臍帯血治療のアンチエイジング効果をモニタリングするためのバイオアッセイ
Feb 27, 2022
Sang-Hun Bae1 *、Ala Jo1,2 *、Jae Hyun Park1、Chul-Woo Lim1、Yuri Choi1、Juhyun Oh2、Ji-Min Park1、TaeHo Kong1、Ralph Weissleder2,3、Hakho Lee2、Jisook Moon1
1.大韓民国京畿道13488CHA医科大学生命科学部バイオテクノロジー学科
2.マサチューセッツ総合病院、ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州02114、米国のシステム生物学センター
3.米国マサチューセッツ州ボストンのハーバード大学医学部システム生物学科*これらの著者は等しく貢献しました。
対応する著者：Hakho Lee、PhD。 Center for Systems Biology、Massachusetts General Hospital、185 Cambridge St、CPZN 5206、Boston、MA 02114、USA。 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon、PhD。 大韓民国京畿道城南市盆唐区Pangyo-ro335、CHA医科大学生命科学部バイオテクノロジー学科。 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr
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受信：2018.10.04; 承認済み：2018。11. 18; 公開日：2019.01.01
概要
バックグラウンド：発達初期の血漿（例えば、臍帯血漿）で老齢動物を治療することは、神経および認知機能の加齢に伴う劣化を遅らせるという印象的な可能性を示した。 ただし、そのような所見を臨床の現実に変換するには、治療効果を評価するための効果的な方法が必要です。 理想的な方法は、侵襲性が低く、連続アッセイに適し、費用効果が高く、定量的である必要があります。
メソッド：監視するための新しいバイオセンサーアプローチを開発しました老化防止治療。 2つの主要なセンサーコンポーネントを進化させました。i）血液由来の代謝物が代理老化マーカーとして特定されました。 ii）コンパクトで費用効果の高いアッセイシステムがオンサイトアプリケーション用に開発されました。 老齢マウスをヒト臍帯血漿または生理食塩水で治療しました。 マウス血漿の偏りのない代謝物プロファイリングにより、アラキドン酸（AA）が老化防止効果。 次に、プラズマから直接AAを検出するために最適化された競争力のある磁気電気化学センサー（cMES）を実装しました。 開発されたプラットフォームは、1.5時間以内に少量の血漿（0 .5 µL）からAAを直接検出できました。
結果：cMESアッセイにより、AAレベルとアンチエイジング効果：AAレベルは、加齢とともに減少しますが、プラズマ処理された加齢マウスでは増加し、学習と記憶のパフォーマンスも改善されました。
結論：cMESプラットフォームは、プレおよびクリニカルの両方に力を与えます老化防止低侵襲の長期治療サーベイランスを可能にすることによる研究。 これらの能力は、老化防止治療、個人の生活の質を向上させます。
キーワード：アンチエイジング、アラキドン酸、代謝物プロファイリング、磁気電気化学センサー、バイオセンサー
序章
老化は、認知変性（例えば、神経変性、認知症）および他の慢性疾患（例えば、癌、心血管疾患、筋肉変性）の臨床的危険因子としてますます認識されています[1]。 人間の寿命が延び、高齢者人口が増加するにつれ、老化のメカニズムを解明し[1–3]、老化プロセスを遅らせる、あるいは逆転させる治療戦略を見つけるための重要な取り組みが進行中です[4]。 確かに、動物実験からの有望な結果が報告されています。 若いマウスから血漿輸血を受けた成体マウスは、認知機能、シナプス可塑性、および神経活動を取り戻しました[5]。 の急速な開発老化防止治療とそれらのヒト試験への変換が期待されています[6]。 ただし、治療効果を監視するための現在の測定基準は、方法を人間に適用するのが難しい場合が多く（たとえば、侵襲的な脳イメージング、制御された行動観察）、主観的（たとえば、患者の経験に関する質問票）であるため、実用性が限られています。 前進するための1つの重要な要件老化防止したがって、治療法は、治療モニタリングのための定量的で低侵襲のアッセイを開発することにあります。
