セボフルランの短期間の吸入は、新生児ラットの低酸素虚血性脳損傷後のグリア瘢痕形成を軽減できる パート 3
May 13, 2024
SPC は海馬における HIF-1 発現を上方制御します
以前の研究で、我々は、セボフルランのポストコンディショニングが海馬における星状神経膠症とグリア瘢痕形成を軽減し、HI後の学習と記憶障害を改善することを発見しました。
グリア瘢痕化は神経系に関連する病気です。 この病気は記憶喪失を伴うことが多く、患者に重大な苦痛を与えます。 ただし、グリア瘢痕化と記憶の間には強い関係があることを認識する必要がありますが、記憶力が必然的に低下するという意味ではありません。
グリア瘢痕の治療中は、前向きな姿勢と正しい治療方法が非常に重要です。 私たちは楽観的な態度を維持し、患者に適切な治療を受けるよう促し、必要な支援を提供するよう努める必要があります。
さらに、適切な食事と運動は、グリア瘢痕の予防と治療に役立つ重要な方法です。 バランスのとれた豊富な食事は、体の回復に役立つ十分な栄養素を提供します。 適切な運動は血液循環と新陳代謝を促進し、体の免疫力を高めます。
結論として、グリア瘢痕は記憶に影響を与える可能性がありますが、前向きな姿勢と適切な治療は、困難を克服し、健康な体と鋭い精神を維持するのに役立ちます。 だからこそ、前向きな姿勢で困難に立ち向かい、勇気を持って前進していきましょう。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサにはアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。 これらの物質は記憶と学習にとって非常に重要です。 さらに、カンクサは血流を改善し、酸素の供給を促進するため、脳に十分な栄養素とエネルギーが確実に供給され、脳の活力と持久力が向上します。
HIF{{0}} は、この神経保護機構における重要な因子であることが確認されました (Yang et al., 2019)。セボフルランによって誘発される特異的な制御をさらに調査するために、海馬における HIF-1 タンパク質の発現を調べました 12 、SPC の 24 時間後、および 48 時間後。 私たちの結果は、HIF-1発現の動的な変化を明らかにしました：治療の12時間後、偽群と比較してHI群とHIS群でHIF-1発現の増加が観察されました（P < 0.0001）が、HI間に実質的に差はありませんでしたおよび HISgroups (図 7A および B)。
SPC の 24 時間後、HIF1 発現は、HIS グループと比較して HI グループで減少しましたが (P < 0.001)、偽グループと比較して依然として増加しました (P < 0.001、図 7C)。 。
SPC から 48 時間後、HI グループの HIF-1 発現は非常に低いレベルに戻り、偽グループと変わりませんでした。 ただし、HIF-1 の発現は、HIS グループで依然として非常に高いレベルで維持されました (P < 0.01、図 7D)。次に、HIF-1 mRNA の発現を調べました (リアルタイム PCR 分析による、SPC 後 12、24、および 48 時間後の海馬における GAPDH との比較)。
その結果、HIF{0}} mRNA発現はHI後24時間でピークに達し(P < 0.001、図7E)、調べた3つの時点でHI群とHIS群の間に明らかな差はなかったことが明らかになった。 したがって、セボフルランによって誘導されるHIF-1の動的制御にはおそらく翻訳後制御が関与しており、これは我々の仮説と一致する。
SPCがDJ-1を上方制御してHIF-1のユビキチン化を阻害することにより、新生ラットのHI損傷後のアストログリオーシスを軽減するという仮説をさらに調査するために、VHLおよびDJ-1タンパク質の発現を調べました（図8A）。
VHLタンパク質は、偏りのない質量分析スクリーニングで分析され、aPDモデルで確認されたように、DJ{{0}}と物理的に相互作用します（Parsanejad et al.、2014）。私たちの研究結果は、DJ-1がVHL依存性ユビキチン化を阻害し、HIF-1の発現を安定化できることを示しました。さらに、私たちの結果は、HI群と比較して、HIS群でDJ-1の発現が増加するとVHLの発現が減少することを示しました（P < 0.05、図8BおよびC）。
HIF-1 阻害剤 YC-1 は、セボフルランによって誘発される学習と記憶の改善を減弱させます
