ヒト腎臓におけるCD8およびCD4T細胞集団。
Mar 25, 2022
概要：背景：境界部位および内臓では、組織に存在するメモリーT細胞（TRM）が、ウイルス、細菌、真菌、癌などの病原体に対する免疫バリアに寄与しています。 ただし、人間の腎臓のこれらの細胞の存在と機能に関する情報は乏しいです。 この臓器におけるT細胞を介した免疫学的防御をよりよく理解するために、健康な同種移植片に存在するCD8およびCD4T細胞の表現型および機能的側面を決定することを目的としました。肝臓 組織。 方法：マルチチャネルフェローサイトメトリーを使用して、健康な腎組織サンプル（n=5）および肝臓同種移植組織（n=7）と、これらの側面を健康な対照（n=13）の末梢血中のT細胞と比較しました。 結果：肝臓組織サンプルには、かなりの量のCD8およびCD4T細胞が含まれていました。 循環細胞とは対照的に、肝臓T細胞は頻繁にCD69とCD103を発現し、より頻繁に活発にサイクリングしていました。 さらに、ほぼすべて肝臓T細胞はCXCR3を発現し、循環中のT細胞と比較してCXCR6を発現することがよくありました。 著しく、肝臓T細胞は循環細胞よりも大量のIFNを産生し、しばしば多機能性でした。 結論：TRMの特徴的な特性を持つ機能的T細胞はヒトに存在します肝臓組織。 これらの細胞はより頻繁に活発に循環し、CXCR3およびCXCR6を頻繁に発現します。
キーワード：組織に存在するリンパ球; T細胞; CD8; CD4; CD69; CD103; 肝臓; 同種移植
1.はじめにレジデントメモリーT細胞（TRM）は組織内に存続し、病原体に対する長期的な局所防御を提供します。 再循環T細胞とは対照的に、TRM集団は末梢血では検出できず、表現型、機能、代謝の点で再循環T細胞集団とは大きく異なります[1]。 確かに、肺のようなさまざまな臓器系が、一般に外界から隔離されている循環の場合よりも高い負荷のさまざまな病原体にさらされているという事実を考えると、これは驚くべきことではありません[2]。TkMの組織保持は何年も持続し、スフィンゴシン-1-リン酸受容体1（S1PR1）-スフィンゴシン1-リン酸（SP1）軸が関与するメカニズムによって媒介されます。 S1PR1は、T細胞によって発現される受容体であり、T細胞輸送の重要なメディエーターである生物活性シグナル伝達分子SP1に結合すると、二次リンパ器官からの放出を仲介します。 この軸は、S1PR1の発現に拮抗し、保持を仲介する膜結合型c型レクチンであるCD69によって中断される可能性があります。 さらに、マウスでは、S1PR1の発現は転写因子Krüppel様因子2（KLF2）によって誘導されます。これは、TRMでダウンレギュレーションされ、リンパ球の排出も阻害することがわかっています[3]。 次に、KLF2のダウンレギュレーションは、マウスT細胞でTpM特異的に発現するT細胞（Hobit）でのBlimplの転写因子ホモログによって媒介されることが示されました[4]。 さらに、一部のTRMはCD103（インテグリンE）も発現します。これにより、CD69およびCD103の発現を使用してTRMを同定できます[1]。
TRMの表現型と機能に関する知識はさまざまなヒト組織で増加していますが、これらの側面についてはほとんど知られていません。肝臓。 ここで、T細胞は、下部尿路から上昇する細菌やポリオーマウイルスBK（BKPyV）のようなレノトロピックウイルスなどの異なる病原体のセットにさらされています。 実際、我々は最近、ヒトの腎臓がCD69および/またはCD103を発現するT細胞のサブセットをどのように含むかを説明しました。その中には、BKPyVタンパク質であるビリオンタンパク質1（VP1）およびラージT抗原（LTAG）タンパク質を特異的に標的とするCD8T細胞があります[5]。 私たちや他の人々は、CD69 / CD 103-を発現する粘膜関連不変T（MAIT）細胞の存在を示しました。肝臓組織[6,7]。
この臓器の局所免疫応答を構成するT細胞の種類をよりよく理解するために、マルチチャネルフローサイトメトリーを使用して、肝臓ドナーから分離されたTRM肝臓腎移植レシピエント（RTR）および健康な人からの材料肝臓腎明細胞癌に隣接する組織。これらの集団が循環中のT細胞集団とどのように比較されるかを確認します。私たちはその人間を見つけました肝臓組織は、CD69、CD69、およびCD103のみを発現する、またはこれらのマーカーをまったく発現しない、かなりの量のCD4およびCD8T細胞を保持します。 CD 69-CD103-セルが肝臓組織は循環中のT細胞とは実質的に異なり、標準的なTRMマーカーを欠くTRM集団を表している可能性があります。 さらに、血液と比較した場合、Ki -67の発現の増加によって判断されるように、腎臓T細胞がより頻繁に活発に循環していることを示しています。 また、CD8およびCD4T細胞が肝臓組織はほとんどの場合CXCR3を発現し、多くの場合CXCR6を発現します。 これらの発見は、腎臓に存在するメモリーT細胞集団の誘引と維持におけるこれらのケモカイン受容体の役割を示唆しています。