代謝物が強力な供給源になると考えました老化防止バイオマーカー。 代謝物は生物に不可欠な表現型であり、他の疾患の診断バイオマーカーとして研究されています[7]。 特に、老化は通常、代謝の変化または機能不全に関連しており、これは生物の全体的な代謝物プロファイルに影響を及ぼします。 このように、代謝物の組成および/またはレベルを追跡することは、老化防止処理。 さらに、特に血液検査の形での代謝物アッセイは、定量的で低侵襲である可能性があります。 これらのメリットは、さまざまな治療レジメンまたは患者グループの通知、および連続サンプリングによる（アンチ）エイジングダイナミクスの監視を容易にします。
ここでは、監視のための新しいバイオセンサー戦略について説明します老化防止処理。 2つの重要な要素が進歩しました。i）血液由来の代謝物が代理老化マーカーとして特定されました。 ii）日常的な臨床環境でのアプリケーション向けに、高速で費用効果の高いアッセイシステムが開発されました。 具体的には、高齢マウス（約2歳）のコホートをヒト臍帯血からの血漿で治療しました。 マウスの血液に関する包括的なメタボロミクス分析により、加齢とともにレベルが大幅に低下したアラキドン酸（AA）が、治療群で逆に増加したことが明らかになりました。 この観察により、小分子ターゲット用の磁気電気化学センサーを考案しました。AAが磁気ビーズに捕捉され、より高い感度を得るために濃縮される競合電気化学反応を最適化しました。 開発されたプラットフォームは、1.5時間以内に少量の血漿（0。5 µL）からAAを直接検出できました。 このプラットフォームを使用すると、血中AAレベルと運動課題における動物のより良いパフォーマンスとの間に正の相関関係をさらに確立することができます。
結果
成体マウスを臍帯血血漿で治療する図1aは、全体的な実験スキームを示しています。
薬剤として、ヒト臍帯血サンプルに由来する血漿を使用しました。 以前の研究では、若いマウス血漿を注射された老齢マウスは空間記憶機能を回復し、ヒト臍帯血血漿の全身投与は老齢マウスの海馬依存性認知を改善することが示されました[5、8]。 細胞成分を含まない血漿を注入することで、種の不一致による免疫拒絶反応のリスクを最小限に抑えました。 老齢のマウス（開始年齢、18ヶ月齢）を無作為化し、尾静脈注射（130 µL;詳細は図S1を参照）を介して血漿（治療群）または生理食塩水緩衝液（偽群）のいずれかを投与しました。 陽性対照として、若いマウス（生後3ヶ月）を使用した。 臍帯血に由来する血漿はプールされず、各マウスに同じドナーからの血漿が繰り返し注入されました（図S1）。 4-週間の治療後、マウスを行動テスト（すなわち、ロータロッド）にかけ、分析のために採血しました。
図1.実験計画。 ヒト臍帯血血漿は、若い（3-月齢）、古い（20-および23-月齢）、および血漿処理された古いグループ（20-）に投与されました。および23-月齢）。 3つのグループは、運動協調性と学習を測定するために2-試行ロータロッドテストを受けました。 非標的代謝物プロファイリングは、3つのグループからの血液で実行されました。老化防止-関連する経路は、バイオインフォマティクスアプローチによって決定されました。 バイオセンサーは、経路の最も重要な代謝物を検出するために開発されました。
図2.ヒト臍帯血血漿治療に関連する代謝物バイオマーカーの決定。 （A）代謝物摂動のグローバルプロファイル。 行は、LC / MSおよび列からサンプルまでの機能（m / z値と保持時間の一意の組み合わせ）に対応します。 行は階層的にクラスター化されています。 （B）次元削減のためのPCAのスコアプロット。 サンプルは主成分（PC）1および2に対してプロットされました。軸の凡例の括弧内の値は、これらの成分によって説明される分散の比率です。 PC1は、プラズマ治療群が偽の群よりも若い群にはるかに近かったことを考えると、アンチエイジング効果を説明している可能性が最も高いです。 （C）経路濃縮分析。 測定されたm/z値を分子量情報と照合することにより代謝物を同定しました。 各円は、見つかった特定の経路を表しています。 与えられた経路について、円のxの位置またはサイズは、代謝物の相対的な間隔の中心性（経路の影響の尺度）に対応し、yの位置または色（赤の場合はp値が低く、青の場合はp値が高い）に対応します。どの代謝物が過剰に表されているか。 支配的な経路は、より高いx値とy値を持っています。 したがって、アラキドン酸（AA）代謝は、アンチエイジング効果臍帯血プラズマの。
