脊髄損傷に対するCistancheDeserticola抽出物からのオリゴ糖の抗腫瘍および抗炎症効果

連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com

Hong Zhang、et al

概要

本研究では、からのオリゴ糖の薬理学的効果Cistancheニクジュヨウエキスの上炎症、酸化ストレス、および脊髄損傷のオスのアルビノラットのアポトーシスを調査した。 脂質過酸化、GSH、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、GPx、ROS、および硝酸は、脊髄損傷のラットで有意に変化しました。 IL -6、TNF-、シクロオキシゲナーゼ-2、iNOS、p53、カスパーゼ-3、Bax、およびプロNGFのmRNA発現レベルは、抽出物の補給後にN20パーセント減少しました。 カスパーゼ-3とプロNGFのタンパク質発現レベルもN20パーセント減少しました。 GI-GVグループのp53陽性細胞の数はそれぞれ1、79、54、33、および19であり、対応するカスパーゼ-3陽性細胞の数は2、87、51、23、および14でした。現在の結果に基づいて、からのオリゴ糖の使用Cistancheニクジュヨウ抽出物はに対して効果的でした炎症、酸化ストレス、および脊髄損傷雄アルビノラットのアポトーシス。

キーワード：ニクジュヨウ、炎症酸化ストレス、ApoptosisRats

1.はじめに

脊髄損傷は、感覚、筋肉、および自律機能の喪失を伴う機能変化につながる脊髄の損傷を伴います[1]。 さらに、アポトーシスはオリゴデンドロサイトおよびニューロンで誘導され、脱髄および軸索変性による脊髄機能障害を引き起こす可能性があります[2,3]。 脊髄損傷はかなりの酸化ストレスを誘発し、炎症オリゴデンドロサイトおよびニューロンにおけるアポトーシスの開始後[2,4]。 活性酸素種（ROS）と炎症誘発性サイトカインは神経変性の間に放出され、ミクログリアは神経変性と炎症の過程で不可欠です[5–7]。 インターロイキン（IL）は、さまざまな免疫学的プロセスに関与する重要なサイトカインです[8]。 Yune et al。、[9]は、ミクログリアから放出されたプロ神経成長因子（プロNGF）がアポトーシス細胞死を引き起こすことを報告しました。 したがって、酸化ストレスに対する新規で強力な治療薬と炎症必要です。

植物Cistancheニクジュヨウ一般に砂漠のハマウツボとして知られており、Orobanchaceae科の全寄生性のメンバーです[10]。Cistanche ニクジュヨウ葉緑素を欠き、白いサクサウール（Haloxylon persicum）と黒いサクサウール（Haloxylon ammodendron）から寄生的に水と栄養素を獲得します。 TheCistancheニクジュヨウRou Cong Rongとして知られる多年生植物は、サイズが160 cmに成長し、黄色い花を咲かせます。 それは中国とモンゴルで広く豊富であり[11]、漢方薬はいくつかの病気の治療のための優れた資源です。 また、ヤンを活性化し、腎臓を緊張させるための主要なハーブ療法としても機能します[11]。 Kooetal。 [12]の配糖体はCistancheニクジュヨウ中枢神経系（CNS）で有効な物質として機能します。 何人かの研究者は、の抗アポトーシス、抗炎症、および抗酸化特性を報告していますCistancheニクジュヨウ[13,14]。 食品由来の抗酸化物質と抗炎症分子は、慢性疾患に対する化学予防物質として役立つ可能性があります[15]。 上記の治療効果を考えると、オリゴ糖の治療効果はCistancheニクジュヨウに対して抽出炎症、酸化ストレス、およびアポトーシスは、脊髄損傷のオスのアルビノラットモデルを使用して本研究で調査されました。