2。材料と方法
2.1。 患者とサンプルサンプルは、アムステルダムUMCロケーションAMCのBiobank腎疾患から入手しました。 このバイオバンクでは、血液や肝臓組織は、健康的な生活から収集され、保存されます肝臓腎臓移植の前後に追跡されるドナーとRTR。 この研究はヘルシンキ宣言とイスタンブール宣言に概説されている原則に従って実施され、すべての参加者はバイオバンクに登録する前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 さらに、腫瘍腎摘出術を受けた患者の残存組織（腫瘍から離れた腎臓組織）が病理学部から寄贈され、バイオバンクにも保管されました。 これらの組織は、オランダ医学科学協会連合の行動規範（Human Tissue and Medical Research：Code of Conduct for Responsible Use、2011 www.federa.org）に従って匿名で処理されました。
2.2。 末梢血単核細胞（PBMC）血液サンプルはサイトメガロウイルス（CMV）-血清反応陰性の健康な対照（生きている肝臓手術前のドナー、n=13）。 この研究の参加者の特徴を表1に示します。PBMCは標準的な密度勾配遠心分離によってヘパリンナトリウム血液から分離され、その後分析の日まで凍結保存されました。
2.3。 腎臓組織健康な腎臓組織サンプル（n {{0}}）は、腎細胞癌（腎臓の反対側の極から離れた非腫瘍組織）および移植腎臓組織（n {{1）のために外科的に切除された腎臓から得られました。 }}）移植失敗後、外植された腎同種移植片から得られた。 これらのサンプルは、それぞれ健康な腎臓サンプルおよび移植腎臓サンプルと呼ばれます。 腎皮質のスライスをMcElwainTissueChopper（Ted Pella、Redding、CA、USA）で1- mmの立方体に切り刻み、5 0 mLのチューブに移し、血液がなくなるまで冷PBSで洗浄しました。目に見えて存在し、上澄みは透明でした。 予熱（37度）消化培地を添加し、組織10gあたり40mL（DNAseタイプIV（50 KU / mL）（Sigma Aldrich、Zwiindrecht、オランダ）、コラゲナーゼタイプIV（0.5 mg / mL）（Worthington Biochemical、 Lakewood、NJ、USA）、BSA（60 mg / mL）（Sigma Aldrich）、20 uL / mL胎児子牛血清（FCS、VWR International BV、アムステルダム、オランダ）、TRIS（0.025 M）（Merck BV、アムステルダム、オランダ）、HBSS（Westburg BV、Leusden、オランダ）のペニシリン-ストレプトマイシン（Biochrom GMBH、ベルリン、ドイツ））、およびシェーカー内で37度で20分間インキュベートしました。 温かい懸濁液をCチューブ（ミルテニー、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ）に移し、GentleMacs（ミルテニー）でM_脾臓_04。01プログラムを実施しました。 消化培地を冷PBSで失活させ、得られた細胞懸濁液をセルストレーナーに通して単細胞懸濁液を得、製造元のプロトコル（Lymphoprep、Abbott Diagnostics Technologies AS、オスロ、ノルウェー）に従って標準密度勾配遠心分離にかけました。 ）。 単離された単核細胞（腎臓MNC）は20パーセントのFCS、000036 v / vパーセントの-メルカプトエタノール、5パーセントのDMSO、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したIMDMで分析の日まで凍結保存しました。
2.4。 フローサイトメトリーLSRFortessaフローサイトメーター（BDBiosciences）で測定を行った。 各サンプルについて、2×106個のPBMCまたは0.5×106から10×106の腎臓MNCを分析しました。 各染色反応の量は細胞数に比例し、抗体濃度は一定のままでした。 細胞を表面抗体（補足表S1）とともに暗所で4度で30分間インキュベートしました。 死んだ細胞は、固定可能な生存率色素eFluor455UV（eBioscience Inc.、Thermo Fisher Scientific、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して除外されました。 FoxP3 /転写因子染色セット（eBioscience Inc.）を使用して細胞を固定および透過処理した後、細胞内標的を含むモノクローナル抗体（補足表S1）を添加しました。 免疫学的目的のためのフローサイトメトリーおよび細胞選別のための公表された方法に従った[8]。 表現型分析に使用されるゲーティング戦略は、補足図S1に記載されています。 分析されたマーカーのいずれも、腎臓のMNCを分離するために使用される消化法の影響を受けなかったことを以前に示しました[7]。