マウス血液サンプルの代謝分析
最初に、マウス血漿で偏りのない小分子代謝物プロファイリングを実行しました。 3つのマウスグループすべてからの血液サンプルを液体クロマトグラフィーおよび質量分析（LC / MS）分析にかけました。 MAIT（代謝物自動識別ツールキット）によってm / zデータを処理し、ANOVA（m / zと保持時間の8572の固有の組み合わせ）を介して統計的に有意な特徴を識別しました（図2a）。 代謝物の階層的クラスタリング分析（HCA）により、2つの重要なパターンが明らかになりました。i）代謝物プロファイルは、老齢（未処理）マウスと若いマウスの間で明確に異なっていました。 ii）プラズマ処理された老齢マウスのプロファイルは若いマウスのプロファイルに近かった。
主成分分析（PCA）により、メタボロミクスデータの固有の構造が明らかになりました（図2b）。 全変動の約50％は、第1主成分（PC1）と第2主成分（PC2）によって説明できました。 3つのコホート（すなわち、若いグループ、プラズマ処理されたグループ、および偽のグループ）はすべて個別の位置に定住し、グループクラスを区別するための生物学的に関連する特徴が特定されたことを示しています。 興味深いことに、プラズマ処理された高齢者グループは、偽物から若いグループに向かって移動しました。 グループ分離を定量化するために、2つの主成分で階層的クラスタリングを計算しました。 樹状図では、若年群と血漿治療群は、非治療群（3162.5）よりも低い非類似度レベル（または高い類似度レベル1120.9）でクラスター化されていました（図S2）。 これらの結果は、選択された機能（図2aの変数または行）を使用して、加齢に関連する代謝物バイオマーカーを推測できることを示しています。老化防止。 パブリックドメインのデータベースを使用して、既知の代謝物で機能に注釈を付けました[9]。
さらに、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[10]マッピングを適用して、同定された代謝物の機能と相互接続性を評価しました。 与えられた経路について、i）候補代謝物の過剰発現、およびii）他の代謝物のペア間の重要な中間ノードとしてのその重要性（すなわち、中間中心性）[11]を測定しました（詳細はメソッドを参照）。 アラキドン酸（AA）代謝が最も過大評価されている経路（図2cで最も高いy値）であり、その経路の代謝物は通信経路（図2cでより高いx値）に位置する傾向があることがわかりました。情報の流れを管理します。 AA代謝における多くの代謝物の中から、AA自体をバイオマーカーとして選択しました。 経路への最初の入り口として、AAだけが他の摂動代謝物の代表となる可能性があります。
プラズマ中のAA検出用の競合磁気電気化学センサー（cMES）
次に、AA検出のための高速なオンサイトアッセイシステムの進歩に着手しました。 磁気電気化学センシング技術を使用することを選択しました[12–17]。 ターゲットの濃縮と検出を単一のプラットフォームに統合します。磁気ビーズ（MB）を使用して分子ターゲットをキャプチャおよびラベル付けし、ビーズに結合したターゲットを電気化学的センシングによって検出します。 このアプローチには多くの実用的な利点があります。i）ネイティブサンプル（血漿または血液）は、サンプル精製を必要とせずに直接使用できます。 ii）アッセイは、磁気濃縮と酵素シグナル増幅により高い検出感度を達成します。 iii）電気的検出方式に基づいて、センサーはポータブルデバイスとして簡単に小型化できます（図3a）。
ただし、磁気電気化学センシングを介してAAを検出することは、技術的な課題をもたらしました。 AAは小分子（〜304.5 Da）であるため、AA抗体のペアを使用したイムノアッセイを適用することは困難でした。 したがって、単一のAA抗体のみを必要とする競合アッセイ形式（cMES;競合磁気電気化学センサー）を検討しました（図3b）。 ターゲットキャプチャでは、MBをAA抗体（MBAb）でコーティングしました。 また、AAを酸化酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、HRP）と結合させることにより、競合剤（AA-HRP）を調製しました。 具体的には、ハプテン形式を使用しました。 AAはウシ血清アルブミン（BSA）に結合し、さらにHRPをBSA担体に結合しました（図S3）。 cMESアッセイでは、血液サンプルをMBAbおよびAA-HRPと混合しました。 AA-HRPの量は、MBAbのAA結合部位を飽和させるのに十分でした（メソッド）。 これにより、サンプル内の内因性AA量に応じて、MBへのHRP負荷が異なります。 発色性電子メディエーター（3,3'、5,5'-テトラメチルベンジジン、TMB）を順次追加すると、平面電極によって読み取られる電流が生成されました。 シグナルレベルを最大化するために、AAキャプチャーとTMBインキュベーションの反応時間を最適化しました（図S4）。