2。材料と方法

2.1。 材料

腫瘍壊死因子-α（TNF-）、IL -6、シクロオキシゲナーゼ、誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）、p53、Bax、カスパーゼ-3、BCL -2、pro-NGFのプライマー、およびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）は、Thermo Fisher Scientific（北京、中国）から購入しました。 カスパーゼ-3（AV00021）、p53（P 5813-100 UL）、モノクローナル抗ヤギ/ヒツジIgG-ペルオキシダーゼ（A9452）、および抗マウスIgGフルオレセインイソチオシアネート（FITC; F {{15}）の一次抗体} ML）は、Sigma-Aldrich China、Inc.（Shanghai、PR China）から購入しました。

2.2。 ラット

オスのウィスターアルビノ系統ラット（180〜220 g）は、中国の四川大学の西中国病院の動物舎から購入しました。 ラットには餌と水を自由に与えた。 12- hの光：12- hの暗サイクルは、相対湿度下でポリプロピレンラットケージ内で維持されました。 すべてのラット実験は、中国の四川大学のWestChinaHospitalの倫理委員会によって承認されました。 動物の世話と使用に関して適用されるすべての国際的、国内的、および制度的ガイドラインに従った。

2.3。 脊髄損傷の誘発

脊髄損傷は、ハロタン（1.5％）への曝露後の縦方向の外科的切開によって誘発されました。 外科的処置全体は室温で行われた。 動物の裏側の胸椎下部から胸椎中央部まで切開を行った。 露出したTh12表面にA20〜25 gの重りを30分間置いて、怪我を誘発しました。 Th12表面から体重を取り除いた後、皮膚と筋肉を縫合し、一時的に再現性のある麻痺を下肢に誘発しました[16,17]。 ラットは適切な条件と獣医管理の下で24時間維持された。

2.4。 Cistanchedeserticola抽出物の調製と定量分析

植物Cistancheニクジュヨウ（1 kg）は中国のガンスプロビンスから収集され、風乾され、電気グラインダーを使用して粉末化されました。 粉末をエタノール（70パーセント）で60分間抽出し、濾過し、減圧で濃縮した。 濃縮物は粉末内で真空乾燥された[18]。 の定量分析Cistancheニクジュヨウ抽出物は、前述のように高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して実行されました[11]。

2.5。 処理

実験群は以下の通りであった：群Ｉ（ＧＩ）、正常対照ラット。 グループII（GII）、脊髄損傷ラット（偽の対照）; およびグループIII–V（GIII–V）、100、200、または400 mg/kgのオリゴ糖を投与された脊髄損傷ラットCistancheニクジュヨウそれぞれ抽出します。 各グループには6匹のラットとCistancheニクジュヨウ抽出物をラットに6週間連続して経口投与した。

2.6。 採血

治療の最後に、心臓穿刺を通して23G1針を備えた5 ml注射器で血液（5〜6 ml）を採取し、ラットを塩酸ケタミン（100 mg / kg体重）とキシラジン（10 mg / kg体重）で麻酔しました。重量）そして斬首によって犠牲にされた。

2.7。 組織ホモジネートの調製

治療の最後に、ラットを塩酸ケタミン（100 mg / kg体重）とキシラジン（10 mg / kg体重）で麻酔し、断頭して屠殺した。 脊髄サンプル（12mm）を手術部位から採取した。 脊髄組織を小片に切断し、Tris-HClバッファー（pH 7.4、50 mM）で6000rpmで5分間ホモジナイズしました。 ホモジネートを遠心分離し、さらなる実験のために上清を収集した。 すべてのホモジネートおよび上清の調製は4度で行った。

2.8。 酸化ストレスのバイオマーカー

脂質過酸化は、チオバルビツール酸反応種（TBARS）を測定することにより、マロンジアルデヒド（MDA）含有量に従って決定されました。 最終生成物は534nmで測定されました[19]。 ROSは、ジクロロフルオレセインアッセイを使用して決定されました[20]。 還元型グルタチオン（GSH）含有量は、405nmで最終生成物を測定することによって決定されました[21]。 スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、グルタチオンペルオキシダーゼ（Gpx）、カタラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ（AChE）酵素活性は、分光光度法を使用して測定されました[19]。

