BCG誘発の訓練された免疫は探索的ランダム化臨床試験で無細胞性百日咳ワクチン接種反応を増強する
Apr 20, 2023
序章
百日咳は百日咳菌によって引き起こされる伝染性の高い急性呼吸器疾患であり、ワクチン接種率が高いにもかかわらず、深刻な公衆衛生上の問題として再浮上しています1。 先進国では長年にわたり、この病気は 1940 年代に実施された全細胞百日咳ワクチン (wP) によるワクチン接種によって制御されてきました。-1950。 これらのワクチンは非常に有効であり、長期的な予防効果をもたらしました。
しかし、高い反応原性と安全性への懸念により、1990 年代から 2000 年代に無細胞百日咳ワクチン (aP) に置き換えられました。 その後間もなく、破傷風およびジフテリアトキソイド（Tdap）と不活化ポリオウイルス（IPV）を含むまたは含まない混合ワクチン（Tdap-IPV）を含むaPブースターワクチンが導入されました。 aPワクチンは現在、未就学児、青少年、成人の免疫力を高めるために広く使用されています。 これらの対策とその改善された安全性プロファイルにもかかわらず、誘導免疫は依然として最適ではなく 2 、時間の経過とともに低下する 3 ことが複数の研究で示されています。 さらに、aP の反復投与後の防御期間は徐々に短縮されます 4-6。 新しく改良されたワクチン接種戦略に対するニーズの高まりにより、自然免疫を標的とし、aPs7 ～ 9 に対する特異的免疫を強化する新しいアジュバントの探索が行われています。
混合ワクチンは免疫力を高めることができます。 混合ワクチンは、複数の予防効果を同時に患者に提供する複数の異なる病気予防ワクチンを組み合わせたもので、複数回の注射によるストレスや痛みを軽減します。 同時に、混合ワクチンは、より多くの免疫反応を刺激し、より多くの抗体と免疫細胞を産生し、多くのさまざまな病気を予防する能力を効果的に向上させることができるため、ワクチン接種者の免疫力を向上させることもできます。 免疫力を高めることは私たちの日常生活において非常に重要です。 カンクサは免疫力を高める効果があります。 肉に含まれる多糖類は、人間の免疫系の免疫反応を調節し、免疫細胞のストレス能力を改善し、免疫細胞の殺菌効果を高めることができます。
カルメット ゲラン桿菌 (BCG) ワクチンは、結核などのマイコバクテリア感染症 10 を防御するだけでなく、マウス モデルにおける無関係な病原体による二次感染も防御します 1。 ヒトでは、これらの非特異的な有益な効果は乳児死亡率の減少と関連付けられており 11,12、ランダム化臨床試験で検証されています 10,13。 BCG は、自然免疫細胞に長期的な変化を引き起こし、無関係な病原体による刺激に対する反応性を高めます。 訓練された免疫と呼ばれるこのプロセスには、単球のエピジェネティックな再プログラミングが含まれ、BCG ワクチン接種後最長 1 年間持続します14。 訓練された免疫の臨床的関連性は、訓練された免疫の誘導のプロトタイプとしてBCGを使用し、二次免疫の混乱としてワクチン接種または実験的ヒト感染を使用する研究を通じて、ヒトで実証されています15-17。 BCGワクチン接種がワクチンに対する適応免疫反応を調節するという証拠が蓄積されている。 最近のレビューで評価された 8 件の研究のうち、5 件ではワクチン特異的な体液性反応の増強が示されました 18。
BCG と百日咳ワクチンの相互作用効果を明らかにする取り組みにより、BCG によって誘発される訓練された免疫が百日咳に対する免疫応答にプラスの効果をもたらす可能性が示唆されています。 マウスでは、事前の BCG ワクチン接種により、aP ワクチン接種後の Th1 および体液性免疫応答が増強されましたが、wP ワクチン接種後の増強は増強されませんでした 19。 ヒトを対象としたある集団規模の研究では、百日咳ワクチン接種とBCGの同時投与により、連続してワクチンを接種した場合と比較して乳児の死亡率が低下することが示されました20。 私たちの知る限り、これまでに訓練された免疫が百日咳ワクチンに対する免疫反応を調節するかどうかをランダム化対照研究で調査した研究や、BCGワクチン接種の投与タイミングを2回目のワクチン接種または攻撃と比較した研究はありません。
ここでは、BCGワクチン接種がワクチン接種に対する適応免疫反応に影響を与えるかどうか、そして訓練された免疫がそれらの反応に関連しているかどうかをテストしました。 我々は、BCG誘導の訓練された免疫が、Tdap-IPV免疫化の2週間後に、aP特異的抗体、aP特異的Th1細胞応答、および総記憶B細胞応答を強化することを示す。 これらの増加は、IL-1 や IL-6 などの訓練された免疫バイオマーカーの増加と正の相関がありました。 私たちの発見は、百日咳ワクチンに対する免疫の増強において、BCGワクチン接種によって誘発される訓練された免疫の役割を強調しています。
結果
研究デザイン