図3.AAアッセイ用の競合磁気電気化学センサー（cMES）。 （A）デバイスの概略図。 cMESデバイスはフットプリントが小さく、
オンサイト操作。 （B）AA検出のための競合電気化学アッセイを考案しました。 磁気ビーズ（MBAb）はAAに対する抗体と結合しました。
対照サンプルはAA-HRPのみを含み、磁気ビーズと混合されました。 試験サンプルは、磁気ビーズおよびAA-HRPと混合されました。 （C）電流
ポータブルcMESリーダーによって測定されます。 cMESアッセイでは、AA濃度の増加に伴って電流の大きさが減少します[AA]。 コントロールからの信号
サンプルは、[AA]=0 ng/mLのベースラインを設定しました。 コントロールとターゲット血漿サンプル間の電流差（ΔI）を分析メトリックとして使用しました。 （D）
既知量のAAを血清に添加し、cMESで測定しました。 検出限界は約126ng/mLでした。 （E）cMESとELISAを比較した
コンコーダンス。 両方のモダリティからの結果は、良好な一致を示しました（R 2=0。959）。 データは、3回の測定からの平均±SEMとして表示されます。
図4.血漿サンプルのAA測定。 （A）血漿注射後のマウスAAレベルの経時的分析。 13 {{1 0}}μLの血漿（AA濃度= 7 .2 µg / mL）をマウス（n=6）に注入し、3、7、および14後にマウスの血液を採取しました。日々。 次に、マウスの血液のAAレベルをモニターした。 AAレベルは3日目に有意に増加し、7日後に正常レベルに戻りました。 *p<0。05;><0。01;><0。001。 （b）マウス血漿サンプルをアッセイした。="" 対照群（n="5）では、若いマウス（5および8か月齢）は、偽処理された古いマウス（20および23か月齢;" n="8）よりもAAレベルが高かった。" 血漿治療群（n="5）では、AAの持続的な増加が観察されました。" *="" p=""><0.05; **="" p=""><0.01;><0.001。 （c）（b）と同じコホートからの血漿サンプルを質量分析によって分析した。="" aaレベルは、cmesで測定されたものと同様の傾向を示しました。="" *="" p=""><0.05; **="" p=""><0.01;><0.001。>
競合アッセイの結果、電流の大きさは血漿AA濃度（[AA]）が高くなるにつれて減少しました。 したがって、MBAbをAA-HRPのみとインキュベートすることにより、コントロールサンプルを調製しました。 コントロールサンプルを使用して、シグナル差を計算するための上限ベースライン（つまり、[AA]=0 ng / mL）を設定しました。 コントロールと血漿サンプルからの電流を測定し、正味の差| ∆I |=|Icontrol-Iplasma|得られた（図3c）。 そのような
差動測定は、一般的なバックグラウンド信号も補正しました。
さまざまな量のAAをスパイクしたサンプルを使用した滴定実験（図3d）では、検出限界（LOD）が約125.9 ng/mLであることが明らかになりました。 アッセイのLODは、若いマウスの血漿中の典型的なAA濃度（38 µg / ml）の約300-倍低かった（5か月、n=2）。 これらの結果に基づいて、緩衝液を添加して初期血漿サンプルを希釈しました（100-倍）（方法を参照）。 非特異的結合からのシグナルは、固有のバックグラウンドレベル（〜43 nA）に近く、高い希釈係数の恩恵を受ける可能性があります。 また、アッセイ結果が従来のELISAの結果と一致することも確認しました（R 2=0。961、図3e）。 ただし、cMESアッセイはELISA（4時間）よりも高速（1時間）でしたが、これは主に結合速度が速いためです。 cMESでは、MBはサンプルボリューム全体でAAをキャプチャします（3-次元拡散）が、AAキャプチャはプレートベースのELISAで1-次元拡散に依存します。
血漿処理マウスにおけるAAモニタリング
