セボフルランの短期間の吸入は、新生児ラットの低酸素虚血性脳損傷後のグリア瘢痕形成を軽減できる パート 1
May 13, 2024
抽象的な
以前の研究では、セボフルランのポストコンディショニングが低酸素性虚血性損傷後の神経保護を提供し、げっ歯類の脳の発達における学習および記憶機能を改善できることが実証されています。
低酸素性虚血性損傷とは、心血管系および脳血管系の障害による脳虚血、低酸素、代謝障害、および神経細胞損傷によって引き起こされる病理学的状態を指します。 社会の進歩とライフスタイルの変化に伴い、低酸素虚血性損傷はますます一般的になってきています。 この状態は、知能や記憶力への影響など、人間の健康に多くの害を及ぼす可能性があります。
低酸素と虚血は脳機能の低下を引き起こす可能性がありますが、記憶力が悪影響を受けるわけではありません。 それどころか、正しい方法で記憶力を高め、脳の効率を高めることができます。 記憶力を向上させるには次のような方法があります。
1. 健康的な食事: 食事が記憶に与える影響は非常に重要です。 タンパク質、ビタミン、ミネラルが豊富な食品は、健康な神経系と思考機能の維持に役立ちます。
2. もっと運動する：運動すると、血液循環が促進され、酸素の流れが増加し、体の免疫力が高まり、病気のリスクが軽減されます。 運動を通じて、記憶力を向上させることができます。
3. 自信を強化する: 自信は人の記憶にとって重要な要素です。 特定のタスクを完了できると信じていれば、望む結果を簡単に達成でき、効果的に記憶力を向上させることもできます。
低酸素性虚血性傷害は、人間の記憶を必然的に傷つける症状ではないことがわかります。 正しい方法を習得し、脳を大切にしていれば、前向きな姿勢で健康な未来を受け入れることができます。 私たちは記憶力を向上させる必要があることが分かります。カンクサは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であり、そのうちの 1 つは記憶力の向上であるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。 カンクサの効能は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体などを含む複数の有効成分に由来しています。これらの成分は、さまざまな経路を通じて脳の健康を促進します。
古典的なRice-Vannucciモデルを使用して低酸素虚血傷害を誘発し、新生ラット(生後7日)を低酸素虚血傷害後30分間2.4%セボフルランで処理した。
私たちの結果は、セボフルランのポストコンディショニングがラットの学習および記憶機能を大幅に改善し、星状神経膠症とグリア瘢痕形成を減少させ、樹状突起棘の数を増加させ、海馬の組織形態を保護することを示しました。 機構的には、セボフルランポストコンディショニングは、低酸素誘導因子-1のフォン・ヒッペル・リンダウの発現を減少させ、DJ-1の発現を増加させました。
低酸素性虚血損傷の30分前に、低酸素誘導性因子-1阻害剤YC-1（リフィシグアト）1.52μgを左脳室に注射すると、セボフルランによって誘導された神経保護が逆転した。 この発見は、セボフルランが海馬の星状神経膠症を効果的に軽減し、低酸素虚血性損傷後のグリア瘢痕形成によって引き起こされる学習および記憶障害を軽減できることを示唆しています。
根底にあるメカニズムは、DJ-1 発現の上方制御、低酸素誘導性因子 -1 のユビキチン化の減少、および低酸素誘導性因子 -1 発現の安定化に関連している可能性があります。 この研究は、2016 年 11 月 9 日に中国医科大学実験動物管理委員会によって承認されました (承認番号 2016PS337K)。
キーワード: 脳損傷。 脳; 中枢神経系; 生体内; けが; モデル; 可塑性; ねずみ; 回復; 再生; 修理中国語図書館分類番号 R453; R741; R614.2+1。
導入
新生児低酸素性虚血性脳症（HIE）は、新生児仮死、子宮内窮迫、硝子膜疾患などの多くの要因によって引き起こされる新生児期の一般的な合併症です（Douglas-Escobar and Weiss、2015;Barkhuizen et al.、2017）。
HIE は乳児死亡の主な原因であり、神経学的後遺症の主な原因である(Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015)。 HIE 生存者の 90 パーセントは、学習、認知、運動機能障害、てんかんなどの長期の神経機能障害を抱えています (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019)。 ＨＩＥの現在の治療は、機械的換気、低血圧の矯正、ブドウ糖の補給、および必要に応じた水分摂取の制限を含む対症療法に主に焦点を当てている。