Seventy-five healthy female volunteers were randomized to one of three cohorts to receive BCG and Tdap-IPV vaccines in different orders21. We chose to enroll only women since gender-specific effects of pertussis vaccines have been reported 22. The median age of the volunteers was 23, with no significant difference in age between cohorts (Kruskal–Wallis test; P = 0.6), as previously reported21. Two subjects were excluded from analysis for having a high anti-pertussis toxin IgG concentration before Tdap-IPV vaccination (>100 IU/ml)、百日咳に最近感染したことを示します 23,24 (図 1a)。
訓練された免疫に関連するTdapIPVワクチン反応の変化を特定するために、「BCG訓練された」コホートはTdapIPVの3か月前にBCGを受けました。 また、BCGワクチン接種のタイミングを考慮して2つの対照コホートも含めました。 「BCG + Tdap」コホートは反対側の手足に両方のワクチン接種を同時に受け、「Tdap-IPV」コホートは最初にTdap-IPVを受け、3か月後にBCGを受けました（図1b）。 ワクチン接種の前後のいくつかの時点で血液を採取しました。 タイムスタンプは、Tdap-IPV ワクチン接種のベースライン (-M3=3 か月前、-M3 プラス W2 = 3 か月前 + 2 週間、Tdap-IPV の D0=ベースライン、またはBCG と Tdap-IPV の同時ワクチン接種、その後 W2=2 週間、その後 M3 プラス W2=3 か月プラス 2 週間、その後 Y1=1 年）。 主要アウトカムは、Tdap-IPV ワクチン接種後 2 週間または 1 年後の適応免疫応答の増加として特定されました。
合計で、3 つのワクチン接種コホートにわたって 31 の免疫学的結果を評価しました。 我々は、ビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイを使用して、百日咳抗原である百日咳毒素（PT）、線状赤血球凝集素（FHA）、パータクチン（PRN）、さらにはジフテリアトキソイド（DIPH）および破傷風毒素（TET）に対するIgGの抗体濃度を測定しました25。 総B細胞およびPRN特異的B細胞は、蛍光標識PRNを使用したフローサイトメトリーによって全血中で直接測定されました（補足図1）。 百日咳抗原に対する Th1 および Th17 T 細胞応答は、PRN、PT、または FHA のいずれかで末梢血単核球 (PBMC) を 7 日間刺激し、分泌された IFNα、IL22、および IL-17 を ELISA26 で測定することによって測定されました。
BCGワクチン接種は、無関係な刺激に対する免疫細胞のサイトカイン応答を強化しますが、この現象は2つの異なる生物学的メカニズムによって説明されています。 最初のプロセスは異種免疫と呼ばれ、T 細胞の非特異的活性化に依存します 27,28。 訓練された免疫と呼ばれる 2 番目のプロセスは、自然免疫細胞による炎症誘発性サイトカインの産生の増加をもたらします 14。 われわれは、BCG訓練を受けたコホートの副次転帰を、熱殺菌したカンジダ・アルビカンス（C_alb）、黄色ブドウ球菌（S_aur）、百日咳菌（Bp）による刺激後のPBMCのサイトカイン産生の変化と定義した。 、またはリポ多糖（LPS）。 以前の研究16,21と同様に、異種免疫または単球由来サイトカインIL-10の読み取り値として、7日後にTh1/17サイトカインIFN、IL-22、またはIL-17を定量しました。 、IL-6、IL-1、または訓練された免疫の測定値としての24時間後のTNF（図1b）。 超音波処理した結核菌 (Mtb) に応答したサイトカイン産生を測定して、抗マイコバクテリア免疫を定量化しました。
事前のBCGワクチン接種によりTdap-IPV誘導性の適応免疫反応が増強される
Tdap-IPVワクチン接種に対する訓練された免疫の効果を定量化するために、主要評価項目ごとに、サンプル時間、コホートメンバーシップ、および時間とコホートの相互作用を共変量として含む線形混合効果モデルを構築しました。 我々は 2 つの対照を検討した：（i）各コホート内のベースライン（D0）と比較した差異（ワクチン接種後の効果、補足表 1）、および（ii）それらの変化の大きさにおけるコホート間の差異（差分）効果、補足表 2)。 Tdap-IPV 免疫化後、すべてのコホートで 5 つの抗原に対する抗体応答が大幅に増加しました。 TETを除き、抗体濃度はワクチン接種後1年（Y1）までベースラインよりも高いままでしたが、BCGトレーニングコホートおよびBCG+Tdapコホートでは減少しました（補足図2a）。