単一のプラズマ処理後のマウスのAAレベルを分析するためにcMESを適用しました。 AAはヒトの臍帯血に自然に存在するため、血漿注射はマウスのAAレベルを追加的に増加させます。 6つの異なるヒト臍帯血血漿からの平均AA濃度は、7.2±0 .5 µg / mL（平均±SEM）でした。 13 0 µLのヒト臍帯血血漿をマウス（n=6）に注入し、AAレベルをモニターしました（図4a）。 血漿注射はすぐに血中AAレベルを上昇させました（3日目;他のすべての時点と比較してp <0.01）が、効果は一時的でした。 aaレベルは治療後7日で正常に戻りました（血漿注射前の時点と比較して、p="">
次に、完全な治療スケジュールの後に血漿AAレベルを監視します（図S1）。 3つの異なるマウスコホートを使用しました：プラズマ処理（n=8）および偽（n=8）の高齢者グループ（20-23か月齢）、および若い対照グループ（<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">
老齢マウスの認知および行動の改善につながる血漿治療
さらに、動物コホートの行動表現型を評価し、特に運動学習と記憶機能を評価しました。 血漿または偽治療の1か月後および4か月後に{{0}}試験ロータロッド試験を実施しました（図5a）。 回転ロッド上で落下する前のマウスの潜時（実行時間）を使用して、動物の運動能力を評価した。 治療後1か月（20-月齢）では、偽治療群と血漿治療群の両方の潜時は、若年者（5-月齢）よりも有意に低かった（p <0.0001）。 ）グループ（図5b）。="" しかし、血漿治療群は運動学習と記憶の段階的な改善を示したが、偽の群では同じ能力が低下した。="">老化防止治療効果（図5c）。
脳組織分析（図5d、5e）は、老齢のマウス（偽のグループ）が若いマウスよりも脳室下帯のDCX陽性細胞の面積が小さいことを示しました。 逆に、DCX陽性細胞の面積は、血漿処理動物で増加し、変化しませんでした（p=0。04）。これは、注入された臍帯血血漿が古い脳の神経新生を刺激したことを示しています。 結果は、治療群の運動機能の改善をもたらした持続的な神経新生に対する血漿治療の潜在的な利益を示唆している。
討論
若返り療法の進歩は、同時に、治療効果を読み取るための客観的かつ定量的な測定の必要性を高めています。 したがって、私たちは、老化の表現型の特徴を最もよく説明できる分子バイオマーカーを特定するために研究を設計しました。老化防止処理。 私たちの動物実験は、以下の観察につながりました。i）若いマウスと成体のマウスコホートの代謝物プロファイルは明らかに異なります。 ii）老齢マウスにヒト臍帯血漿を注射すると、代謝物パターンが若いマウスの代謝物パターンに近く変化します。 興味深いことに、アラキドン酸（AA）が最も効果的な代理バイオマーカーであることがわかりました。老化防止処理; AA代謝は、若いマウスと血漿処理マウスの両方で非常に無秩序であり、リノール酸代謝などの他の代謝経路との相互作用において重要な役割を果たしていることがわかりました[10、18]。
さらに、日常の研究や臨床現場でのAA検出を容易にするために、高速でポータブルなセンサーシステム（cMES）を開発しました。 血漿サンプルから直接小分子標的（すなわち代謝物）を検出するために、競合アッセイスキームと免疫磁気濃縮を具体的に統合しました。 この組み合わせには、次の利点があります。 （i）磁気ビーズは、サンプルボリューム全体（3-次元拡散）でAAを捕捉するため、アッセイは高速結合速度論の恩恵を受けます。 （ii）ビーズ収集に使用される外部磁石により、アッセイプロセス（洗浄ステップなど）が簡素化されます。 （iii）検出電極の近くにAA結合ビーズを磁気的に集中させることにより、全体的な分析信号を改善することができます（〜72パーセント）[12]。 確かに、cMESアッセイが使用することを示しました<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">
図5.行動および分子アッセイ。 （A）2-トライアルロータロッドテストは、プラズマ注射の1か月後と4か月後に実施されました。 （B）プラズマ処理群
運動協調性の漸進的な改善を示した。 最終的には若いグループのパフォーマンスに近かった（3か月での2回目の試行）。 偽のグループの実行時間は、加齢とともに減少しました。 *p<0。05;><0。01。 （c）血漿治療群では、aaレベルの上昇が運動機能の改善に先行した。=""><0。05; **="" p=""><0.01;><0.001。>