2.9。 炎症マーカー

血清TNF-およびIL-6レベルはすべてのグループで決定されました[22]。 一酸化窒素（NO）レベルの指標として一酸化窒素含有量を測定し、mMで表した[23,24]。 TNF-、IL -6、iNOS、シクロオキシゲナーゼ-2、およびGAPDHのmRNA発現レベルは、Moonetal。 [25]。 この研究で使用したプライマーを表1に示します。

2.10。 アポトーシスのバイオマーカー

カスパーゼ-3、p53、bcl -2、bax、pro-NGF、およびGAPDHのmRNA発現レベルは、Moonetal。 [25]。 カスパーゼ-3、p53、bcl -2、bax、pro-NGF、およびGAPDHのタンパク質発現レベルは、Lobosetal。に従って決定されました。 [26]。 カスパーゼ-3とp53のTUNEL染色は、ニューロンの切片で行われました[25]。 RT-PCRに使用したプライマーを表1に示します。

2.11。 統計分析

値は、平均値（SEM）の標準誤差を含む平均値として表されます。 コントロールとCistancheニクジュヨウ抽出物で処理されたグループは、対応のないスチューデントのt検定を使用して比較されました。 多重比較には、一元配置分散分析（ANOVA）を使用しました。 P値˂0。05は統計的有意性を示すと見なされました。

3.結果

本研究では、オリゴ糖の治療効果Cistanche ニクジュヨウに対して抽出炎症, 酸化性ストレス、および脊髄損傷の雄アルビノラットのアポトーシスを調査した。オリゴ糖（78.68パーセント）、アクテオシド（9.29パーセント）、エキナコシド（6.34パーセント）、および8-エピロガン酸（5.75パーセント）の存在がCistanche ニクジュヨウ抽出します（図1）。 脂質過酸化の最終産物として測定されたMDA含有量は、正常対照ラット（GI）では22.58 nmol / gであり、偽対照ラット（GII）では179.5％大幅に増加しました。 からのオリゴ糖によるラットの治療Cistancheニクジュヨウ抽出物は、GVグループでMDA含有量を5 0 .1パーセント大幅に減少させました（表2、P b0.05）。 GSH含有量はGIグループで85.31mg/ gであり、GIIグループで61.1％大幅に減少しました。 による治療Cistancheニクジュヨウ脊髄損傷ラットの抽出物は、GVグループでGSH含有量を121.6％有意に増加させました（表2、Pb 0 .05）。

SOD活性はGIグループで6.2U/ mgであり、GIIグループで51.1％大幅に減少しました。 からのオリゴ糖を補充した脊髄損傷ラットCistancheニクジュヨウ抽出物は、GVグループで91.4％のSOD活性の有意な増加を示しました（表2、P b 0 .05）。 カタラーゼ活性はGIグループで12.8U/ gであり、GIIグループで59.3％大幅に減少しました。 からのオリゴ糖を補充した脊髄損傷ラットCistanche ニクジュヨウextractは、GVグループでカタラーゼ活性が1 0 6.1％増加したことを示しました（表2、P b0。05）。 GPx活性はGIグループで0.87（mg /タンパク質）であり、GIIグループで55.2パーセント減少しました。 GPx活性は、GVグループで100％増加しました（表2、P b 0.05）。 AChE活性は、GIグループで9.3（μmol/ min / mgタンパク質）であり、GIIグループで54.8％減少しました。 からのオリゴ糖を補充した脊髄損傷ラットCistancheニクジュヨウ抽出物は、GIII、GIV、およびGVグループでそれぞれ26.2、57.1、および1 0 7.1パーセントの有意に増加したAChE活性を示しました（表2、P b 0.05）。

ROSは、相対蛍光単位（RFU）で測定および表現されました。細胞内ROSはGIグループで44.23であり、GIIグループでは349％増加しました。 からのオリゴ糖の補給Cistancheニクジュヨウ抽出物は、GVグループで細胞内ROSレベルを61.9％大幅に減少させました（図2A、P b 0 .05）。 ナイトライト含有量は、NOレベルの指標として測定され、inmMで表されました。 NOレベルはGIグループで3.7（mM）であり、GIIグループでは349％増加しました。 からのオリゴ糖の補給Cistancheニクジュヨウ抽出物は、GVグループでNOレベルを63.6パーセント大幅に減少させました（図2B、P b 0 .05）。