すべてのコホートでは、免疫後 2 週間で循環 PRN プラス B 細胞の数が大幅に増加しましたが、これは主に記憶 B 細胞 (MBC) でした (補足図 3a)。 コホート間の差異は観察されませんでした（補足表2および補足図3b）。 Tdap-IPV コホートと比較して、BCG でトレーニングされたコホートは、PT、FHA、および PRN の IgG 応答について、ベースライン正規化された log1{{10}} 倍変化 (W2/D0) の向上を示しました。 これらの反応をBCG + Tdapコホートと比較すると、同様のパターンが観察されました（図2a）。 また、ワクチン接種後2週間のBCG訓練コホートでは百日咳特異的IgG濃度の上昇も観察されました（補足図2b）が、絶対値の差は、ベースラインと比較した増加の差ほど顕著ではありませんでした（補足図2b）。 D0。
さらに、BCG訓練を受けたコホートの被験者は、IgGクラススイッチMBCを含む総MBC応答の大幅な増加を示しました（図2bおよび補足図4）。 BCG訓練を受けたコホートの被験者も、3つの百日咳抗原すべてによる刺激に反応してIFN分泌の上昇を示しました。 逆に、Tdap-IPV コホート（PT）では 1 つの百日咳抗原、BCG と Tdap コホートでは 2 つの百日咳抗原で有意な増加が観察されました（PT および FHA、図 2c および補足図 5）。 また、統計的有意性には達しませんでしたが、BCG訓練コホートではIFNg産生の増加が他のコホートよりも高い傾向も観察されました（補足表2および補足図5b）。 百日咳特異的な IL-22 および IL{13}} 反応は、すべてのコホートで弱かった（補足表 1）。 まとめると、これらの所見は、他の 2 つのコホートと比較して、BCG 訓練コホートにおいて百日咳特異的抗体応答が増強され、総 IgG スイッチ MBC 応答が増強され、より広範な百日咳特異的 IFN 応答が示されていることを示しています。
われわれは、BCG訓練を受けたコホートで強化された主要アウトカムの増加との間の関係を調査した。 この探索的分析では、各コホートの抗体、B 細胞、サイトカイン間の相関関係が計算されました。 BCGで訓練されたコホートは、これらの反応間に多くの有意で定量的に強い正の相関を示しましたが、Tdap-IPVおよびBCG + Tdapコホートは弱い相関または逆相関を示し、最も強いパターンはIFN反応の変化に対応しました（図3a）。 BCG訓練を受けた集団における反応間の相関係数は、対照コホートのものよりも有意に大きく、全体として、BCG訓練を受けたコホートにおけるより高度に調整された百日咳特異的適応免疫応答の誘導を示していた（図3b）。
IL{0}} および IL-6 サイトカイン産生は百日咳特異的適応免疫応答と関連しています
BCGで訓練されたコホートは、総IgGスイッチMBCおよび百日咳特異的IFN応答の増強を示した。 さらに、Tdap-IPV および BCG プラス Tdap コホートと比較して、BCG で訓練されたコホートはより高い百日咳抗体反応も示しました。 ヒトにおけるBCGワクチン接種は、ワクチン接種後数週間から数か月後に、異種刺激に応答して循環免疫細胞のサイトカイン産生を増加させる可能性があるため27、これらのBCG誘発サイトカイン応答がTdap-IPVワクチン接種後の百日咳特異的免疫応答の変化と関連しているかどうかを評価した。 BCGワクチン接種後2週間および3か月後、BCGワクチン接種ベースラインと比較してIL-22およびIFN産生の増加を特徴とする抗マイコバクテリア反応が大幅に増強されました（補足図6a、b）。
全体として、BCGで訓練されたコホートは、以前に観察されたように、異種免疫または訓練された免疫関連サイトカインの産生の増加を示さなかった（補足図6および8）21。 ただし、サイトカイン産生の誘導は個人によって異なるため、BCGベースラインと比較したBCG後2週間とBCG後3か月間の変化を計算しました（補足図7および9）。 ピアソン相関を計算して、各時点でのこれらの測定値間の関連の強さを決定しました。 BCG ワクチン接種後 3 か月後、つまり Tdap-IPV ベースラインでは、インビトロ刺激に対するサイトカイン応答は高度に相関していました。 異種免疫関連サイトカイン応答は、訓練された免疫関連サイトカイン応答と負の相関があり、その中で、IL-6 と IL-1 の相関が最も強かった（図 4）。これまでに説明したように 16。 BCGワクチン接種後2週間の相関パターンは、異種免疫関連サイトカインについては同様であったが、訓練された免疫関連サイトカイン間の相関は、IL-10応答を除き、はるかに弱かった。 総合すると、これらの結果は、BCGで訓練されたコホートにおいてBCG免疫後3か月では調整された自然免疫活性化がみられるが、2週間目では活性化されないことを示している。
次に、BCG訓練を受けたコホートのサイトカイン応答の変動がTdapIPV適応免疫エンドポイントの変化と関連しているかどうかを調査した。 BCGワクチン接種後2週間および3か月後のサイトカイン産生の変化を調べました。 異種免疫関連サイトカインの増加は、BCGワクチン接種後2週間（補足図10）と3か月後（図5a）の両方で主要評価項目と弱く負の相関がある傾向があることがわかりました。 対照的に、BCGワクチン接種後3か月後の訓練された免疫関連サイトカインの増加、特にLPS刺激に応答したIL-1 /IL-6の増加は、PRNおよびFHA抗体応答、IFN産生と有意に正の相関があった。 PT刺激に対する反応、および総IgGスイッチMBC反応（図5b、c）。