組織サンプルの制限により、カーテンパネルからサンプルが除外されました。 健康なPBMC、健康な腎臓MNC、およびTX腎臓でサンプルごとに分析されたCD3と細胞数は、図S3に示されています。 MNCサンプルは、生存率dveによって評価されるように、リンパ球内に50％を超える生細胞が含まれている場合にのみ分析され、CD69 / CD103ベースのT細胞サブセットは、総細胞数が50を超えた場合にのみさらに特徴付けられました。
CISTANCHEは腎臓/腎不全を改善します
2.5。 刺激アッセイPBMCと腎臓MNCは、以前に説明されているように刺激されました[7,9]。 PBMCと腎臓MNCをDNAseI（200 KU / mL）の存在下で解凍し、洗浄し、未処理の丸底96-ウェルプレート（Corning）の培地（RPMIを添加）で一晩回収しました。 20×106/mL（100μL/ウェル）の濃度で10％FCSおよびペニシリン-ストレプトマイシン）。
翌朝、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA、10 ng / mL; Sigma Aldrich）とイオノマイシン（1 ug / mL; Sigma Aldrich）を加えて細胞を刺激しました。 陰性対照として培地のみを加えた。 すべてのインキュベーションは、CD28（クローン15E8; 2 ug / mL）、CD29（クローンTS 2/16; 1 ug / mL）、ブレフェルジンA（10 ug / mL、Invitrogen）、およびGolgiStop（クローンTS 2/16; 1 ug / mL）の存在下で培地中で行いました。 BD Biosciences）最終容量200 uLで、37度および5％CO2で4時間。
続いて、細胞を表面抗体とともに30分間インキュベートしました（補足表S2）。 死んだ細胞は、固定可能な生存率色素eFluor780（bioscience Inc.、Thermo Fisher Scientific、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して除外されました。 Cytofix / Cytoperm Reagent Set（BD Biosciences）を使用して細胞を固定および透過処理した後、細胞内染色用のモノクローナル抗体（表S1）を追加しました。 細胞を2回洗浄し、LSRFortessaフローサイトメーターで分析しました。 機能分析で使用されるゲーティング戦略は、補足図S2にあります。 各T細胞サブセットの多機能性を決定するために、各集団の平均機能数を次の式を使用して計算しました:(（1つのサイトカインを産生する細胞の割合] * 1）プラス（[2つのサイトカインを産生する細胞の割合] * 2）プラス（[3つのサイトカインを産生する細胞の割合] * 3）プラス（[4つのサイトカインを産生する細胞の割合] * 4）プラス（[5つのサイトカインすべてを産生する細胞の割合] * 5））/100。
2.6。データ分析
FlowJoバージョン10（FlowJo、米国オレゴン州アッシュランド）を使用してデータを分析しました。 すべてのグラフと図は、Windows用のGraphpadPrismバージョン800（GraphPad Software、La Jolla、CA、USA）を使用して作成されました。 同じプログラムがデータの統計分析にも使用されました。 ノンパラメトリックなMann-Whitney-U検定を使用して、対になっていないサンプルの有意性を決定しました。 ペアのサンプルを比較するために、ウィルコクソンの符号付き順位検定が使用されました。 p値<0.05 were="" considered="" statistically="">
3.結果
3.1。CD8および/またはCD4の明確な発現と健康な腎臓組織におけるT細胞による組織レジデンシーのマーカーまず、末梢血中のCD 3-陽性T細胞によるCD4およびCD8の発現を、健康な腎臓組織で検出された細胞と比較しました。 CD 4- CD8 plus（CD8）T細胞は、血液よりも腎臓組織で有意に多く検出されました（（中央値）25％対38％）（図1a）。対照的に、CD4 * CD {{9} }（CD4）T細胞は、腎臓組織よりも血液中でより高い頻度で検出されました（（70％対52％）図1a）。 全体として、CD4 T細胞は、CD8 T細胞よりも健康な腎臓組織でより頻繁に見られました（図1b）。
次に、CD8およびCD 4-で定義されたT細胞サブセットにおける組織レジデンシーマーカー、CD69およびCD103の発現を調査しました。 予想通り、CD69およびCD1 0 3は、末梢血中の細胞によって実質的に発現されませんでした（図1c）。 健康な組織では、CD 69- CD 103-、CD69 + CD 103-、CD69tCD103 plus、およびCD 69- CD103 plusの表現型は、46％、45％、 CD8Tセルの6.6パーセント、1.8パーセント、CD4Tセルの61パーセント、38パーセント、0.44パーセント、0.43パーセント（図1c）。 結論として、CD8、特にCD4 T細胞は、健康なヒト腎臓組織でかなりの数が検出されました。 さらに、組織レジデンシーのマーカーであるCD69およびCD103の発現は、主に血液ではなく健康な組織に見られるT細胞で検出されました。