IL -6およびTNF-レベルを測定し、pg/mgタンパク質として表した。 IL -6およびTNF-レベルは、GIIグループでそれぞれ912.7％および695.4％と大幅に増加しました。 ただし、からのオリゴ糖の補充Cistancheニクジュヨウ抽出物は、GIIグループと比較してGIグループでIL{{0}}およびTNF-レベルをN60パーセント大幅に減少させました（図3、Pb0。{{16 }} 5）。 IL -6、TNF-、シクロオキシゲナーゼ-2、iNOSなどの炎症マーカーのmRNA発現を定量化し、倍数変化として表現しました。 IL 6、TNF-、シクロオキシゲナーゼ-2、およびiNOSのmRNA発現レベルは、0。72-、0。81-、0。54-によって増加しました。 、および0。67-は、それぞれGIIグループで折りたたまれます。 補足Cistancheニクジュヨウ抽出物は、GIIグループと比較してGVグループでIL {{0}}、TNF-、シクロオキシゲナーゼ-2、およびiNOSのmRNA発現レベルをN20パーセント減少させました（図4、P b0.05）。

アポトーシスマーカーであるカスパーゼ{{0}}、p53、bcl -2、bax、およびプロNGFのmRNA発現も測定されました。 p53、カスパーゼ-3、bax、およびpro-NGFのmRNA発現レベルは0によって増加しました。97-、1。{{1 0}}、1。{ GIIグループではそれぞれ{12}}と0。76-倍であり、bcl-2mRNA発現レベルは0倍減少しました。67-倍。 抽出物処理により、p53、カスパーゼ-3、bax、およびpro-NGFのmRNA発現レベルがN3 0パーセント大幅に減少し、bcl -2 mRNA発現レベルは178パーセント増加しました（図。5、P b 0.05）。 ウエスタンブロット分析に基づくと、カスパーゼ-3およびプロNGFタンパク質レベルは、GIIグループでそれぞれ0。95-倍および0。68-倍有意に増加しました。オリゴ糖の補給からCistancheニクジュヨウ抽出物は、GIIグループと比較してGIグループでN2 0パーセントだけ大幅に減少したカスパーゼ{{0}}およびプロNGFタンパク質発現レベルを抽出します（図6、P b0.05）。 TUNEL染色アッセイを使用して、p53-およびカスパーゼ-3-陽性細胞の数を検出しました。 p 53-陽性細胞の数は、グループGI〜GVでそれぞれ1、79、54、33、および19でした。 カスパーゼ-3-陽性細胞の数は、グループGI–GVでそれぞれ2、87、51、23、および14でした（図7–8、P b 0.05）。

4。議論

本研究では、オリゴ糖の治療効果Cistancheニクジュヨウに対して抽出炎症、酸化ストレス、および脊髄損傷雄アルビノラットのアポトーシスを調査した。 Liuetal。 [27]は、抗酸化物質の補給がいくつかの神経変性疾患に対して効果的である可能性があると報告しました。 エキナコシド（フェニルエタノイド配糖体）の存在は、Cistancheニクジュヨウ抽出物[10]、およびいくつかの研究者は、の抗炎症および抗侵害受容特性を実証しましたCistanche ニクジュヨウ[28,29]。 本研究では、オリゴ糖、アクテオシド、エキナコシド、および8-エピロガン酸がCistanchedeserticola抽出物の主成分であることが観察されました。

