セボフルランの短期間の吸入は、新生児ラットの低酸素虚血性脳損傷後のグリア瘢痕形成を軽減できる パート 2
May 13, 2024
リアルタイム PCR
手術後 12、24、および 48 時間後に、TRIzol 試薬 (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド) を使用して、子犬の海馬組織から全 RNA を抽出しました。 相補的DNAは、高度なSuperscript II RT-PCRキット(Invitrogen)を使用して合成した。
低酸素性虚血性損傷とは、心血管系および脳血管系の障害による脳虚血、低酸素、代謝障害、および神経細胞損傷によって引き起こされる病理学的状態を指します。 社会の進歩とライフスタイルの変化に伴い、低酸素虚血性損傷はますます一般的になってきています。 この状態は、知能や記憶力への影響など、人間の健康に多くの害を及ぼす可能性があります。
低酸素と虚血は脳機能の低下を引き起こす可能性がありますが、記憶力が悪影響を受けるわけではありません。 それどころか、正しい方法で記憶力を高め、脳の効率を高めることができます。 記憶力を向上させるには次のような方法があります。
1. 健康的な食事: 食事が記憶に与える影響は非常に重要です。 タンパク質、ビタミン、ミネラルが豊富な食品は、健康な神経系と思考機能の維持に役立ちます。
2. もっと運動する：運動すると、血液循環が促進され、酸素の流れが増加し、体の免疫力が高まり、病気のリスクが軽減されます。 運動を通じて、記憶力を向上させることができます。
3. 自信を強化する: 自信は人の記憶にとって重要な要素です。 特定のタスクを完了できると信じていれば、望む結果を簡単に達成でき、効果的に記憶力を向上させることもできます。
低酸素性虚血性傷害は、人間の記憶を必然的に傷つける症状ではないことがわかります。 正しい方法を習得し、脳を大切にしていれば、前向きな姿勢で健康な未来を受け入れることができます。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサには抗酸化作用、抗炎症作用、および老化防止効果があり、脳内の酸化と炎症反応を軽減し、それによって脳を保護する効果があるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。神経系の健康。 さらに、カンクサは神経細胞の成長と修復を促進し、神経ネットワークの接続と機能を強化します。 これらの効果は、記憶、学習、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発症も防ぐ可能性があります。
蛍光SYBR Green I色素（SYBR Green PCRMaster Mix、Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）および1μLの逆転写相補DNAを使用して、HIF-1 -特異的プライマーを用いたリアルタイムPCRによるDNA合成を検出しました。
ローター遺伝子リアルタイム DNA 増幅システム (Corbett Research、シドニー、オーストラリア) では、以下のサイクルで PCR を実行しました: 95 度で 15 分間の変性、95 度 (20 秒) の 40 サイクル、58 度で 25 秒のアニーリング、72度で35秒間プルダウンします。 蛍光生成物のモニタリングは 72 度で長時間実行されました。
ローター遺伝子分析ソフトウェア(Corbett Research)を使用して、ハウスキーピング遺伝子GAPDHを標準化し、相対的な遺伝子発現を定量化した。 すべてのプライマー配列を表 1 に示します。
ニッスル染色
免疫組織化学について上述したように、手術後２８日目にラットの脳をスライスに調製した。 各脳を連続的に切片化し、ニッスル染色のために脳の同様の切片を３つ選択した。
Nikon C1 デジタル顕微鏡カメラ (株式会社ニコン、東京、日本) を利用して、海馬 CA1、CA3、および DG 領域の典型的な顕微鏡写真を撮影しました。 3 つのセクションのそれぞれでいくつかの細胞の計数は、ImageJ ソフトウェアを使用して盲検法で実行されました。
行動テスト
ラットは3週間で離乳し、3〜5つのグループに分け、グループの割り当てに従ってケージに入れました。以前に記載されているように、P28〜P33（つまり、手術後21〜26日）のラットで行動試験を実施しました（Wang et al.、2019a） ）ただし、わずかな変更が加えられています。 げっ歯類の行動に対する発情周期の影響を排除するために、雄ラットのみを試験した。
モリス水迷路
モリス水迷路試験は、P28-P33 ラットの空間学習および記憶能力を評価するために使用されました (Wang et al.,2019a)。