しかし、長期的な脳損傷を回復または軽減できる効果的な治療が必要です(Stankowski and Gupta, 2011; Davidson et al., 2015)。学習と認識の極めて重要な部分として、歯状回 (DG) を含む海馬が挙げられます。 、CA1、およびCA3領域は、末梢情報の変換および神経中枢への統合に関与している（Morris et al., 2012; Jung et al., 2020）。
海馬は、低酸素虚血性（HI）損傷に対して過敏であり、海馬ニューロンのアポトーシスを引き起こし、過剰な反応性グリオーシスを刺激し、グリア瘢痕形成を引き起こす可能性があります（Hopkins and Haaland、2004; Wang et al.、2012）。 星状細胞の増殖は、梗塞部位の封鎖、海馬構造の再構築、および急性期の局所免疫応答の一時的制御にとって極めて重要である(Rolls et al., 2009)。
しかし、肥大およびグリア瘢痕形成は、異常な神経新生に寄与し、樹状突起スパインの成長を妨げ、シナプスの形状を妨げ、学習および認識機能をさらに損なう(Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda and Sofroniew, 2014; Pekny et al. 、2014;Shi et al。、2017）。
グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）およびニューロカンなどのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、星状神経膠症およびグリア瘢痕化の病理学的マーカーであり、その発現は高度に活性化された星状細胞によって上方制御され得る（Pekny and Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016）。 したがって、星状神経膠症およびグリア瘢痕化の抑制は、HIE およびその長期神経学的後遺症の治療標的となる可能性がある。
セボフルランの適用は、げっ歯類の HI 損傷を軽減することが実証されています。 成体げっ歯類および新生ラットにおける低酸素誘導因子-1（HIF-1）を上方制御することによりHI損傷を軽減するセボフルランポストコンディショニング（SPC）の重要性を調査した研究により、いくつかの潜在的なメカニズムが特定されました（Wang et al.、2019b; Yanget al.、2019;Du et al.、2020;Liu および Gong、2020)。
低酸素症の重要な生理学的センサーとして、HIF-1 は転写因子であり、血管内皮増殖因子やエリスロポエチンなど、虚血耐性機構に関与する数百の下流分子を伴います (Na et al., 2015)。 低酸素ポストコンディショニングは、新生児ラットの脳における HI 後の星状膠細胞およびミクログリアの活性化を減少させることが検証されています (Teo et al., 2015)。
したがって、我々は、HIF-1 がグリア瘢痕と星状神経膠症の形成の軽減に寄与している可能性があると仮説を立てました。HIF-1 はニューロン内に構成的に存在することができ、それにより急速に発現が増加し、低酸素条件下で蓄積します。 しかし、酸素が正常に戻ると、プロリルヒドロキシラーゼタンパク質による酸素依存性の分解とその後のフォンヒッペルリンダウ（VHL）タンパク質によるユビキチン化のため、HIF1発現は神経保護効果を継続的に発揮するのに十分な高レベルで維持できなくなります（Berra et al.、 2003;Zhang et al.、2018)。
DJ-1 (Park7 によってコードされる) は、特に酸化条件下で神経保護タンパク質であると報告されています (Aleyasin et al., 2007, 2010)。不偏質量分析スクリーンとパーキンソン病 (PD) モデルで確認されました。 さらに、Parsanejad et al.(2014)は、DJ-1がVHL依存性のユビキチン化を阻害し、HIF-1の発現を安定化することを示しました。
したがって、我々は、セボフルランがDJ-1を上方制御してHIF-1のユビキチン化を阻害することにより海馬内のHIF-1タンパク質を安定化し、それによって長期的な学習および記憶機能を改善すると仮説を立てました。
セボフルランとアストログリオーシスの関係におけるHIF-1の役割を調査するために、HIF-1の選択的アンタゴニストであるYC-1（リフィシグアト）を使用して、HIF-1の発現を完全に阻害しました。転写後のレベル。 この研究では、SPC 治療を受けた HIE 新生仔ラットの神経保護における HIF-1a の役割を調査しました。