TNFで改善された行動障害とアポトーシスは、エキナコシドによる治療後のSH-SY5Y神経細胞で観察されています[30,31]。 ナン他 [32]は、アルツハイマー病患者のTNF-、T-タウ、およびIL -1レベルの低下、およびCistancheハーブの補給後の海馬萎縮および認知能力の回復の改善を報告しました。 の治療効果Cistancheニクジュヨウ抽出する炎症、酸化ストレス、およびアポトーシスはこれまで報告されていません。 これはの薬理学的効果に関する最初の報告ですCistancheニクジュヨウ脊髄損傷ラットモデルで抽出します。

何人かの研究者は、アクテオシド治療が酸化ストレスと腸を大幅に減少させたと報告しています炎症炎症性腸疾患誘発マウス[33]。 ナムら [34]は、ヒト肥満細胞におけるAbeliophyllumdistichumからのイソアクテオシドの抗炎症活性を報告しています。 Clerodendrontrichotomumの葉からの抗炎症性フェニルプロパノイド配糖体がマウスモデルで報告されています[35]。 周ら。 [36]は、macrophageRAW264.7細胞におけるオリゴ糖の抗炎症活性を報告しています。 オリゴ糖モノマーは、炎症MAPKおよびNF-κB経路の抑制を介したLPS刺激マクロファージにおける[37]。

Fahnestocketal。 [38]は、プロNGFが脳の主要な形態であり、アルツハイマー病患者で増加していることを報告しました。 プロNGFに加えて、いくつかの切断されたタンパク質は、抗アポトーシス細胞応答を活性化します[39]。 成熟したNGFとプロNGFの比率は、細胞の生存率と死亡率のバランスをとる上で重要な役割を果たします[40]。 Ke Zhangetal。 [18]は、腫瘍形成の減少と、補充されたマウスの寿命の延長を報告しましたCistancheニクジュヨウエキス。 の神経保護効果Cistancheニクジュヨウ神経毒誘発性損傷に関する抽出物は以前に報告されています[41]。 Xuan and Liuetal。 [42]は、免疫機能、記憶、学習、および抗酸化の改善を報告しました。Cistancheニクジュヨウエキス。 ニクジュヨウ抽出物の補給は、虚血再灌流ラットモデルにおいてMDAを減少させ、GPxおよびSODレベルを上昇させました。 さらに、bax / BCL -2比の増加を伴うカスパーゼ-3のダウンレギュレーションが観察されました[43]。これは、脊髄における酸化、炎症、およびアポトーシスマーカーのレベルの低下を示す我々の発見と一致しています。補足された脊髄損傷ラットCistancheニクジュヨウエキス。

5。結論

要約すると、定量分析により、オリゴ糖、アクテオシド、エキナコシド、および8-エピロガン酸の存在が明らかになりました。Cistancheニクジュヨウエキス。炎症、酸化ストレス、およびアポトーシスマーカーは、Cistanchedeserticola抽出物からのオリゴ糖を補充した脊髄損傷ラットで大幅に減少しました。

研究の限界

この研究は、抗腫瘍および抗炎症効果を明らかにしていますが、Cistancheニクジュヨウ抽出にはいくつかの制限があります。 の急性効果を評価しましたCistancheニクジュヨウ腫瘍を抽出し、炎症脊髄損傷で。

資金調達

この研究は、中国国立自然科学財団（Grant No. 31370984、81501879、31870961、GZ1219）、四川省科学技術局（No. 2015HH004）、四川省健康家族計画委員会による科学研究プロジェクト（No. 。100097）。

競合する利益

すべての著者は、競合する利害関係はないと宣言しています。

著者の貢献

Hong Zhang、Zhou Xiang、Xin Duan、Juan li Jiangが実験を行い、原稿を起草しました。 Yi Ming Xing、Cheng Zhu、およびQiang Songは、文献レビューを収集し、生データ分析とデータ解釈を実施しました。 QinRongYuは原稿の知的内容を改訂しました。

差出人：'抗腫瘍およびアンチ-炎症性からのオリゴ糖の効果Cistancheニクジュヨウ脊髄損傷に関する抽出物Hong Zhang、et al

---H. Zhangetal。 / International Journal of Biological Macromolecules 124（2019）360–367

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