スケールバーは50µmです。 偽のグループは、若いマウスよりも脳室下帯のDCX陽性細胞の面積が有意に小さかったのに対し、血漿処理動物では面積が増加し、変化しなかったことに注意してください。 （E）画像（D）のDCX陽性細胞の面積を測定した。 *p<0。05;><>
AAは筋肉の成長と脳の発達を促進することが示されています[19、20]。 他のレポートもAAの潜在的な利点を強調しています老化防止[21、22]。 現在の研究はこれらの発見と一致していますが、その範囲はAAレベルと老化防止表現型。 しかしながら、連続AAモニタリングは、血漿処理マウスにおけるAAの増加は、輸血された血漿からではなく、内因性の供給源からである可能性が高いことを示した。 さらに、持続老化防止血漿治療終了後4ヶ月でもレシピエントマウスに効果が認められた。 運動学習と記憶機能が改善されました。 脳内の神経前駆細胞の数が増加しました。 これらの観察結果は、血漿処理マウスの生理学的変化を強く示唆しています。 正確なメカニズムはまだ解明されていません。
この研究の他のいくつかの制限は、将来の研究で対処されるべきです。 まず、cMESアッセイは、より高い精度を得るために改良する必要があります。 特に、真の陰性サンプル（すなわち、内因性AAのない血液サンプル）がないため、非特異的結合からのシグナルを説明することは困難でした。 おそらく、サンプルを100-倍に希釈したため、血液マトリックスの影響は無視できる可能性があります。 ただし、このような仮定は、AA欠損マウスモデル[23]から、またはAAの免疫枯渇によって調製できるAA欠失血漿サンプルを使用して検証する必要があります。 次に、簡単にするためにAA代謝における単一の代謝物の検出に焦点を当てましたが、このアプローチでは、特定の経路における代謝物間の相互作用などの生物学的コンテキストを無視する場合があります。 代謝物のパネルを含めると、代謝の摂動をより適切に捉え、診断の精度も向上します。 cMESは、少量のサンプルを消費しながら、さまざまなマーカーを検出するために簡単にスケーリングできます。 第三に、現在の調査結果を人間に内挿することは難しいでしょう。 マウスと人間は同様の代謝経路を共有していますが、マウスは人間よりも7-倍高い代謝率を持っています[24]。 注入に最適な血漿投与量を決定し、バイオマーカーのベースラインを設定するには、ヒトでの試験が必要です。 動物研究から情報を得て、私たちはそのような人間研究を計画しています。 これらの努力はの開発を加速します老化防止治療、個人の生活の質の向上、社会的負担の軽減。
メソッド
実験計画
血漿は、分娩時に採取されたヒト臍帯血から分離されました。 臍帯血血漿は、老齢マウス（18-月齢）、および偽対照（18-月齢）および若いマウス（3-月齢が陽性）に静脈内注入によって投与されました。対照）に生理食塩水を注射した。 移植後1ヶ月と4ヶ月で、運動協調性と長期記憶を評価するために2-試行ロータロッド試験が実施されました（図S1）。 非標的代謝物プロファイリングは、3つのグループからの血液に対して実行され、生物情報分析により、老化防止関連する経路（アラキドン酸代謝）。 バイオセンサーは、血液を循環するアラキドン酸を簡単かつ効率的に検出するために開発されました。
臍帯血サンプルの準備
ヒト臍帯血は、CHA総合病院の倫理委員会（ソウル、韓国、IRB番号CHAMC -2015- 08-130-009）の下で収集されました。 ヒト臍帯血は4人のドナーから提供され、アデニン（CPDA -1）抗凝固剤を含むクエン酸-リン酸-デキストロースで処理されました。 ヒト臍帯血血漿は、2、000 g、室温で15分間の遠心分離によって分離されました。 分離された血漿サンプルは-80度で保存され、室温で1回の凍結融解サイクルで使用されました。
動物実験
動物のプロトコルは、CHA大学の動物実験委員会（IACUC）によって承認されました。 18-月齢の雌C57BL/6マウスを使用して、加齢と相関する代謝摂動と行動表現型を評価しました。老化防止。 陽性対照は3-月齢の雌C57BL/6マウスでした。 すべてのマウスは、標準的な12時間の明暗サイクルで室温で飼育されました。 成体マウスの場合、臍帯血血漿または生理食塩水（130 µL）を4週間12回静脈内注射しました。 単離されたヒト臍帯血血漿はプールされず、所与の動物は同じドナーから臍帯血血漿を受け取った。 各実験で使用された動物の数は、対応する方法のセクションに記載されています。 遠心分離（3、000 g、室温で15分）により血漿を収集した。
代謝物の取得とデータ分析