材料と方法
動物
動物研究は、妊娠後期から生後 3 年までの人間の乳児の成長期間に相当する、生後 7 日目 (P7) に始まるラット発達のシナプス段階で行われました (Jevtovic-Todorovic et al., 2003)。 体重 12 ～ 16 g の生後 7 日の Sprague-Dawley ラットを、20 匹の妊娠ラット (中国、中国医科大学盛京病院の研究室から購入、雄/雌比 1:1) から選択しました。
すべてのラットは水と餌に自由にアクセスでき、研究室内の標準的な湿度と温度に維持され、12- 時間の明暗（午前 8 時/午後 8 時）のサイクルで維持されました。 すべての動物実験は、米国国立衛生研究所（米国メリーランド州ベセスダ）の実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って行われました。
中国医科大学の実験動物管理委員会は、2016 年 11 月 9 日に記載された実験 (中国、瀋陽、承認番号 2016PS337K) を正式に承認しました。
25 匹の妊娠したラットから 249 匹の P7 ラットが選ばれ、乱数表に基づいてランダムにグループに分けられました (Wang et al., 2019a)。 私たちの最終分析には、合計 201 匹の新生児ラットが含まれていました。 HI 治療後の死亡率は 19% でした。
これら 201 匹の新生児ラットをランダムに 4 つのグループに分けました: sham(n=54)、HI (n=54)、HI + セボフルラン (HIS) (n=54)、および HIS+ YC{{ 6}} (n=39) グループ。 各グループで、24 匹のラットをウェスタンブロットアッセイに使用し、5 匹を免疫組織化学およびゴルジ染色に使用し、10 匹のラットを行動試験に使用しました。偽グループ、HI グループ、および HIS グループの残りの 45 匹のラットは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT- PCR）。
実験計画と麻酔への曝露
使用された HIE モデルは以前に説明されています (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017)。 肛門と生殖器官の間の距離に基づいて、出生後のラットの性別識別が完了しました。 HIE モデルを確立するために、各 P7 ラットの頭部を透明なプラスチックのパイプに入れ、セボフルランが放出される前に綿で密封しました (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019)。
各ラットの左総頚動脈を永久的に結紮し、2つの結紮の間で動脈を切断した。 各手術は5分以内に終了しました。 その後、ラットは麻酔の影響を受けずに目覚め、2時間母親のケージに戻されました。SPCの投与のために、ラットはアセボフルラン気化器に接続された透明なチャンバー（Lingzhi Company、杭州、中国）に入れられました。 1 つのダクトは換気を補助し、もう 1 つのダクトはガスサンプルをチャンバーからモニターに運びました。
偽グループには 30% O2 と 70% N2 で 2 時間チャンバーを換気しましたが、HI グループには 8% O2 と 92% N2 を 2 時間投与しました。 ＨＩ後直ちにＳＰＣを設定した：２．４％セボフルラン（最小肺胞濃度の１）を、３０％Ｏ ２ および７０％Ｎ ２ の雰囲気および２Ｌ／分の空気流量のチャンバー内でラットに３０分間吸入させた。 加熱プールにより、チャンバー内の温度は 37 度に安定しました。
薬剤投与
HI のちょうど 30 分前に、HIF-1 阻害剤 (YC1; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) 1.52 μg を左脳室に注射しました (Paxinos および Franklin、2013)。 5-μLHamilton注射器（Yingweida Technology、北京、中国）。 前述したように、YC-1は人工脳脊髄液に0.304μg/μLの濃度で溶解した(Shen et al.,2012; Na et al.,2015)。
ウェスタンブロット分析
Ｐ７ラットを２％セボフルランで麻酔し、手術後１２、２４、４８時間、および２８日後に子ラットから海馬組織を抽出した。 抽出後、組織を直ちに氷上に置いた。
全上清タンパク質を、放射性免疫沈降アッセイ剤（Beyotime、ハイメン、中国）を添加することによって単離した。 タンパク質濃度はOne BCA Kit (Beyotime)を用いて測定した。