テストは、トレーニングセクションと空間検索テストを含む 2 つのフェーズで構成されていました。 5 日間連続して、毎日午前 8 時に開始される 4 つのトレーニング セクションが実施されました。00 プラットフォーム検出テストでは、各グループから 10 匹のラットを、確率的にプールの壁に面したさまざまな場所で個別に水中に入れました。
ラットが９０秒以内にプラットフォームを検出できた場合、ラットは２０秒間プラットフォーム上に留まることを強制され、プラットフォームを検出するのに要した時間を脱出潜伏時間として記録した。 試験の各ラウンドは９０秒であり、逃走潜時は、ラットを水中に入れてからプラットフォームにうまく乗り込むまでの時間として測定された。
ラットが90秒以内にプラットフォームを見つけることができなかった場合、記録は停止され、学習および記憶誘導が行われた(実験者は長い棒を使用してラットをプラットフォームに誘導し、学習のためにラットをプラットフォーム上に20秒間留まらせた)。 テスト中、ステージに入ることができなかったラットの逃走潜時は 90 秒と記録されました。
試験の６日目に実施された空間プローブ試験では、プラットフォームが取り外され、ラットが反対側の象限に配置され、９０秒間泳がせられた。 泳ぐ速度、逃げるまでの時間、以前にプラットホームがあった場所を横切った回数が、ビデオ追跡システム (Shanghai MobileDatum Ltd.、上海、中国) によって記録されました。
サスペンションテスト
懸濁試験は、P28 ～ P32 ラットの運動機能を評価するために、毎日午後 3 時に開始して実施されました。 直径0.5 cmの水平なプラスチックロープを地面から45 cmの距離に置き、ラットを誘導して両上肢でプラスチックロープをつかみ、その時点でラットが落ちるまでの時間を測定しました。試験は以下の場合に終了した。(i) ラットが転倒した。 (ii) 一時停止の待ち時間が 60 秒を超えていた。 または (iii) ロープが後肢に引っかかった。
オープンフィールドテスト
オープンフィールド試験は、高さ45-cmの壁で囲まれ、床が16の正方形に分割されたプレキシガラス製の箱(100cm×100cm、ボルジュ・サナート、イラン、イラン)で構成される屋外装置を使用して、P28ラットに対して実施された。 中央エリアはアリーナ中央の50cm×50cmのエリアでした。 各ラットを個別にアリーナの中央に置き、10分間制限なく探索させた。
ビデオ追跡システム（Borj Sanat）を利用して、総旅程（運動活動の指標として）と中心エリアで過ごした時間（不安行動の指標として）を記録および分析しました（Zhai et al., 2019）。
ゴルジ染色
行動試験の完了後(すなわち、手術後26日)、各群から5匹のラットを無作為に選択した。 ゴルジ染色は、FD Rapid Golgi Stain Kit (FDNeuroTechnologies、コロンビア、メリーランド州、米国) を製造者のプロトコールに従って使用し、150- μm 厚の凍結脳切片で実行されました。
ImageJソフトウェアを利用して、各ニューロンのスパイン密度(10μmあたりのスパイン数)を分析した。 スパインは、2 つまたは 3 つの二次樹状突起セグメントで数えられました。
統計分析
Windows 用 SPSS 17.0 (SPSS Inc.、米国イリノイ州シカゴ) を使用してデータを分析しました。データは、平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として示されています。 Shapiro-Wilk 検定は、すべての連続変数間の正規性の仮定を検定するために使用されました。さらに、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定が一連の実験で行われました。
データが正規性の仮定を満たさない場合は、Kruskal-Wallis H 検定または Mann-Whitney Utest を個別に実行しました。 脱出潜時は、反復測定の二元配置分散分析に基づいて分析されました。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。
結果
SPC は海馬の神経細胞喪失を改善します
調査された 3 つの領域を含む海馬は、学習と記憶に関連しています (Jung et al., 2020)。 行動試験の後、海馬の構造を調べるためにニッスル染色が行われました。
HI グループでは、偽グループと比較して生存ニューロン密度が減少しました。しかし、SPC に曝露された動物ではニューロンの数が増加しました。 この効果は YC-1 によって逆転し、ニューロン密度が減少しました (図 1A)。 この現象は、海馬の CA1、CA3、DG 領域で観察されました (P< 0.05; Figure 1B–D).