これと一致して、末梢血細胞数の相対存在量の変化は観察されず（補足図11a）、BCGワクチン接種後3か月の細胞存在量の変化も百日咳のエンドポイントと正の相関はありませんでした（補足図11b）。 BCG ワクチン接種後 3 か月後の LPS 刺激 (IL1b. LPS) に応答した IL-1 産生の増加は、複数の Tdap-IPV 応答との強い関連性を示し、各応答の変動をどの程度説明できるかを決定するために選択されました。 。 各結果について説明された合計分散（予測Rsq）が計算され、IL-1の変化は応答変動の最大60パーセントを説明できました（図5d）。 全体として、これらの結果は、BCGワクチン接種後3か月で訓練された免疫関連サイトカイン応答が、百日咳特異的抗体応答およびIFN産生、ならびに総IgGスイッチMBC応答の増加と相関していることを強調している。
議論
ヒトにおける訓練された免疫の誘導は、BCG ワクチン接種の数週間から数か月後に起こり 14、その後のヒトの免疫に対する反応に影響を与える可能性があります 16,17。 今回我々は、Tdap-IPVのブースター投与の3か月前（同時ではない）のBCGワクチン接種によって誘導される訓練された免疫が、百日咳IgG応答を増強し、百日咳特異的な細胞応答を調節することを示す。 いくつかの研究ではBCGと他のワクチンの相互作用効果が調査されており、これらの研究のほとんどは百日咳免疫応答に対するBCGのプラスの効果を報告しています20、21、29、30。 しかし、我々の知る限り、百日咳に対するBCGワクチン接種のタイミングを調査した研究や、BCG誘発の訓練された免疫反応のどの特徴がワクチン反応性の増強と相関するのかを研究した研究はこれまでにない。
３つのコホートすべての対象は、ＴｄａｐＩＰＶによるワクチン接種後２週間で、抗百日咳液性反応およびＰＲＮ＋Ｂ細胞反応を開始した。 PRN 抗体応答は BCG で訓練されたコホートではるかに高かったが、PRN 特異的 B 細胞応答では同様のパターンは観察されませんでした。 これは、BCGで訓練されたコホートにおける抗体の誘導がより速く、半減期が長いため時間の経過とともに蓄積することで説明できる可能性があります。
しかし、抗体濃度はワクチン接種後 2 週間前に測定されなかったため、コホート間の動態の違いを推定することはできませんでした。 PRN 抗体反応の増加に加えて、BCG で訓練されたコホートでは FHA および PT 抗体反応もより高いこともわかりました。 残念ながら、B 細胞に対する FHA および PT の非特異的結合が高いため、PT および FHA 特異的な B 細胞応答を測定することはできませんでした。 それでも、総 IgG MBC 応答が BCG で訓練されたコホートで増加し、これらの増加が抗体応答の増加と相関していることは有望です。 また、百日咳抗原の再刺激に応じた IFN 応答が、BCG で訓練されたコホートで増強されていることもわかりました。 これらの変化は比較的小さかったものの、W2-D0 の変化が他のコホートよりも大きい傾向が観察されました。 より多くの被験者を対象としたさらなる研究は、このパターンを検証するのに役立つ可能性があり、これはマウス研究で確認されています19。 同様に、新生児BCGワクチン接種も破傷風トキソイドに対するTh1応答を増強することが示されています31。
百日咳抗体、総 IgG MBC 応答、百日咳 IFNg 応答の増加は、BCG 訓練を受けたコホートにおいて相互に強い相関があり、エフェクター機能と記憶機能の協調的な活性化が示唆されました。 さらに、BCG訓練コホートにおけるPT再刺激に応答した百日咳抗体、総IgGスイッチMBC応答、およびIFNの増加は、先天性応答、特にIL-1およびIL-6と関連していた。 これらの結果は、インフルエンザワクチン接種に対するBCGの効果を研究した私たちのグループによる以前のヒト研究と一致しています17。 訓練された免疫のバイオマーカーとしての IL{6}} /IL-6 経路の重要性は、黄熱ワクチン接種後の実験的ウイルス感染モデルでも強調されています16。 全体として、特定の微生物刺激と主要結果との間に相関関係は観察されなかった。これは、特定の刺激条件ではなく、サイトカイン反応経路の全体的な変化が百日咳ワクチン接種に対する反応性の向上に関連していることを示唆している。 微生物刺激に対する主な IL{9}} および IL{10}} 応答は単球と樹状細胞に由来すると予想されますが 16、B 細胞もサイトカイン産生に寄与している可能性があり 32、B 細胞が寄与する可能性を排除することはできません。
