルビン酸を分析し、2-フロ酸と3-ヒドロキシ-2-ピロンを検出しました。 好気性または嫌気性条件に応じて、検出されたアスコルビン酸誘導体（ピーク3および4）は、フルフラール、2-フロ酸、または3-ヒドロキシ-2-ピロンまたは中間体である可能性があります。 アスコルビン酸は用量反応関係で減少し、アスコルビン酸の濃度が高いほど、調理中の分解率は低くなりました。 アスコルビン酸は、おそらく水素結合とファンデルワールスエネルギーのために、より高い濃度で安定するようです[32]。
二成分および三成分混合物では、主にAOAに対する追加の影響が見られました。 二成分混合物では、AOAが高い物質の濃度が高くなると、それらの組み合わせのAOAも高くなります。 他の研究でも、（プラス）-カテキン（200 um）とアスコルビン酸（50-200 mg / L）[33]の間、および異なるモノテルペンの二成分混合物の間[34]の相加効果が見つかりました。 DPPHアッセイでのみ、ケルセチン-3-ルチノシドと組み合わせた5-カフェオイルキナ酸と、ケルセチン-3-ルチノシド濃度を2倍にした3成分混合物で拮抗作用が見られました。 これは、宇宙での分子、特にケルセチン-3-ルチノシドが非常に大きな分子であることに起因する可能性があり、DPPHラジカル分子の立体的アクセス可能性が原因である可能性があります[35]。 TPCアッセイでは、アスコルビン酸と5-カフェオイルキナ酸の組み合わせは1：2の比率で強力な拮抗効果をもたらし、2：1の比率の逆混合物は強力な相乗効果をもたらし、それぞれのAOA。 この実験で5-カフェオイルキナ酸によって示されるように、2倍濃度のアスコルビン酸は、これらの条件下で、自己安定化とそれに続く他の分子の安定化により、AOAに追加のブーストを与える可能性があります。 ザクロ-ネクタリンジュースでは、天然フェノールとアスコルビン酸の間で同じ相互作用が見られましたが、ブドウジュースでは、アスコルビン酸濃度の増加による拮抗作用の増加が観察されました[36]。 これらの結果は、アスコルビン酸、5-カフェオイルキニック、およびケルセチン-3-ルチノシドの混合物が、最も強力なときに最高のAOAポテンシャルを達成することを示唆しています。酸化防止剤豊富にご利用いただけます。
3.3。 ミネラルアイアンの影響
The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>アスコルビン酸。 ただし、混合物への鉄の添加はTEACおよびDPPHアッセイの結果に影響を及ぼしましたが、TPCアッセイは大きく影響を受けませんでした。 このため、鉄分が豊富なサンプルを扱う場合は、異なる作業メカニズムで異なるテストアッセイを使用することが重要です。
DPPHアッセイでのみ、純粋なケルセチン-3-ルチノシドのAOA、およびアスコルビン酸と組み合わせて、ケルセチン-3-ルチノシド濃度を2倍にした等モルまたは非等モルは、鉄の存在下でより低い値を示しました。 Boligonetal。 [351]は、DPPHアッセイは、これらのラジカルの立体的アクセス可能性のために、より小さな抗酸化物質をよりよく検出すると説明しました。 おそらく、2つの結合側を持つケルセチン-3-ルチノシドは、鉄と非常に大きな複合体を構築する可能性があるため、アッセイにアクセスできません。 Kejicらによって述べられたように。 [8]、これは金属イオンの配位を介した超分子錯体の形成によって説明されるかもしれません。 混合原子価複合体を1：2の比率で構築できるアスコルビン酸と組み合わせると[12]、おそらく、これらのより大きな混合複合体はDPPHラジカルと相互作用できません。 この研究の結果とは反対に、他の研究[18,37,38]は、DPPHアッセイを使用して、ケルセチン-3-ルチノシド錯体が純粋なケルセチン-3-ルチノシドよりも効果的な抗酸化剤であることを発見しました。 フラボノイドと金属イオンのキレート錯体は、錯化した金属イオンのラジカル活性を打ち消すことができることが知られています[39]。 唯一の違いは、この研究では、SymonowicsとKolandekの研究で使用された塩化鉄（II）または硫酸塩の代わりに硫酸アンモニウム鉄（II）が使用されたことです[39]。
2：1の比率の鉄の存在下でのアスコルビン酸と5-カフェオイルキナ酸の間の相乗効果、および1：2の比率での拮抗効果が見られました。 5-カフェオイルキナ酸と鉄の組み合わせはinvivoでは推奨されませんでした[6]。 しかし、この研究は、invitroで5-カフェオイルキナ酸と比較して2倍の量のアスコルビン酸がAOAに相乗効果をもたらす可能性さえあることを示しました。 比率に関するさらなる調査は、正の効果がインビボでも達成できるかどうかを示す可能性があります。