3.2。健康におけるT細胞/腎臓組織による一般的なサブセットを表すマーカーの異なる発現パターン
CD45RA、チロシンホスファターゼ、CCR7、二次リンパ器官へのT細胞輸送を仲介することが知られているケモカイン受容体、およびCD28とCD27、両方ともT細胞活性化に強く関与する共刺激受容体はすべて、機能的なT細胞サブセットを識別するために伝統的に使用されるマーカーですJ1 { {53}}、1l。 血液中のこれらのサブセットの分布が腎臓組織の分布とどの程度異なるかを調査したかったのです。 予想通り、循環で検出された最大のCD8 T細胞サブセット（すなわち、総人口の5％以上に関するもの）は、CD45RA + CCR7 + CD28 + CD27 +（ナイーブT細胞またはTN、（中央値）13パーセント）、CD45RA-CCR7プラスCD28プラスCD27プラス（中央メモリT細胞またはTcM、6パーセント）、CD45RA-CCR 7-CD28プラスCD27プラス（TEv1,3 0パーセント）、 CD45RA-CCR 7-CD28とCD27-（Tau2,1 0パーセント）、CD45RA-CCR 7- CD 28- CD27 *（TEy3,6パーセント） 、CD45RA-CCR 7- CD 28- CD 27-（TM4,6パーセント）およびCD45RAとCCR 7- CD 28- CD 27-（TEMRA 、10パーセント）表現型。 健康な組織では、TN表現型で検出されたCD8 T細胞はほとんどなく（0.6％）、Tax表現型を示したのはごくわずか（0.8％）でした。 対照的に、健康な腎臓組織で検出されたCD8 T細胞は、かなりのTEv 1-（22パーセント）、TEM 2-（12パーセント）、Tpx 3-（18パーセント）、TEx{で構成されていました。 {65}}（23パーセント）、およびTEyRA（11パーセント）T細胞集団（図1dおよび図S4）。 血液中のCD4T細胞を見ると、最大の集団はTy-（35％）、TcM-（25％）、TEM1-（16％）、TFM 2-（9％）、および特に指定されていないCD45RAtCCR7-CD28とCD27*表現型（0.4パーセント）を持つ集団（図1dおよび図S4）。健康な腎臓組織では、TN-（3パーセント）またはTcMを発現するCD4T細胞はほとんどありませんでした。 -（3パーセント）表現型。 代わりに、TEM 1-（22パーセント）、TEM 2-（40パーセント）、またはTEM4（14パーセント）表現型を持つかなりの数の細胞が健康な組織で検出されました（図1dおよび図S4） 。 結論として、CD45RA / CCR7 / CD28 / CD27-で定義されたCD8およびCD4T細胞サブセットの分布は、血液と健康な腎臓組織の間で大幅に異なります。
3.3。 健康なヒト腎臓組織のCD8およびCD4T細胞は、活発に循環する細胞を含むことが多い次に、血液および腎臓組織のCD8T細胞集団とCD4T細胞集団の間で、細胞傷害性エフェクター記憶プロファイルに典型的なマーカーの発現に違いがあるかどうかを調査しました。 まず、T-box転写因子T-betとeomeso-dermin（Eomes）の発現を調べました。 これらの転写調節因子は、急性期エフェクター細胞の生成、インターフェロン-yやグランザイムBなどの分子の発現の誘導、および二次記憶応答の生成に直接関与しています。 予想通り、T-betの発現は循環CD8 T細胞間で頻繁に見られましたが（54％）、循環CD4 T細胞がこの転写因子を発現することはめったにありませんでした（13％）。 興味深いことに、CD4 T細胞の場合、T-bet発現は、循環よりも健康な腎臓組織で検出されたT細胞で有意に高かった（53％対13％）。 一部の発現は、循環CD8 T細胞（59％）でも頻繁に検出されましたが、循環CD4 T細胞（15％）ではまれでした。 ただし、Eomesの発現は、血液よりも腎臓組織のCD4 T細胞でより頻繁に見られました（32％）（図2a、b）。
次に、細胞傷害性T細胞による細胞質への注入後にアポトーシスを媒介することが知られているセリンプロテアーゼであるグランザイムBの発現を調べました。 以前の報告と一致して、T-betおよびグランザイムBの発現は、循環しているCD8 T細胞でかなりの数（28％）で検出されました。 しかし、その発現は循環CD4 T細胞（1％）ではまれでした。CD8T細胞の場合、グランザイムBの発現は腎臓組織と循環集団（28％ys.23％）で類似していました（図2c）。 興味深いことに、腎臓CD4 T細胞で検出されたT-betおよびEomesの発現頻度が高いことは、このコンパートメントでのグランザイムBの発現頻度が高いこととは対応していませんでした（5％）。 次に、細胞傷害性急性期エフェクター細胞とエフェクターメモリー細胞によって主に発現されることが知られている共抑制受容体であるKLRG1の発現を調べました。