新生児 HIE は多くの悪影響を長期的にもたらします。 最も重篤な機能障害の 1 つは、学習と記憶の障害です。 豊富な証拠は、SPCがHI損傷から保護し、学習および記憶機能を改善できることを実証している（Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019; Yanget al., 2019）。
私たちは、HIF-1 の阻害剤である YC{{0}} を注射して、セボフルランの保護機構が HIF-1 に関連しているかどうかを検証しました。 モリス水迷路を使用して、手術後 29 ～ 34 日目の学習と認識を評価しました (図 9A)。HI 群と HIS 群の間には、逃避潜時における明らかな差異がありました (P < 0.0001)。 YC-1 治療は、セボフルラン曝露後の逃避潜時を顕著に増加させました (P < 0.01; 図 9B)。
空間プローブテストでは、HIS グループは HI (P < {0}.01) および HIS + YC-1 (P < 0.05、図 9C) よりも優れたパフォーマンスを示しました。ただし、YC-1注射グループはHIグループと比較して顕著な改善を示さなかった。 これとは別に、水泳速度またはサスペンションテストの結果によると、運動障害は観察されませんでした（P > 0.05; 図9DおよびE）。
オープンフィールドテストの結果、グループ間で中心部で過ごした時間や総移動距離に差はなかったことが明らかになり（P > 0.05、図9F–H）、4つのグループ間に運動活動や不安行動の相違がないことが示されました。
議論
この研究では、P7 ラットの HIE に対する SPC の効果を評価するために、古典的な Rice-Vannucci モデルが使用されました (Jevtovic-Todorovicet al., 2003; Grandvuillemin et al., 2017)。 我々の結果は以下のことを示した：(1) SPC は過度の海馬星状神経膠症とグリア瘢痕化を軽減することにより、新生児 HIE の長期学習と記憶を改善した。 (2) セボフルランは、HIF-1 のユビキチン化の阻害を通じて発現を安定化することにより、観察された神経保護を誘導する可能性があります。 (3) セボフルランによるHIF-1のユビキチン化の阻害は、PDにおいて神経保護作用があることが証明されており(Parsanejad et al., 2014)、SPCによって調節されているDJ-1の上方制御を介して誘導される可能性がある。
グリア瘢痕は、発達中の脳におけるニューロンの整列とシナプスの生成に影響を与えます。 今回、我々は、セボフルランが脳保護タンパク質DJ-1を上方制御し、HIF-1のユビキチン化レベルを低下させ、グリア瘢痕化を改善し、脳保護を発揮するために長期的な学習および記憶機能に影響を与えることを発見した。生き残った HIE は、脳性麻痺、てんかん、特に長期にわたる学習および記憶障害などの重度の神経機能障害を患っています (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015)。
しかし、HIE の現在の治療は主に対症療法に焦点を当てています (Yuan、2009)。 神経保護を提供し、長期的な転帰を改善できるのは、全身の中等度の低体温療法などの少数の治療だけです。
動物研究で検証されているように、新生児 HIE 後の吸入麻酔薬セボフルランの適用は、HI によって引き起こされる損傷を回復できる神経保護を提供します (Lai et al., 2016; Kim et al., 2017)。 発達神経系に対する麻酔薬の影響も、長年にわたりホットな研究テーマとなっています (Archer et al.,2017)。
吸入麻酔薬の脳への影響は濃度に依存します。 低濃度で短期間の治療は損傷した脳を保護する効果がありますが、高濃度で長期間の治療は脳組織に損傷を与える可能性があります。 しかし、脳損傷から保護するメカニズムはまだ解明されていません。
したがって、我々は、学習および記憶機能の改善に対するセボフルランの潜在的なメカニズムを調査した。アストロサイトは、新生児仮死を含む損傷反応の重要な中枢神経系構成要素である(Zhao and Rempe、2010)。 HI 損傷後の急性期では、これらのグリア細胞が活性化され、増殖し始めます。