HPLCデータによると、0分の調理済みサンプルのアスコルビン酸濃度のみが低下したため、サンプルに鉄を添加しても、その触媒活性への影響は最小限に抑えられます。 調理されたアスコルビン酸サンプルでは、鉄を含まないサンプルとは対照的に、アスコルビン酸濃度が高いほど分解率が高くなります。5-カフェオブルキナ酸とケルセチン-3-ルチノシドには、温度と時間、および追加の要素が必要です。鉄の触媒活性が機能するための混合物中の相互作用。 鉄の存在下でのケルセチン-3-ルチノシドは、熱処理後にアスコルビン酸との二成分混合物でのみ減少しました。 これは、フラボノイドが一次抗酸化剤として作用し、結果として生じる化合物ラジカルがアスコルビン酸と反応して元の化合物を再生するという事実が原因である可能性があります[18]。 5-カフェオイルキナ酸はケルセチン-3-ルチノシドを保護するのに対し、アスコルビン酸はケルセチン-3-ルチノシドを保護できないため、特別なようです。 したがって、5-カフェオイルキナ酸は、鉄および熱処理と組み合わせてシステムを安定化するための重要な分子である可能性があります。 安定化分子としての5-カフェオイルキナ酸のこの仮説は、3成分混合物でさらに確認されました。 ここで、ケルセチン-3-ルチノシドは常に5-カフェオイルキナ酸によって安定化されたため、アスコルビン酸の存在下でもケルセチン-3-ルチノシド濃度の低下は観察されませんでした。 別の研究では、5-カフェオイルキナ酸は、コピグメントメカニズムによるアントシアニンの分解に対する保護特性を示しました[40]。 おそらくより高いAOAを伴う新しい分解生成物が、鉄の存在下で3つの物質すべてから出現した。 コーヒー酸（ピーク6）は、5-カフェオイルキナ酸分解生成物として同定されました（データは示していません）。 これは、他の物質がキナ酸またはDawidowiczとTypek [24]によって記述された9つの可能な誘導体の1つである可能性があるという仮定につながりました：キナ酸;（1S、3R、4R、5R）-5- [{{24 }}（3、4-ジヒドロキシフェニル）-2-ヒドロキシプロパノイル] -1、4、5-トリヒドロキシ-シクロヘキサンカルボン酸;（1S3R、4R、5R）-5- [3-（3、4-ジヒドロキシフェニル）-3-ヒドロキシプロパノイル] -1、4,5トリヒドロキシシクロヘキサアンカルボン酸; トランス3-O-カフェオイルキナ酸; トランス5-O-カフェオイルキナ酸; トランス4-O-カフェオイルキナ酸; コーヒー酸; cis -5-O-カフェオイルキナ酸;4、5-ジカフェオイルキナ酸。 ケルセチン-3-ルチノシドの場合、分解生成物がクロマトグラムに表示されますが、これは特定できませんでした。
3.4。 第二鉄（Fe3プラス）と第一鉄（Fe2プラス）でキレートを形成する能力
アスコルビン酸を含むすべてのサンプルで、第二鉄は第一鉄に還元されました。 このプロセスでは、アスコルビン酸第二鉄から電子を取り、それを第二鉄に還元し、それ自体がラジカルになります。 不安定なラジカルは急速にデヒドロアスコルビン酸に変換され、さらに分解生成物になります[12]。 ヒドロキシ過酸化物が欠落しているため、フェントンサイクルを介して第二鉄に戻る反応は不可能です。 0分の調理済み二成分混合物では、アスコルビン酸の存在下で20％以上の鉄が結合していました。 アスコルビン酸は、3-OHおよび2-からの水素置換に続く3-Oおよび2-O核を介したキレート化により、鉄種および他の金属イオンと錯体を形成することが知られています。 OH基[16、17、41。 また、混合原子価の鉄-アスコルビン酸塩錯体を形成することもあります[42]。 ただし、アスコルビン酸は弱いキレート剤であり、調理後、アスコルビン酸が存在する場合、純粋なサンプルと混合サンプルでは微量の結合鉄しか検出されませんでした。 さらに、調理プロセスにより、アスコルビン酸は分解生成物に分解され、鉄とキレート化できないように見えます。
5-カフェオイルキナ酸は比較的貧弱な還元剤です。 第二鉄は5-カフェオイルキナ酸によって還元され、長時間の調理で還元が増加しました。5-カフェオイルキレートは、金属電荷移動への配位子として第二鉄とキレートします[17]。5-カフェオイルキレートカフェイン酸の3,4エンジオール構造で1つの可能な結合側を運びます。 これは、カフェイン酸が5-カフェオイルキナ酸の生物活性部分であるのに対し、キナ酸にはAOAがほとんどない理由の指標となる可能性があります[43]。 エンジオールは、鉄錯体[41]が1対1の比率で形成されるため[44,45]、OH形成を抑制しました。 Lamy et al。[46]は、5-カフェオイルキナ酸が単量体複合体を形成するのに対し、Kissetal。 [47]オリゴマー種が見つかりました。 以前の研究[17,48]とは対照的に、5-カフェオイルキナ酸の熱処理前後の存在下では、微量の結合鉄しか検出されませんでした。 これは、この研究の中性pH条件によって説明できますが、他の研究は、人間の胃の1-2。5からのpH値に基づいて、酸性媒体で機能しました[48]。 数時間後、保存されたサンプルに黒い沈殿物が見つかりました。これは、5-カフェオイルキナ酸-第二鉄錯体の指標です。 最近混合サンプルが分析に使用されたため、中性pHでのこれらの複合体の形成にはより長い時間が必要です。 コーヒー酸との鉄錯体は、ほとんど除去活性を示さなかった[49]。 さらに、キナ酸と第二鉄の間の反応の分光光度法による証拠はありません[48]。 5-カフェオイルキナ酸とは対照的に、ケルセチン-3-ルチノシドサンプルでは、熱処理後でも結合した鉄が見つかりました。