KLRG1は循環CD8 T細胞（54％）によって頻繁に発現されましたが、CD4 T細胞によっては発現されませんでした（54％）。 10パーセント）。 CD8またはCD4T細胞のKLRG11発現の解剖学的コンパートメント間に差は見られませんでした。 最後に、活発に循環している細胞を示すマーカーであるKi-67の発現を調べました。 以前の観察と一致して、循環CD8およびCD4T細胞間のKi-67発現はまれでした（それぞれ1パーセントおよび2パーセント）。 興味深いことに、CD8 T細胞間、特にCD4 T細胞間では、Ki -67の発現が腎臓組織のT細胞で有意に頻繁に検出されました（それぞれ3％と11％）（図2e）。 結論として、CD4 T細胞は健康なヒト腎臓組織で検出されましたが、このコンパートメントのCD8 T細胞では検出されず、T-betおよびHomesがより頻繁に発現していました。 ただし、これは腎臓CD4T細胞によるグランザイムBのより頻繁な発現に変換されませんでした。 さらに、サイクリング細胞の総数は少なかったが、腎臓組織は循環よりも有意に活発にサイクリングしているCD8およびCD4T細胞を含んでいた。
3.4。 健康な腎臓組織のCD8およびCD4T細胞は、ほぼすべてのCXCR3-位置にあります次に、循環T細胞集団について以前に示したように、すぐには細胞毒性のない記憶細胞の循環集団に典型的な他のマーカーの発現の違いを探しました。 最初に、IL -7 Rの発現を調べました。これは、主に循環中のナイーブおよび初期分化したメモリー細胞で発現し、恒常性増殖の維持に関与しています[10、12、13]。 末梢血では、IL -7RaはCD8T細胞（84％）およびCD4 T細胞（98％）によって頻繁に発現されていました。 健康な腎臓組織のCD8およびCD4T細胞は、循環T細胞よりも有意に少ない頻度でこのマーカーを発現しました（それぞれ71％および76％）（図2f）。
次に、他のさまざまなケモカイン受容体の発現を調べました。興味深いことに、炎症組織へのT細胞輸送に関与するケモカイン受容体であるCXCR3 [14-17]は、腎臓組織のCD8およびCD4 T細胞の数が非常に多いことで発現しました（99それぞれパーセントおよび91パーセント）、循環T細胞による頻度は大幅に低くなります（それぞれ58パーセントおよび26パーセント）（図2g）。 最後に、TRM集団の形成に関与していることが知られているCXCR6の発現を決定しました[18-22]。 一方、CXCR6は循環CD8 T細胞の少数の集団（16％）によってのみ発現され、循環CD4T細胞によっては実質的に発現されませんでした。 腎臓組織のCD8およびCD4T細胞のかなり大きな割合がこの分子を発現しました（それぞれ40％および40％）（図2h）。 結論として、循環中のすぐには分化しない状態に通常関連するマーカー、おそらく-7 Ra、CCR7、CD28、およびCD27は、血液中のものと比較した場合、腎臓CD8およびT細胞によって発現される頻度が大幅に低くなりました。対照的に、腎臓T細胞はCXCR6をより頻繁に発現し、ほとんどの場合CXCR3を発現していました。
3.5。健康な腎臓と同種移植T細胞の表現型の違いは最小限です次に、これらの所見が、さまざまな臨床適応症で得られた移植腎同種移植片の組織に残っているかどうかを調査したいと思いました（表1）。健康な同種移植組織のCD8およびCD4T細胞の数に関しては、違いは見られませんでした（図3a）。 しかし、同種移植組織よりも健康な組織では、CD4T細胞が多くCD8T細胞が少ないという重要ではない傾向に気づきました（図3b）。 さらに、CD69/CD103expressionおよびCD45RA/CCR7 / CD28 / CD 27-で定義されたサブセットを見ると、CD69 /CD103-またはCD45RA/CCR7 / CD28 /CD27-の分布に違いはありません。 CD8 / CD4表現型に関係なく、定義されたサブセットが記録されました（図3dおよび図S5）。 細胞傷害性循環T細胞に典型的なマーカーの発現頻度を調べたところ、健康な腎臓または同種移植T細胞間でT-bet、KLRG1、またはグランザイムBの発現に違いは見られませんでした（図3a、gh）。 Eomesの発現は、健康な組織T細胞よりも同種移植組織CD4 T細胞で見られる頻度が低いことがわかりました（図3f）。 他のマーカーの発現に違いは観察されませんでした。 （図3- lおよび図S5b-d）。 結論として、同種移植CD4 T細胞間のEomesの発現頻度が低いことを除けば、細胞集団は研究集団間で異ならなかった。