重要な問題は、BCGによって誘導された訓練された免疫がワクチン接種後どのくらい持続するかということである。 インビトロでは、ヒトにおける BCG 誘発の訓練された免疫の兆候が、早ければ 2 週間で、ワクチン接種後最大で 1- 年後まで確認されています14。 これらの発見を生体内反応性に翻訳することを目的としたヒトでの臨床研究では、観察期間がBCGワクチン接種後最大5週間に制限されています15-17。 以前に報告されているように、我々は、訓練された免疫関連サイトカインIL-6およびIL-1の誘導が以前の研究16よりも弱いことを観察しました21。 BCG ワクチンの製造におけるバッチ間の変動は、訓練された免疫の誘導に影響を与える可能性があり、この研究で観察された効果を説明できる可能性があります 33。
さらに、BCG 株間の差異も観察されており、それが免疫原性と臨床効果に影響を及ぼします 34-36。 それにもかかわらず、本発明者らは、BCGワクチン接種後3か月、つまりTdap-IPVワクチン接種の時点ではあるが、BCGワクチン接種後2週間ではない異種IL-1およびIL-6応答が百日咳の増強と関連していることを実証している。体液性免疫と細胞性免疫。 これらの発見は、訓練された免疫がBCGワクチン接種後過去2週間も発達し続けていることを示唆しており、循環自然免疫細胞のベースラインの機能的「応答性」が、より強力なワクチン応答の発達にとって重要である可能性があることを強調しています。
この研究は、事前のBCGワクチン接種がaPワクチン抗原に対する反応性を高めることができることを実証しています。 驚くべきことに、TET と DIPH ではこの効果は観察されませんでした。 これは、国の予防接種プログラムで推奨されているように、すべての成人が9歳の時点で事前にTd-IPVの追加免疫ワクチン接種を受けていたが、aPの追加ワクチン接種は受けていなかったことによって説明される可能性がある。 これと一致して、aP 抗原のベースライン抗体濃度は、本研究の被験者間で高度に相関しているが、DIPH および TET とは相関していないことがわかり、これらの成分に対する体液性免疫が aP 抗原と同期していないことを示唆しています（補足）図12）。 ベースラインの DIPH および TET 抗体レベルは高度に相互相関しており、これはワクチンでの同時投与と一致しています。 したがって、異なるワクチン成分に対する既存の免疫の変動は、BCG ワクチン接種と訓練された免疫の能力において、Tdap-IPV に対する反応に影響を与える役割を果たしている可能性があります。
Although our study was not designed to investigate vaccine efficacy, a major question is whether the enhanced antibody response that we observed in the BCG-trained cohort may translate into better clinical protection. There is much debate about the correlates of protection against pertussis37. Nonetheless, PT antibodies have previously been used to correlate with clinical protection against disease (>２５ＩＵ／ｍｌ）２９． この閾値を使用すると、BCGトレーニングコホートおよびBCG + TdapコホートではTdapIPV後2週間でほぼ完全な血清防御が達成されましたが、Tdap-IPVコホートの被験者の一部は血清防御されませんでした（補足図13）。
抗体に加えて、T 細胞免疫、特に Th1 および Th17 応答も、動物モデルにおける百日咳に対する防御にとって重要であることが強調されています 2,38。 われわれは、BCGで訓練されたコホートが百日咳抗原の再刺激に応答してIFNの増加を示したことを発見した。これはTh1免疫の読み取り値であり、したがって百日咳に対する臨床防御の向上を示唆している可能性がある。 最後に、T 細胞、B 細胞、体液性反応などの百日咳特異的適応免疫の定量化を目的とした現在の免疫学的エンドポイントは、防御の免疫学的相関関係としてまだ検証されていません。 この知識のギャップを埋めるには、疫学研究の実施や、最近確立された百日咳菌の管理されたヒト感染モデルの使用など、いくつかの可能性があります39。
私たちの探索的研究の限界は、研究対象集団が乳児期に全細胞DTPワクチンで初回刺激を受けた成人で構成されていたことである。全細胞DTPワクチンは初回刺激から数十年後の百日咳に対する適応反応に影響を与え、子供のT細胞免疫の誘導に影響を及ぼすことが知られている。追加ワクチン接種に対する反応40。 したがって、我々の発見が定期的な小児用aPワクチン接種の時代に生まれた子供たちに当てはまるかどうかを判断することが重要になるだろう。 さらに、女性のみを含めたので、男性との違いが存在するかどうかを判断することが重要です。 この探索的研究では、抗体応答、合計および PRN プラス B 細胞応答、抗原特異的 T 細胞応答を含む抗百日咳免疫原性エンドポイントを測定しました。 評価された免疫応答の標的化された性質のため、P 値は複数の検査では補正されませんでした。 重要なのは、この研究は西ヨーロッパ（オランダ）系のボランティアを対象に実施されたものであり、将来の研究では、異なる遺伝的背景を持つ集団でも同様の効果が見られるかどうかを調査する必要がある。 もう 1 つの制限は、サイトカインのサブセットのみが測定されたことです。 これは私たちがテストすることを目的とした特定の仮説には適切でしたが、サイトカインやその他の反応のより包括的で公平なプロファイリングにより、新たな洞察が得られる可能性があります。