ケルセチン-3-ルチノシドは、調理時間の延長によって最小限の増加で第二鉄を第一鉄に還元しました。 ケルセチン-3-ルチノシドのこの中程度の還元活性は、Miraらによって以前に説明されました。 [50]。 ケルセチン-3-ルチノシドの第二鉄還元活性は、3-ルチノシド、5,7,3'、4'-OHで検出されました[50]。 第二鉄との適度な相互作用は、-OH基の数が少ないことで説明できます。これにより、キレート側の負電荷密度が低くなります[50]。 フラボノイドは、3つの潜在的な配位側で金属イオンとキレート化できます：（i）5-ヒドロキシ基と4-カルボニル基の間、（ii）3-ヒドロキシ基と4-カルボニル基の間、 （ii）ブリングの3'、A'-ヒドロキシ基の間[39]。 ケルセチン-3-ルチノシドは結合側（i）と（i）[9]を使用し、3-ヒドロキシ基にルチノシドが結合しています。 スペクトルデータは、金属イオンが3'、A'-ヒドロキシ基にのみ結合することを示しています[18]。 キレートは、二価の形の鉄でより効果的です[50]。 二成分混合物では、三成分混合物とは対照的に、アスコルビン酸が存在する場合、ケルセチン-3-ルチノシドは複合体を形成することができません。 5-カフェオイルキナ酸が存在する場合、少量の結合鉄が見つかります。 これは、5-カフェオイルキニックがアスコルビン酸の存在下でケルセチン-3-ルチノシド分子を保護するため、ケルセチン-3-ルチノシドが鉄と複合体を形成できることを示しています。
4.材料と方法
4.1。化学薬品
ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99％）、硫酸第二鉄アンモニウム十二水和物、および硫酸第一鉄アンモニウム六水和物は、Carl Roth（カールスルーエ、ドイツ）から購入しました。
4.2。サンプル
アスコルビン酸、{{0}}カフェオイルキナ酸、およびケルセチン-3-ルチノシドの本物の標準の水溶液および混合物を、さまざまな比率の純粋な溶液および混合物として調製しました。 すべての可能な二成分混合物は等モル比で作成され、1つの化合物で非等モル比が2倍になりました。 三元混合物も、等モル比、および非等モル比で、それぞれ1つまたは2つの化合物を2倍にして調製しました。 抗酸化剤の最終濃度は、各試験溶液で0。3mMでした。 さらに、混合物ごとに合計0。3 mM鉄（{{1 0}}。15mM鉄および0.15mM第二鉄）を添加した後、すべての実験を繰り返しました。 抗酸化物質と鉄の選択された量は、生理学的または食物レベルに基づいていません、それらは分子相互作用の効果を研究するためにモル質量に基づいています。 その結果、総抗酸化物質と鉄の間の等モル比が確立されました。 すべての混合物を沸騰水中で0、10、20、および40分間調理し、その後氷上で冷却して加熱プロセスを停止しました。 これは、3つの独立した複製に対して行われました。
4.3。測光測定
酸化防止剤96-ウェルプレート（SynergyTM HTXマルチモードマイクロプレートリーダー、 BioTek Instruments、Winooski、VT、USA）。 単一電子移動（SET）と水素原子移動（HAT）の反応メカニズムが異なるため、さまざまなテストアッセイを使用しました。 TEACおよびTPCアッセイはSET[17,18]に基づいていますが、DPPHテストアッセイの場合、SET、HAT、またはこれら2つのメカニズムの組み合わせに基づいているかどうかについては文献が明確ではありません[{{6} }]。 Fotiによる最近の研究[51]は、フェノールが2つのメカニズムの組み合わせであるシーケンシャルプロトンロス電子移動（SPLET）を介してDPPHと反応できることを発見しました。 中程度の極性やイオン化ポテンシャルなどの要因が、主要なメカニズムに影響を与えます。
4.3.1。 総フェノール含有量（TPC）
総フェノール含有量（TPC）は、96-ウェルプレートでFolin-Ciocalteu法を使用して決定されました。これは、Bobo-Garciaetal。[52]によって以前に説明されています。 いくつかの変更を加えました。
Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0 .99）。 Folin-Ciocalteu試薬はビタミンやミネラルなどの非フェノール類にも反応するため、このテストの一般名は誤解を招く可能性があります[22]。 それは、生物活性化合物の「総還元活性」をよりよく説明しています。
4.3.2。 トロロックス等価抗酸化能（TEAC）
抗酸化活性は、いくつかの変更を加えた96-ウェルプレートでのTEACアッセイを使用して決定されました。 9.6mgのABTSと1.66mgの過硫酸カリウムを25mLのH2Oで満たしたストック溶液を調製し、暗所で室温で12-16時間インキュベートしました。 このストック溶液から、100％MeOHで25mLまで満たされた5mLストック溶液を含むTEACワーキング溶液を調製しました。
Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).