SPC は海馬 CA1 領域の樹状突起スパイン密度を改善および減少させます
ゴルジ染色を使用して、CA1 錐体神経樹状突起スパイン密度を検出しました (図 2A)。 スパインのサイズは大きく異なるため（例、分岐した樹状突起、細い、またはキノコ状）、樹状突起スパインの密度が HI グループと比較して HIS グループで有意に増加していることのみを確認しました（P < 0。{{6 }}5)、樹状突起スパインの密度は、HIS グループと比較して HIS + YC-1 グループで減少しました (P < 0.01; 図 2B)。
SPCは海馬におけるPSD95およびGAP43の発現を改善する
我々は、シナプス関連タンパク質GAP43およびPSD95の発現を評価し、それらがグリア瘢痕によって阻害されるかどうかを判定した。 HI は、シャムグループと比較して PSD95 (P < 0.01) および GAP43 (P < 0.05) タンパク質発現を有意に減少させました (図 2C–E)。 HIS グループと比較して、PSD95 と GAP43 の発現レベルは YC-1 注射後に顕著に減少しました。
星状神経膠症およびグリア瘢痕の形成は、HI 後の海馬構造に損傷を与えます
次に、セボフルランが海馬構造を保護し、星状神経膠症を軽減することによって学習および記憶機能を改善するかどうかを検証しようとしました。 新生児の HIE は、海馬におけるニューロンのアポトーシスと、その後グリア瘢痕に発展する梗塞領域における反応性星状グリオーシスを誘発しました (Rolls et al., 2009)。
HI グループでは、CA1 および CA3 錐体層、および DG 領域でニューロンの明らかな減少が示されました (P < 0.01、P < 0.001、図 3E および 4C)。我々は、免疫組織化学およびウェスタンブロット分析を使用して、左海馬の 3 つの領域における GFAP および NeuN の発現を評価しました。
我々の結果は、偽グループと比較して、アストロサイトがHIグループで活性化され、CA1（図4A）およびCA3（図3A）錐体層に挿入され、DG（図3B）のニューロンを取り囲んでいることを示しました。 過剰な星状膠症は、グリア突起の正常な神経構造へのさらなる伸長をもたらし、異常な壁状の星状膠細胞ネットを形成した(図3A、B、および4A)。
さらに、GFAP 免疫反応性 (図 3C、D および図 4B、E) およびタンパク質レベルは増加しました (P < 0.01; 図 4E)、一方、NeuN 免疫反応性は減少しました (P < {{7}グリア瘢痕形成をさらに検証するために、海馬における神経カンタンパク質の発現レベルと免疫反応性を評価しました（図 5A、B、および 6A）。
二重標識免疫蛍光の結果は、HI 群と偽群の間の Neurocan+/GFAP+ 免疫染色の蛍光強度の顕著な違いを明らかにしました (P < 0.001、P < 0.05、P < 0.01;図 5G、H、および 6D)、ウェスタンブロットの結果と一致しています (P< 0.01; Figure 6F).
SPC は海馬における星状神経膠症とグリア瘢痕形成を軽減します
次に、我々の研究では、SPC がグリア瘢痕形成を軽減するかどうかを調査しました。 HI グループと比較して、HIS グループの GFAP (図 5C、D、および 6C) およびニューロカン (図 5E、F、および 6B) の免疫反応性は、海馬で顕著に下方制御されました (P < 0。{{6}) }1 または P < 0.001)。
対照的に、HIS + YC-1 グループにおける GFAP およびニューロカン発現は、HIS グループと比較して顕著に増加し、HIS + YC-1 および HI グループと差異はありませんでした (P > 0.05;図6EおよびF)。
さらに、HIS グループでは HI グループと比較して NeuN 免疫陽性が上方制御され、構造がより秩序正しく見えましたが、これは YC-1 によって逆転しました (図 3E、F、および 4C)。
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