結論として、本研究では、Tdap-IPVワクチン接種の3か月前に投与されたBCGワクチン接種が抗百日咳免疫を有意に増強し、訓練された免疫のバイオマーカーがこれらのワクチン接種反応の増強の最も信頼できる相関関係であることを報告する。 多様な研究集団にわたってこれらの発見を評価するには追加の検証研究が必要であり、IL-1 および IL-6 経路の役割を機構的に検証するにはさらなる免疫学的および遺伝学的研究が必要です。 全体として、BCG によって調節できるベースラインの自然免疫機能の描写は、ワクチン誘発性の適応免疫応答を優れた免疫原性と疾患に対する防御に導く方法を理解するために不可欠です。
方法
臨床試験
この単一施設のランダム化非盲検試験は、1621 年 3 月 2 日から 1621 年 7 月 2 日まで、ラドボウド大学医療センター (オランダ、ナイメーヘン) で実施されました。 研究計画書は臨床試験に登録されます。 gov (NCT02771782) であり、アーネム・ナイメーヘン医療倫理委員会によって承認されました。 ボランティアは掲示板やナイメーヘンのラドボウド大学で募集され、適度な報酬を受け取っていた。 以前にBCGのワクチン接種を受けていないか、最近百日咳ワクチンの接種を受けていないボランティアも含まれていました。 除外基準は、(i) 以前の BCG ワクチン接種、または百日咳含有ワクチンの最近のワクチン接種、(ii) ネオマイシン、ポリミキシンに対するアレルギー、またはジフテリア、破傷風、百日咳、またはポリオワクチンの以前のワクチン接種に対するアレルギー反応、(iii) 全身性ワクチンの使用でした。経口避妊薬以外の薬剤、および (iv) 妊娠または免疫不全に起因する疾患の病歴。 コホートサイズは、自然免疫応答に対するBCGワクチン接種の影響を調査した、私たちのグループによって実施された以前の研究に基づいて決定されました16。 研究アーム間のランダム化は、ソフトウェアベースのアルゴリズムを使用して実行されました。 すべての被験者は、生後 1 年目に全細胞百日咳による初回免疫の病歴を持っていました。 75人の女性ボランティアが参加した。 書面によるインフォームドコンセントを得た後、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはリチウムヘパリン（LiHep）チューブに血液を採取し、ワクチン接種を実施しました。 全血球計算は、Sysmex XN-450 血液分析装置を使用して取得しました。 被験者はBCG Danish 1331（Staten Serum Institut、コペンハーゲン、デンマーク；0.1 ml皮内）およびTdap-IPV（Boostrix Polio、GlaxoSmithKline；0.5 ml筋肉内）を受けた。 血清は分析まで-20度で保存し、全血は以下に説明するようにさらなる分析のために処理されました。 この原稿の作成には、治験報告統合基準 (CONSORT) ガイドラインが使用されました (補足図 14)。
血清学的分析
蛍光ビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイを使用して、血清を PT、FHA、PRN、TET、および DIPH 特異的 IgG 抗体濃度について分析しました 25。 抗原は、異なる色分けされた活性化カルボキシル化 MicroPlex マイクロスフェア (ビーズ) (Luminex、米国テキサス州オースティン) に共有結合しました。 次の抗原をカップリングに使用しました:高度に精製された PT (オランダワクチン研究所)、FHA (化血研、熊本、日本)、大腸菌構築物から発現および精製された P.69 PRN41、ジフテリアトキソイド (オランダワクチン研究所)、および破傷風毒素（T3194、シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国）。 PBSでの洗浄ステップ後、2.5 mgの1-エチル3-({{20}}を含むPBS中で12.5×106カルボキシル化ビーズ/mLを活性化しました)ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) および 2.5 mg の N-ヒドロキシスルホスクシンイミド (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)。 カップリング用の抗原を、12.5 × 106 個の活性化ビーズあたり 10 μg の PT、FHA、または PRN、100 μg の DT、または 25 μg の TET の濃度まで PBS で希釈し、暗所、室温で 2 時間インキュベートしました。