4.3.3。 DPPH*ラジカルスカベンジング
The酸化防止剤activity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).
4.4。 相乗効果と拮抗作用
抗酸化活性の相乗効果と拮抗効果を分析するために、実験的に得られた結果と、対応する濃度での個々の成分の効果の合計によって計算された理論値との比較が行われました[53]。 相乗効果とは、2つ以上の物質の相互作用を表し、組み合わせた作用が、それぞれが別々に作用する合計よりも大きくなるようにします。 これとは対照的に、拮抗作用は、2つ以上の物質の組み合わせの相互作用が、それらの個々の効果の合計よりも少ない全体的な効果をもたらす現象です。
4.5。イオン性鉄の測定
The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0 .99）。 総鉄とイオン性鉄の違いは、第一鉄と第二鉄の合計であり、結合鉄です。
4.6.HPLC-DAD
測光に使用したのと同じ抽出物中の抗酸化剤アスコルビン酸、5-カフェオイルキナ酸、ケルセチン-3-ルチノシドおよびそれらの分解生成物を定量化する
measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0 .99）を用意しました。 派生化合物は、鉄の前熱処理および後熱処理の存在下および非存在下で純粋な標準を分析することによって暫定的に同定されました。 したがって、新しいピークはインサート標準から派生する必要があります。 さらに、選択した混合物をHPLC-MSで測定し、提案された構造を検証しました。
4.7。 統計分析
Microsoft Excel 2016（Microsoft、レドモンド、米国）およびR Statistics（バージョン3.6.3、Holding-ing the Windsock、2020）を使用して、生物統計テストとデータ結果の表示および描画を行いました。 処理を評価およびリンクするための推測統計は、3元配置分散分析（ANOVA）、事後テューキーのHSD検定、およびピアソン相関を使用して実行されました。 使用されたRパッケージは、ggplot2 [55]、means [56]、およびmultcomp[57]でした。
5。結論
上記の発見に基づいて、アスコルビン酸、5-カフェオイルキナ酸、およびケルセチン-3-ルチノシドのAOAは、それらの分子構造、濃度、比率、および他の抗酸化剤や鉄との相互作用の影響を受けました。 アスコルビン酸と5-カフェオイルキナ酸を組み合わせる場合、相互作用は特にAOAで役割を果たすようです。 ここでは、相乗効果と拮抗効果が検出されました。 温度はAOAに最小限の影響しか与えませんでしたが、同時に、温度は特定の混合物、特に鉄の存在下ですべての酸化防止剤の安定性に影響を与えました。 アスコルビン酸濃度のみが鉄の非存在下で調理時間が長くなり、5-カフェオイルキナ酸濃度は鉄の存在下でのみ減少しましたが、ケルセチン-3-ルチノシド濃度はアスコルビン酸との組み合わせでのみ減少しました。鉄の存在。 鉄と組み合わせて、5-カフェオイルキナ酸は、熱処理によって他の分子の濃度が低下するのを防ぐことができました。
植物では、アスコルビン酸、5-カフェオイルキナ酸、ケルセチン-3-ルチノシドの組み合わせが可能であるだけでなく、一般的です。 したがって、これらの結果は、野菜の調理中に発生するプロセスに関する基本的な知識を提供します。 食品マトリックスはより複雑で、酵素、他のミネラル、酸など、反応条件を変える、またはそれ自体が反応物である無数の生物活性化合物を含んでいます。 これらの複雑な相互作用は、この研究の範囲をはるかに超えており、酸化防止剤調理された野菜では、将来的に対処する必要があります。
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