グリア細胞の増殖は、損傷部位を封鎖し、海馬組織構造を再構築し、局所免疫応答を時間的および空間的に制御するために重要です。 しかし、この反応は慢性期では有害になります（Peknyand Nilsson、2005; Pekny et al.、2014）。 実際、この過剰な星状細胞肥大は、海馬の解剖学的構造を損傷します。
より具体的には、我々の免疫蛍光の結果は、CA1およびCA3錐体層の周囲およびDG領域(特に顆粒細胞層と肺門の間の境界)の星状細胞が正常な組織構造をひどく破壊していることを示した。 グリア足場の突起は規則的なニューロン配列に成長しました。
形態学的結果は、これらの過剰なGFAP発現放射状グリアがそのプロセスを密なメッシュに配向し、それがシナプスの発達を妨げ、空間依存性の学習と記憶を直接損なう壁状構造を形成することを示した(Wanner et al., 2008)。モリス水迷路テスト、海馬関連の学習と記憶を検出するために使用される古典的な行動検査(Wu et al., 2018)をこの研究では免疫蛍光染色の結果と組み合わせて、セボフルランが過剰な星状神経膠症とグリア瘢痕化を軽減することによって学習と記憶を改善できるという新しい証拠を提供しました。
SPC後にニューロカンおよびGFAPinの肥大星状細胞の免疫蛍光強度が減少しただけでなく、タンパク質発現レベルも減少した。 一方、Nissl 染色では、SPC 後のより高密度でより規則的な海馬構造、多色性の細胞質、神経細胞の減少が非常に少ないこと、および顕著な細胞萎縮が明らかになりました。
ゴルジ染色は、SPC が樹状突起スパインの数を増加させる可能性があるという証拠も提供しました。 この研究のもう1つの新しい発見は、SPCがHIグループと比較して海馬におけるシナプスマーカーPSD95およびGAP43の発現を上方制御したことである。
この現象は、グリア瘢痕の軽減とは別に、セボフルランが海馬のシナプス形成を促進し、それが学習および記憶機能を直接改善する可能性があることを示している（Zhanget al., 2015; Lu et al., 2017）。
SPC は、発生中の新生児 HIE におけるグリア瘢痕化と過剰な星状細胞増殖を軽減しました。 デンドリテスパインの数は SPC 後に上昇する可能性があるため、セボフルランが HI 後にシナプス形成を誘導できるという証拠が得られます (Roberts et al., 2010)。 HIF1阻害剤であるYC-1の適用は、SPCによって誘発された治療効果を逆転させ、シナプス形成の保護がHIF-1と深く関連していることを示した。
重要な転写因子として、HIF-1 には、虚血後の細胞生存、グルコース輸送と代謝、および血管新生に関与するプロセスなど、異なる機能を実行するさまざまな標的遺伝子があります (Ostrowski and Zhang、2020)。さらに、HIF{{ 2}} の発現はさまざまなメカニズムによって厳密に制御されています。 以前の研究では、酸素依存性のユビキチン化分解経路のため、HIF-1 は脳組織内に高い効果的なレベルで一貫して存在できないことが実証されています (Hirayama and Kiyomi, 2017)。
したがって、HIF発現レベルを維持する方法を見つけることで、HI後の保護効果を延長することができます。最近、脳損傷を軽減するためにHI損傷期間の後に軽度の低酸素ポストコンディショニングを適用するという新しい治療法が提案されました(Zhan et al., 2012)。低酸素ポストコンディショニングは、アストロサイトとミクログリアの両方を含むグリア活性化を減少させることが検証されています。
さらに、低酸素ポストコンディショニング後に炎症マーカーの減少が観察されています (Teo et al., 2015)。 この保護の根底にある潜在的なメカニズムは、HIF-1 発現の維持と密接に関連していることが実証されました(Zhu et al., 2014)。現在、低酸素症のポストコンディショニングを従来の有害な治療法として臨床現場で適用することはほぼ不可能であり、多くの潜在的な危険を抱えています。 さらに、低酸素耐性の個人差により、低酸素ポストコンディショニング治療の用量制御を標準化することが困難になっている(Zhan et al., 2012)。
新生児 HIE の場合、低酸素治療の不正確なポストコンディショニングは二次損傷を引き起こす可能性が非常に高くなります。 対照的に、セボフルランは臨床現場でより安全でマイルドで制御可能であり、私たちの研究で実証されたように、HIF-1の発現をアップレギュレートすることもできます。