血液由来の代謝物のプロファイリングのために、指定された時点で心臓穿刺によってマウスから血液を収集しました：若いグループ（3-月齢、n=10）、偽のグループ（{{ 4}}月齢、n=10; 23-月齢、n=12）、血漿治療群（20-月齢、n {{13 }}; 23-月齢、n=5）。 血液サンプルは、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）システム（Agilent）を使用して分析しました。 LC / MSファイルを標準のmzXML形式（ProteoWizard）[25]に変換し、MAIT（代謝物自動識別ツールキット）[26]を使用して処理し、特徴検出、統計分析、および代謝物識別を行いました。 統計的に有意な特徴（すなわち、イオン化および/または断片化された代謝物）は、分散分析（ANOVA）によって特定されました。 これらの機能は、質量スペクトルイオンの質量/電荷比（0のm /z許容値005）に基づいて、メタボロームデータベース[9]で考えられるすべての推定代謝物と一致しました。 階層的クラスタリング分析によるグローバル代謝物の変化と、主成分分析（PCA）によるメタボロミクスデータの固有の構造を特徴づけました。 PCAや階層的クラスタリングなどの教師なし学習には、マウスごとに2つまたは3つの技術的複製（技術的変動が生物学的変動よりもはるかに小さいことを保証）が含まれていました。 主成分（HCPC）の階層的クラスタリングは、RパッケージであるFactoMineRによって実行されました[27]。 機能分析では、老化と血漿治療によって混乱する可能性が最も高い代謝経路が、KEGG経路分析（MetaboAnalyst 3.0）によって決定されました[28]。 超幾何分布を使用して、特定のKEGGパスウェイで一致した代謝物の過剰発現を測定しました。
免疫磁気ビーズの調製
エポキシ基（Dynabeads M -270エポキシ、Invitrogen）でコーティングされた磁気ビーズ（5 mg）を、1 0 0 µLの0.1Mリン酸ナトリウム溶液に懸濁しました。 アラキドン酸（Biomatik）に対する抗体100マイクログラムを加え、完全に混合しました。 １００マイクロリットルの３Ｍ硫酸アンモニウム溶液を加え、混合物を室温で２時間インキュベートし、次にゆっくりと傾けて回転させながら４度で一晩さらにインキュベートした。 コンジュゲーション反応はpH= 7。4で実施しました。 これらのプロセスは、エポキシ（ビーズ）基とアミン（抗体）基の間の共有結合の形成を誘発します。これは、抗体-ビーズコンジュゲートをpHチャレンジにかけることによって以前に確認されました[29]。 平均して、ビーズあたり2.4×104の抗体が固定化されました。 抗体結合磁気ビーズを永久磁石で分離し、PBS溶液で2回洗浄し、1％BSAを含む200 µLのPBSに再懸濁しました。 ビーズは4度で1ヶ月まで保管されました。
アラキドン酸へのHRPコンジュゲーション
次に、HRPは還元的アミノ化化学を介してBSAに結合されました。 具体的には、1 0 0 µgのBSA結合AA（RPU51089、Biomatik）を0.5mLの0.2M炭酸塩-バイオカーボネートバッファー（pH 9.4）に溶解し、1ミリグラムの凍結乾燥EZ-linkに添加しました。 Plus Activated Peroxidase（Thermo Scientific）、および室温で1時間インキュベートしました。 次に、10 µLのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Thermo Scientific）を添加し、混合物を室温で15分間インキュベートしました。 最後に、20 µLのクエンチングバッファー（Thermo Scientific）を添加し、室温で15分間インキュベートしました。 ゲル電気泳動およびタンパク質バンド分析により、BSA-AAへのHPRコンジュゲーションが確認されました（図S3a）。 HRP結合AAを収集し、Amicon Ultra 100K遠心フィルター（Millipore）で濃縮しました。 残りのペルオキシダーゼとBSA-AAをPBSで4回洗い流した。
血漿サンプル中のAAの電気化学的検出