一定の回転。 ３回の洗浄工程の後、抗原結合ビーズを、使用するまで０．０３パーセント（重量／体積）アジ化ナトリウムおよび１パーセント（重量／体積）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中で４℃の暗所で保管した。 0.1 パーセント (vol/vol) Tween 20 および 3 パーセント (wt/vol) BSA を含む PBS で 1/200 および 1/4000 に希釈した血清を、96- ウェル フィルター プレート内で抗原結合ビーズとともに 45 分間インキュベートしました室温、午後7時50分、暗所。 希釈系列の参照血清、品質管理血清、およびブランクが各プレートに含まれていました。
社内の百日咳用参照標準は、WHO 1st IS Part 06/140 に基づいて校正され、6 ウェルで連続希釈されました（1/200 ～ 1/204800）。{4} DIPH および TET の社内参照標準は、WHO NIBSC DI-3 および TE-3 に対して校正され、8 ウェルで連続 4- 倍（1/50 ～ 1/819200）に希釈されました。 インキュベーション後、ウェルを PBS で 3 回洗浄し、R-フィコエリトリン標識ヤギ抗ヒト IgG 抗体 (Jackson Immunoresearch Laboratories、米国ペンシルバニア州ウェストグローブ) と 30 分間インキュベートし、洗浄しました。 ビーズを PBS に含め、蛍光強度中央値 (MFI) を Bio-Plex LX200 で取得しました。 MFI は、Bioplex Manager 6.2 ソフトウェア (Bio-Rad Laboratories、Hercules、California、USA) を使用して、5- パラメーター ロジスティック標準曲線から内挿することによって IU/mL に変換され、Microsoft Excel にエクスポートされました。
PBMC の分離、刺激、サイトカインの検出
PBMC を Ficoll 密度勾配遠心分離によって単離し、ゲンタマイシン、グルタマックス (GIBCO)、およびピルビン酸を添加した RPMI 培地 (Roswell Park Memorial Institute 培地; Invitrogen, CA, USA) に 5 × 106 /ml で再懸濁しました。 丸底96-ウェルプレート（Corning）の各ウェルに合計100μlを等分し、RPMI（ネガティブコントロール）、大腸菌リポ多糖（LPS; 10 ng/ml、Sigma-Aldrich）、超音波処理した結核菌 H37Rv (5 ug/ml)、加熱殺菌した黄色ブドウ球菌 (1 × 106 /ml、臨床分離株)、加熱殺菌したカンジダ アルビカンス (1 × 106 /ml、UC820 株)、および加熱殺菌した百日咳菌 ( 1μg/ml、B1917株）、PT（2μg/ml）、PRN（4μg/ml、試薬タンパク質、PFE-031）、およびFHA（2μg/ml）。 PT と FHA は、国立公衆衛生環境研究所 (RIVM、ビルトーフェン、オランダ) の AM Buisman のご厚意により提供されました。 IL-1、IL-6、IL-10、TNFの検出の場合は細胞を37度、5%CO2で24時間、IFN、IL{{31}の場合は7日間インキュベートしました。 }、およびIL-17。 上清は-20度で保存しました。 R&D システム (IL-1、TNF、IL17、IL-22) または Sanquin (IL-6、IL) の酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) キットを使用して、PBMC 培養上清中のサイトカインを測定しました。 -10、IFN ) 製造元の指示に従ってください。
B細胞フローサイトメトリー
B 細胞染色は、抗原特異的 B 細胞を検出するための蛍光標識 PRN を含む抗体染色パネル (補足表 3) を使用して全血に対して直接実行されました。 PRN 特異的 B 細胞を標識するために、メーカーのプロトコール (PRN-FITC) に従って、PRN (試薬タンパク質、PFE-031) をフルオレセイン (FITC 抗体標識キット、Pierce) に結合させました。 LiHep チューブに採取した新たに採取した全血を合計 1 ～ 2 ml FACS バッファー (PBS プラス 0.{{10}}9% NaN3 プラス 0.2% ウシ血清アルブミン、 Calbiochem) と細胞をペレット化し、FACS バッファーで 2 回洗浄しました。 細胞をFACSバッファーに再懸濁し、B細胞表現型解析抗体カクテルで15分間染色し、固定し(FACSLysing、BD Biosciences)、FACSバッファーで再度洗浄した後、染色から1時間以内に分析しました。 全血中の PRN 抗原特異的 B 細胞のフローサイトメトリーは、標準化された機器設定を備えた LSRII (BD Biosciences) フローサイトメーターで実行されました 42。 フローサイトメトリーデータは、Infinicyte (バージョン 2.0、Cytognos) で分析されました。 サンプルごとに、リンパ球ゲートで 2 × 106 細胞が取得されました (補足図 1a)。 ダブレットおよび残骸を除去した後、リンパ球をゲート制御した。 B 細胞は CD45 プラス CD19 プラスとして同定され、PRN-FITC 特異的 B 細胞は同定されました。 B 細胞サブセットは、適応されたゲート戦略を使用して特定されました 43。 フローサイトメトリーによる PT 特異的 B 細胞の検出を試みましたが、非特異的染色によるバックグラウンドの高さにより失敗しました。