PDにおける神経保護の役割と同様に、DJ-1は私たちの研究においてSPCにおいて重要な役割を果たしているようです。 広く知られている E3 ユビキチンリガーゼ複合体である VHL の最もよく定義された基質は、HIF-1 (Zhang et al., 2018) です。 DJ-1 は VHL と相互作用することが確認されており、VHL 発現を効果的に減少させ、HIF-1 の安定化を誘導します (Parsanejad et al., 2014)。
私たちは、セボフルランが DJ-1 を上方制御し、VHL のユビキチン化活性を阻害することにより、低酸素損傷から脳を保護しているという仮説を立てました。 リアルタイム PCR およびウェスタンブロット分析から得られた我々の新しい発見は、この仮説を裏付けています。 まず、SPC グループと HI グループ間の HIF-1 の違いは、転写の変化に起因するものではありません。
第二に、SPC グループでは VHL 発現が減少し、DJ-1 発現が増加しました。 第三に、HIF-1の安定化により、シナプス形成、学習、記憶機能、逆膠症、グリア瘢痕化が保護されました。 したがって、セボフルランは、DJ-1相互作用を介したVHLによるユビキチン化の阻害を通じてHIF-1を制御している可能性が最も高いです。以前の研究では、HIF-1が神経幹前駆細胞の制御と応答の促進において重要な役割を果たしていることが示されました低酸素症に至る（Cunningham et al., 2012）。
HIF-1 は、神経幹前駆細胞の多分化能と分化時の発生結果の非内因性調節因子です。 さらなる研究により、HIF-1が脳室下帯のNotchおよびWntシグナル伝達経路の調節を通じて神経幹細胞のニューロンへの分化を促進し、グリア細胞への分化を阻害することが示された(Lie et al.,2005; Morris et al., 2007;桑原ら、2009;Mazumdaret al.、2010)。
新生児ラットの海馬では、HIF-1 は神経前駆細胞の分化結果を調節して過剰な星状神経膠症を軽減することによって神経保護を提供する可能性もあります。ただし、具体的なメカニズムはまだ解明されておらず、さらなる研究が必要です。現在の研究にはいくつかの限界がありました。 第一に、星状細胞活性化の動的な変化は観察または記録されませんでした。
第二に、HIF1 が星状神経膠症を軽減する決定的なメカニズムは調査されていませんでした。 第三に、アストロサイトとミクログリアの活性化は同時に起こることが観察されていますが、私たちの研究は、ミクログリアの活性化やそれに続く炎症反応ではなく、アストロサイトに焦点を当てており、これは調査するのに非常に価値があります。
第二に、雌ラットの行動試験成績は雄ラットよりわずかに優れており、雌ラットのグリア細胞の増加もマレラットよりわずかに少なかった。
しかしながら、両性の行動試験結果は、セボフルランポストコンディショニング後の統計的な差異を示さなかった。HI後の発達に対する性特異的効果の根底にある特定のメカニズムは、今後の研究で調査される予定である。 さらに、DJ-1をコードする遺伝子のノックアウトなどの遺伝学的方法は、SPC治療の神経保護効果がHIF-1のユビキチン化の阻害に起因するかどうかを実証するのに有益であると思われる。
いずれにせよ、我々の発見は、セボフルランがラット海馬におけるサストログリア症とグリア瘢痕形成を軽減し、HIF-1の発現を安定化することによってHI損傷後の学習と記憶障害を軽減することを示しています。 このメカニズムは、神経保護タンパク質DJ-1のセボフルラン誘発性の上方制御に関連している可能性があり、したがってHIF-1のユビキチンリガーゼであるVHLが減少します。 これらの発見は、新生児虚血性低酸素脳症の治療に新たな標的を提供する。
著者の貢献: 研究の構想と設計: PZ および QSG、実験の実施: QSG、YHZ、および ZYW。 データ解析：QSG、試薬・材料・分析ツールの提供：HX、CL、 論文執筆:QSG; 統計の専門知識、資金の獲得、管理、技術的または材料的なサポート、および監督: PZ。 著者全員が論文の最終版を承認しました。
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