AAの電気化学的検出のために、若いグループ（n {{0}}）、偽のグループ（n=8）、および血漿処理グループ（n=5）から1か月間血液を採取しました。およびn= 5で3か月）。 マウス血漿サンプル（0。5 µL）をPBS中の1％BSA 50 µLで希釈し（×100-倍希釈）、免疫磁気ビーズ溶液（50 µL）およびHRP結合AA溶液と混合しました。 （50 µL）。 AA-HRPの量は、磁気ビーズの結合部位を飽和させるのに十分な量でした。 テストごとに約8.4×107のビーズを使用し、2.0×1012のAA結合部位を利用できるようにしました。 AA-HRPの量は約1.7×1013でした。 AA-HRPと結合部位の比率は約8：1でした。 混合物を、ゆっくりと傾けて回転させながら、室温で１時間インキュベートした。 コントロールビーズは、PBS（50 µL）中の1％BSAを免疫磁気ビーズ溶液（50 µL）およびHRP結合AA溶液（50 µL）と混合することによって調製しました。 反応したすべてのビーズを永久磁石で分離し、80 µLのPBS（1パーセントBSA）で2回洗浄しました。 最後に、ビーズを7 µLのPBSに再懸濁しました。 調製したビーズ溶液と20µLのTMB溶液（Biomatik）を電極の上にロードしました。 6分後、クロノアンペロメトリー測定を開始しました。 小型化された電気化学センサー（AcurreHealth Inc.によって開発されたプロトタイプシステム）を使用しました。 40-45の範囲の現在のレベルが平均化されました。 換算係数（×100）を使用して、血漿中の推定元のAA濃度を報告しました。
酵素免疫測定法（ELISA）
ELISA実験は、製造ガイドラインに従って、マウスアラキドン酸（AA）ELISAキット（Biomatik）を使用して実施した。 連続希釈したAAを各ウェルに加え、HRP標識AAと37度で40分間インキュベートしました。 洗浄バッファーで4回洗浄した後、TMB溶液を加えて20分間インキュベートしました。 停止液を加えることにより発色を停止させた。 マイクロプレートリーダー（Tecan）を使用して450nmで吸光度を読み取った。
ロータロッドテスト
KongらのRotarodテストを変更しました。 [30]運動協調を評価する。 直径3-cmのロッドを備えたロータロッドは、4 rpmで開始し、30秒ごとに4rpmで5分間加速しました。 マウスをロッド上に置き、マウスがロッドから落ちるのにかかる時間を測定した。 各マウスに1日3回の試行を行い、各日の実行時間をトレーニング時間の平均として計算しました。 最初のロータロッドテストは、プラズマ治療後1-か月に実施されました：若いグループ（n=29）、偽のグループ（n=17）、プラズマ治療されたグループ（n {{ 11}}）。 再トレーニングセッションは、プラズマ治療の4-か月後に開始されました。 オーバートレーニングを避けるために、再トレーニングは2日間行われました。 他の手順は最初のセッションと同じでした。
脳組織イメージング
ヒト臍帯血血漿の注射または生理食塩水注射の1か月後（n=4）および4か月後（n=3）に、動物を安楽死させ、4％パラホルムアルデヒド（PFA）およびPBSを介して灌流しました。左心室。 若いグループ（n=5）と偽のグループ（n=4）をコントロールとして使用しました。 彼らの脳は
抽出され、凍結保護されています。 各脳を30μmの厚さのクリオトームで切断した。 に
免疫組織化学を行い、非特異的結合を0 .3％Triton X -100中の5％正常ヤギ血清で40分間ブロックしました。 Doublecortinに対する一次抗体（DCX; 1：400、Cell Signaling、＃4604S）を4度で一晩適用した後、PBSを使用して洗浄しました[31]。 DCXの検出には、二次抗体Alexa Fluor 488（1：2000、Invitrogen、＃A11008）を使用しました。 蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse 80i）を使用して画像を撮影し、ImageJを使用して分析しました[32]。
統計分析
統計分析は、R基本関数といずれかの線形のRパッケージであるlme4を使用して実行されました。
混合効果モデルまたは一般化線形モデル
（GLM）に続いてLSD事後テスト[33]。 データは平均±標準誤差として表され、<>
補足資料
補足図。
http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf
謝辞
小型化された電気化学センサーを提供してくれたAccureHealthInc.に感謝します。 この研究は、韓国政府（MSIT）（2017M3A9B4025699）によって資金提供された情報通信技術促進研究所（IITP）の助成金によって部分的にサポートされました。
競合する利益
著者は、競合する利益は存在しないと宣言しました。