次に、標本を12.5%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。 5% ウシ血清アルブミン (Sigma-Aldrich) で 4 度でブロッキングした後、メンブレンを抗グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology) を含む適切な一次抗体とともにインキュベートしました。 、ダンバース、マサチューセッツ州、米国）、抗 DJ-1（1:1000;カタログ番号 ab18257; アブカム、ケンブリッジ、英国）、抗 VHL（1:5000;ポリクローナル;カタログ番号 ab77262; アブカム）、抗-HIF-1（1:900;ポリクローナル;カタログ番号 ab2185;アブカム）、抗ニューロカン（1:200;モノクローナル;カタログ番号 sc-33663;Santa Cruz Biotechnology、ダラス、テキサス州、米国） 、抗シナプス後密度タンパク質 95 (PSD95; 1:1000; モノクローナル; カタログ番号 3409S; Cell Signaling Technology)、抗成長関連タンパク質 43 (GAP43; 1:2000; ポリクローナル; カタログ番号 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology) 、シカゴ、イリノイ州、米国）、および抗 GFAP（1:5000、ポリクローナル、カタログ番号 ab53554;Abcam）。
その後、ブロットを抗ウサギ IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao、Beijing、China) または抗マウス IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) とインキュベートしました。室温で2時間。
タンパク質ブロットは、強化された化学発光検出試薬（SuperSignal West Pico; Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を使用して視覚化しました。 タンパク質バンドはImageJソフトウェア(National Institutes of Health)を用いて定量化した。 ウェスタンブロットの分析では、データを GAPDH に対して正規化しました。
免疫組織化学
手術から２８日後、上記の方法を用いてラットに麻酔薬を投与し、４％ホルマリンで灌流し、免疫蛍光染色のために脳を取り出した。
脳を4%パラホルムアルデヒドに4℃で48時間浸漬し、その後段階的エタノールシリーズで脱水し、最後にパラフィンに包埋した。 次に、パラフィン包埋組織をビブラトームで厚さ 2.{5} μm の切片に切断し、得られた切片を室温で保存しました。
各脳は連続的に切片化され、NeuN (ニューロン マーカー)、GFAP (星状細胞マーカー)、およびニューロカン (グリア瘢痕マーカー) 染色のために 3 つの不連続な脳切片が選択されました。 GFAP(1:250; ポリクローナル; カタログ番号 ab53554; アブカム)、ウサギ抗原 (1:100; カタログ番号 12943; Cell Signaling Technology)、および/またはマウス抗ニューロカン抗原 (1:200; モノクローナル; カタログ番号 sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) を加湿チャンバー内で 4 度で一晩保管しました。
続いて、切片を0.1Mリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、Alexa Fluor-594に結合した抗ウサギIgGを含む適切な二次抗体とともに室温で2時間インキュベートしました(1:200;Life Technologies、米国ニューヨーク州グランドアイランド）、Alexa Fluor-594に結合した抗マウスIgG（1:200; Life Technologies）、およびフルオレセインイソチオシアネートに結合した抗ヤギIgG（1:200; Life Technologies）。
細胞核の対比染色を、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(Beyotime)を用いて5分間実施した。
染色切片の観察には、オリンパスＢＸ５１顕微鏡（オリンパス株式会社、東京、日本）を使用した。 左海馬の 3 つの視野を写真撮影のために各スライスからランダムに選択しました。ImageJ ソフトウェアを利用して定量的共局在を推定し、したがってマンダースの重複係数を計算しました。
For more information:1950477648nn@gmail.com