3.6。 腎臓組織のCD69-CD103-T細胞は循環細胞とは異なります健康な腎臓組織と腎臓同種移植組織に見られるCD8およびCD4T細胞の同様の表現型構成を考慮して、CD69およびCD103の発現に従ってこれらの細胞の特性をさらに調べるために、両方の研究グループからのデータをプールしました。 CD 69- CD103 plusセルは常に非常に低い頻度で検出されたため、<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">まず、腎臓T細胞集団におけるCD69 / CD1 0 3の共発現に従って、これらのサブセットの違いを調査しました（図4および図S6）。 興味深いことに、CD8およびCD4 T細胞の両方で、CD 69- CD 103-、CD69とCD{の間のCD45RA/ CCR7 / CD28 /CD27-定義サブセットの分布に大きな違いが見られました。 {14}}およびCD69*CD103*サブセット。 CD8 Tセルの場合、CD 69- CD 103-セルにはかなりの数のTeyRAセル（21パーセント）が含まれており、CD69とCD103-およびCD69とCD103のサブセット（5.8代わりに、これらの後者の集団には、はるかに大きなTEy3（それぞれ、13％、30％、および32％）およびTEy4（それぞれ、8％、19％、および33％）の部分集団が含まれていました。 CD4 T細胞の場合、CD 69- CD 103-、CD69 * CD 103-、およびCD69とCD103 *サブセットの間にTEyRA細胞はほとんど見られませんでした（2.6パーセント、0パーセント、および1.7パーセント、それぞれ）。 代わりに、これらのセルは、TFw1（それぞれ、26パーセント.24パーセント、および10パーセント）とTEy2エル（それぞれ、30パーセント、46パーセント、および27パーセント）の大きなサブポピュレーションを保持していました。CD69とCD 103-の中で、特にCD69 * CD103 *セルの中で、はるかに大きなTEM4サブポピュレーションが見られました（それぞれ6パーセント、11パーセント、34パーセント）。
これらの違いと、腎臓のT細胞集団がTN細胞とTcM細胞をほとんど含まないという以前の観察を踏まえて、腎臓組織で見つかったCD 69- CD 103-細胞をさらに調査して、これらの細胞がどの程度であるかを判断しました。腎臓循環を通過する循環細胞だけではありません。 そのために、これらの細胞を循環細胞と比較しました。 腎臓組織のCD69-CD103〜細胞は、循環中の細胞とは大幅に異なりました。T-bet、Ki -67、およびCXCR3は、CD8 / CD4表現型に関係なく、腎臓T細胞によってより頻繁に発現されました（図5a-c）。 対照的に、IL -7 R、CCR7、CD28、およびCD27はすべて、CD8 / CD4表現型に関係なく、CD 69- CD 103-腎臓T細胞によって有意に少ない頻度で発現されました（図5d- g）。 腎臓組織のCD69-CD 103- CD4 T細胞は血液よりもKLRG1を有意に頻繁に発現し、腎臓組織のCD 69- CD 103-CD8T細胞はEomesをよりも有意に頻繁に発現しました血中。
次に、CD69とCD103の共発現が機能的可能性のマーカーにどのように影響するかを確認したいと思いました。 まず、細胞毒性の可能性に関連するマーカーを調べました。 個々の亜集団間で違いが認められましたが、CD69またはCD103を共発現させた場合、CD8 T細胞のT-betおよびEomesに結果として生じるパターンは見られませんでした（図6a、b）。対照的に、CD4 T細胞では、これらの転写因子は両方とも一緒に増加しました。 CD69とCD103の共発現（図6a、b）。 KLRG1を見ると、CD8 T細胞の場合、CD69/CD103の共発現とともにKLRG1の発現が低下していることがわかりました。 CD4 T細胞についても、同様の傾向が見られました。 ただし、ここでは、CD 69-CD103-細胞のみがCD69+CD103-およびCD69+CD103 *細胞よりも高い頻度でKLRG1を発現しました（図6c）。 グランザイムBの発現頻度も組織レジデンシーのマーカーとともに低下し、その発現頻度はCD8およびCD4 T細胞の両方でCD69とCD103*細胞の中で最も低かった（図6d）。 血液中のT細胞と比較した場合に腎臓T細胞間で高かったKi-67の発現は、CD69またはCD103の共発現による違いはありませんでした（図6e）。
次に、CD69 / CD103の共発現に従って、通常は非細胞毒性の記憶プロファイルに関連するマーカーを調査しました。 IL -7 Ra、CCR7、およびCD28の発現は、CD 69- CD 103-集団内で最も高く、CD69 / CD103の共発現とともに発現を定義する傾向がありました（図6f-h ）。 次に、CXCR3とCXCR6の式を調べました。 両方のケモカイン受容体は、CD8 / CD4表現型に関係なく、CD69tCD103t細胞によって最も頻繁に発現され、CD69/CD103の共発現とともに上昇傾向を示しました。 CXCR6の場合のみ、この傾向は統計的に有意であり、CD8とCD4の両方のTellに影響を及ぼしました（図6j、k）。 結論として、腎臓組織のCD 69- CD 103-細胞は、循環中の細胞とは実質的に異なり、CD69またはCD103の発現によってマークされていない別のTBv集団に関係している可能性があります。 CD69とCD103の共発現に関して、CD8 / CD4表現型に関係なく、一貫して異なる唯一のマーカーはCXCR6でした。