統計
サイトカインと抗体の値は、分布の偏りを考慮して対数変換されました。{0} 一次または二次結果の反応の分析は、「lme4」44 R パッケージを使用した混合効果回帰モデルで分析されました。 各結果に対するモデルの式 (R 表記) は次のとおりです。
比較は「平均」45 R パッケージを使用して計算され、2 つの対照を調べました。 まず、主要評価項目が各コホート内の Tdap-IPV ワクチン接種ベースラインと比較して有意に異なるかどうかを調べました（ワクチン接種後の効果は、各コホート内の W2–D0 として定義されました、補足表 1）。 次に、それらの変化の大きさにおけるコホート間の違いを調べました（差動効果、補足表2、(W2c1 – D{{10}}c1) – (W2c2 – D0として定義） c2) ここで、c1 と c2 は、特定の比較の異なるコホートを指します)。 BCG訓練を受けたコホートにおける異種免疫サイトカインまたは訓練された免疫サイトカインの変化も同様に分析した。 P 値は、Kenward-Roger の自由度法を使用して報告されます。 統計パラメータは、図および図の凡例に直接報告されます。 探索的研究デザインと標的免疫応答の評価により、複数の検査による補正は行われませんでした。 ペアワイズ相関は、ベースラインに対する対数倍の変化値を使用して実行されました。{21} 主要結果変数に対するサイトカイン測定によって説明される分散の推定は、R パッケージ「キャレット」46 を使用して実行されました。潜在的な過剰適合を考慮して、10 回繰り返し、4- 倍の交差検証を実行しました。 PT、TET、または DIPH に対する血清防御抗体力価をフィッシャー直接確率検定で分析しました。 血清防御状態とコホートとの間の関連性は、カイ二乗検定の残差を調べることによって決定されました。 PT に対する血清防御の閾値は 25 IU/ml18、DIPH および TET については 0.1 IU/ml でした 37)。
レポートの概要
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。
データの可用性
この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。
コードの利用可能性
この研究の結果を裏付ける R コードは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。
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謝辞
PBMC 再刺激実験に使用した PT および FHA 抗原を提供してくださった Anne-Marie Buisman (RIVM) に感謝します。 トライアルに参加していただいたボランティアの皆様に感謝いたします。 この研究は、オランダ国立公衆衛生環境研究所 (RIVM) の支援を受けました (SPR プロジェクト S112200)。 MGN は、ERC Advanced Grant (#833247) とオランダ科学研究機構からの Spinoza 助成金によって支援されました。
著者の寄稿
概念化: BAB、MGN、RvC、および DAD。 方法論: ES、MJE、GAMB、PGMvG、BAB、LCJdB。 調査: ES、MJE、GAMB、PGMvG、BAB、LCJdB、JG。 正式な分析: JG; 執筆・原案：JG、DAD。 執筆レビューと編集：すべて。
競合する利益
MGN は、TTxD にライセンスされた訓練された免疫を阻害するナノ生物学の特許と、TTxD にライセンスされた訓練された免疫を刺激するナノ生物学の特許を持っています。 他のすべての著者は潜在的な矛盾を報告していません。 すべての著者は、潜在的な利益相反の開示に関する ICMJE フォームを提出しています。
追加情報
補足情報 オンライン版には、https://doi.org/10.1038/s41541-022-00438-4 で入手できる補足資料が含まれています。
通信および資料のリクエストは、Dimitri A. Diavatopoulos 宛てに行ってください。
再版と許可に関する情報は、http://www.nature.com/reprints で入手できます。
発行者注記 Springer Nature は、発行された地図における管轄権の主張および所属機関については中立を保っています。
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