3.7.腎臓組織のT細胞は、血液中のT細胞よりも多くの場合インターフェロンを産生します最後に、腎臓組織におけるCD8 /CD4-で定義されたT細胞集団によるサイトカイン産生能を調査しました。 まず、インターフェロン-y（IFNy）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン-2（IL -2）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および刺激されたCD8/CD4-によるIL-17は、血液中に見られるT細胞集団から健康な腎臓組織に見られるT細胞集団を定義しました（図7a-e）。 興味深いことに、CD8 / CD4表現型に関係なく、血液中のT細胞と比較した場合、IFNγのみが健康な腎臓組織のT細胞のより大きな割合で一貫して発現されていました（図7a）。 個々のサブセットレベルでも違いが見られました。 具体的には、TNFおよびGM-CSFは、腎臓組織のCD4 T細胞によってより頻繁に産生されました（図7b.c）。 多機能性（すなわち、同時に産生されるサイトカインの数）に関して、腎臓組織のCD4 T細胞は、血液中のCD4細胞よりも多機能性であることがわかりました（図7f）。
次に、健康な組織と同種移植組織からの刺激されたT細胞間のサイトカイン産生能力の違いを調べました。 健康な腎臓組織または同種移植腎組織のT細胞間で、個々のサイトカインの産生、または同時に産生されるサイトカインの数に違いは検出されませんでした（図S7）。 CD69はT細胞の刺激により発現するため、CD103-陰性とCD103-を発現するCD4およびCD8T細胞の違いのみを調べました（図7g-）。 CD103を発現しているCD4およびCD8T細胞を腎臓組織でCD103を発現していない細胞と比較すると、CD8およびCD4CD103細胞はCD103-細胞よりも多くのIFNyを発現していることがわかりました（図7g）。 さらに、IL -1 ZA産生細胞は、腎臓組織のCD103とCD8およびCD4 T細胞の間で低かったが、CD103-集団と比較してこの集団で一貫してより頻繁に発見された。 結論として、CD8 / CD4表現型に関係なく、循環T細胞と比較した場合、腎臓組織でより多くのT'細胞がIFNγを産生しました。 実際、IFNγ産生細胞の割合が最も高かったのは、CD103-を発現するCD4およびCD8腎臓由来T細胞です。 さらに、腎臓同種移植片のT細胞は、これらのパラメーターに関して健康な腎臓組織のT細胞と異ならなかった。
4。議論
現在の研究では、CD8とCD4の発現、およびヒトの腎臓における組織レジデンシーのマーカーであるCD69とCD103に従って、T細胞サブセットの多様性に取り組み、これらを血液と比較しました。 かなりの数のCD8およびCD4T細胞が実際に腎臓組織で検出されました。 さらに、腎臓のこれらのT細胞には、かなりの数のCD69 *CD103-細胞が含まれていました。 CD69プラスCD103プラス細胞も検出されましたが、主にCD8 T細胞間で検出され、CD4T細胞間では事実上存在しませんでした。 同様の所見は、以前は肺のTRMに関するものでした[23]。 予想通り、そのようなCD69およびCD 103-を発現する集団は、代わりに循環にほとんど存在しませんでした。 腎臓のT細胞と血液のT細胞を比較した場合の顕著な違いは、従来のCD45RA / CCR7 / CD28 /CD27-で定義されたサブセットの明確な分布に関係していました。 興味深いことに、T細胞がCD69を単独で、またはCD103と組み合わせて共発現している場合、CD28の発現はより頻繁に発現されませんでした。 理論的には、これにより、これらの集団はCD80およびCD86による共刺激信号の影響を受けにくくなるはずです。 その他の違いは、CXCR3、CXCR6、およびKi-67のより高い発現頻度に関するものでした。 さらに、腎臓T細胞はIFNγ産生細胞を含むことが多く、多機能であることが多かった。 実際、腎臓内では、CD103とTpysは、CD103-陰性の対応物よりも多くのIFN産生細胞を含んでいました。 さらに、CD103T細胞はより頻繁にIL -17を産生しましたが、これは適度な集団に関係していました。
CISTANCHEは腎臓/腎感染症を改善します
CD8およびCD4腎臓T細胞によるCXCR3のより頻繁な発現に関して、CXCR3 / CXCL10軸は、皮膚、肝臓、およびリンパ組織におけるTpM集団の形成に関与することが以前に示されていました[24-28]。 さらに、それは一般的な意味でストレスを受けた上皮および炎症への人身売買に関与しています[14-17]。 健康な腎臓組織のこれらのT細胞の中でCXCR3の頻度が高いことを考えると、CXCR3は腎臓組織のTRMホメオスタシスにも関係しているようであり、必ずしも炎症や危険信号を伴うとは限りません。 CXCR6に関しては、CXCR6 / CXCL16軸は、肺、皮膚、肝臓、脳などのさまざまな区画へのTpstの輸送に不可欠であることがすでに示されています。また、TRMを誘導および保持するために不可欠な普遍的なメカニズムに関係している可能性があります。組織では、人間の腎臓組織のTRMについても[18-22]。
Farberらは、臓器提供者に由来するさまざまなヒト組織タイプに存在するCD8およびCD4 TRM集団を広範囲に特徴づけ、比較してきました。 彼らは、現在の研究で調査された、トランスクリプトームだけでなく、サイトカインを含むさまざまなタンパク質の発現に関しても、肺、脾臓、小腸、およびさまざまな二次リンパ組織のTRM集団がどのように異なるかを説明しました[29-31。 ただし、これらの調査には、ヒトの腎臓のTRM集団、およびこれに関するデータは含まれていませんでした。
主題は乏しいです。 同種移植腎臓では、腎上皮細胞に対して強い親和性を持つウイルスに由来する、ポリオーマウイルスBKVP1およびLTAGタンパク質を標的とするCD8T細胞が検出可能であることを以前に示しました。 これらのウイルス特異的T細胞は、同じ患者の循環に見られる対応物よりも多くのCD69およびCD103を発現していました。 さらに、これらのT細胞は一般的にCD45RA-CD27-グランザイムB陰性の表現型を発現していました[5]。 その後、移植腎摘出術から得られたヒト腎臓組織のTRM集団についても報告されています。 この出版物では、著者らは、これらの組織のT細胞が主にCD8T細胞に関係していることを報告しています[321。 代わりに、CD4T細胞が実際に最大のT細胞サブセットを構成していることがわかりました。 ただし、健康な腎臓組織と比較した場合、バランスは、有意ではありませんが、同種移植組織のCD8T細胞の数が多い方向にシフトしていることもわかりました。 このように、この不一致は別の研究グループによって説明される可能性があり、健康状態では、免疫不全の宿主におけるウイルスや癌などの細胞内の脅威よりも、細菌などの細胞外の脅威に免疫学的防御が集中している可能性があります。 健康な腎臓と同種移植T細胞の間で、研究されたマーカーに他の違いは見つかりませんでした。 ただし、RNAシーケンスのようなトランスクリプトーム、または質量分析のようなプロテオームに関するより広い視野を持つ技術を使用したさらなる研究を採用して、これが実際に当てはまるかどうかを確認する必要があります。
さらに、de Leuretal。 腎臓のTRMがどのようにグランザイムBを頻繁に発現したかを説明しますが、健康な腎臓組織と同種移植腎臓組織の両方で少量のグランザイムBしか検出されませんでした[32]。 しかし、腎臓組織で実質的なT-betおよびEomesを発現するT細胞を検出しました。これは、循環するT細胞集団では、通常、グランザイムBのより高い発現と関連しています[10]。 後者は驚くべきことではないかもしれませんが、グランザイムBの発現もT-betによって直接誘導されるという事実[33,34]を考えると、この関連性は現在の研究では腎臓T細胞間で明らかではありませんでした。 私たちや他の人たちが示したように、人間の肺、脳、皮膚由来のTRM [25,26,3536]や、腎臓由来の組織に存在するMAITアール[6,7]もグランザイムBが少ない。コンテンツは、多くの場合、かなりの量のT-betとEomesを表現しますが、これは（人間の）TkMの一般的な特性である可能性があります。 さらに、肺では、TRMグランザイムBの発現が刺激により急速にアップレギュレーションされることが見られ[35l]、これは他のTeMでも発生する可能性があることを示唆しています。 ここで、著者らは、そのような隠れた細胞傷害性が、細胞傷害性T細胞による損傷から組織の構造的完全性を保護するのに役立つと仮定した。
結論として、腎臓組織のT cllsはかなりの数で存在し、T細胞が組織に付着して存続する分子であるCD69plusおよびCD103plusを頻繁に発現する集団を含むことを示します。 それにもかかわらず、腎臓組織のCD 69- CD 103- T細胞は、循環T細胞とは異なるようであり、別の異なるTiM集団に関係している可能性があり、他のメカニズムによって腎臓に存続している可能性があります。 別のオプションは、これらのCD 69- CD 103- T細胞が、循環から最近出たばかりの集団に関係し、腎臓の微小環境との相互作用のために、一時的に新しい表現型の形質を獲得しただけである可能性があります。 これらの可能性を解明するには、この集団をさらに調査する必要があります。 さらに。 CD8およびCD4腎臓T細胞はしばしば活発に循環しており、CXCR6をより頻繁に発現していました。 さらに、CD8およびCD4集団は、CXCR3の特に高い発現を置き換え、これらのケモカイン受容体、およびヒト腎臓におけるTRMの発生と持続におけるCXCR6を強く示唆しています。 したがって、人間の腎臓のTpv集団のイメージを向上させるには、さらなる調査が必要です。 それにもかかわらず、ここに提示された発見は、腎臓組織のT細胞集団と健康と病気におけるそれらの役割のより詳細な特徴づけに向けた確かな第一歩を形成します。
