水抽出の影響を受けたタイの絹繭のアミノ酸プロファイルと生物活性化合物の変化パート2
Mar 19, 2022
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2.8。 相関関係
相関分析（ピアソンテスト）を使用して、総フェノール含有量、総フラボノイド含有量、DPPHラジカル捕捉活性、ABTSプラス、FRAPアッセイ、抗- -アミラーゼの値の間で（相関係数rとして）比較を行いました。 、抗- -グルコシダーゼ、およびナンシュー株とエリ株におけるSPEの抗糖化（表5および6）。 この研究から得られた各パラメーターは、TPC、TFC、DPPH、ABTS、FRAP抗- -アミラーゼ、抗- -グルコシダーゼ、および抗糖化反応の間に強い正の相関関係があることを示しました。 これは、絹抽出物に存在する生物活性化合物が、さまざまなフリーラジカルと抗- -アミラーゼ、抗- -グルコシダーゼ、および抗糖化を除去できるためである可能性があります。 私たちの調査結果は、2つの菌株の結果の間に非常に有意な線形相関があることも示しています。 これらの結果は、総フェノール含有量とFRAPアッセイの間に強い正の相関があることを発見したBenzieとStezo[29]の結果と一致していました。 同様の結果は、Kubola [30]によって報告されたように、ゴーヤでそれぞれTPCとDPPH（R 2=0 .711）およびFRAP（R 2=0。948）の間でも見られました。 クマールら[31] ランタナカマラの葉のさまざまな品種の抗酸化活性と総フェノールの評価を実施しました。 抽出物は、フェノール含有量とDPPH、FRAP、およびABTSスカベンジング活性との間に強い相関関係を示しました。 最高の相関（r =0。998、R 2=0。997）は、総フェノール含有量とABTSスカベンジングアッセイの間に見られました。 さらに、Gynura procumbensの葉におけるABTSとTPC（R 2=0。885）およびDPPH（R 2=0。999）の間の正の相関は、Kaewseejanetal。によって報告されています。 [32]。
生物学的特性と阻害活性の間の相関関係は、Quanらの研究で発見されました。[33] C.tramdenum樹皮抽出物の抗酸化および潜在的な糖尿病抑制特性を調査した人。 彼らの結果はまた酸化防止剤アッセイ（DPPH、ABTS、還元力、および一酸化窒素を含む）は、pでの-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ阻害アッセイと強く相関していました。<>
3.材料と方法3.1.SilkCoc00 ns
タイの絹繭のナンシューとエリの菌株を集めた。 Theナンシュー株（黄色い繭）は、タイのブリラム県プッタイソン地区のバーンフアサバンから入手しました。 エリ株（白い繭）は、タイのコンケン県マンチャキリのノンヤプロンコミュニティから来ました。
3.2。 化学薬品および試薬
必須アミノ酸：フェニルアラニン、バリン、トリプトファン, スレオニン, イソロイシン, メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、およびロイシン。 研究された非必須アミノ酸は、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、チロシン、アラニン、およびアスパラギンでした。 抗酸化活性測定試薬は、Sigma-Aldrich Co：Folin-Ciocalteu試薬、2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）、2,4、6-トリピリジル-s-トリアジンから入手しました。 （TPTZ）、2,2'-and-bis（3- thylbenzthiazoline -6-スルホン酸）（ABTS）。HPLC分析で使用した溶媒と試薬はMerck（Darmstadt、Germany）から購入しました。 -アミラーゼ（Aspergillus oryzae由来）、-グルコシダーゼ（Bacillus stearothermophilus由来）、p-ニトロフェニル- - D-グルコピラノシド（PNP-G）、ウシ血清アルブミン（BSA）、およびアジ化ナトリウムはSigma-Aldrichから購入しました。株式会社
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3.3。 蒸留水による抽出
抽出は、Sangwongらの方法を使用して実行されました。 [34]。 絹の繭は細かく切った。 これらの断片の2グラムは、指定された抽出時間の間、100度で200mLの蒸留水で抽出されました。 抽出物を遠心分離機（Universal320 / 320R、Hettich、Boucherville、QC、Canada）により5000×gで10分間遠心分離しました。 抽出物を真空下でワットマンNo.1紙でろ過して不溶性物質を除去し、絹タンパク質抽出物（SPE）を生成しました。
3.4。 タンパク質の測定
タンパク質の測定は、ブラッドフォードアッセイ[35]によって説明されて決定されました。 SPE（0 .5 mL）を1。0 mLのブラッドフォード溶液に加え、室温で5分間インキュベートしました。 ウシ血清アルブミン（BSA）を標準参照タンパク質として使用しました。 サンプルの吸光度は、可視分光光度計（DR 2700rMポータブル分光光度計、Hach、米国コロラド州ラブランド）を使用して595nmで測定しました。
3.5.Amin 0- LCMS/MSによる酸含有量
アミノ酸分析には、LC-MS-MS（Shimadzu LCMS -8030）トリプル四重極質量分析計、エレクトロスプレーイオン化（ESI）モード、続いて島津HPLCシステム（島津、京都、日本）での分析が含まれていました。 （Chumroenphat etal。[36]。 HPLC分析には、0。2 mL/minの流速が含まれていました。 カラムオーブンの温度は38度で、オートサンプラーは4度でした。 移動相は、（A）ギ酸水溶液{{1 0}}。1パーセント（o / o）および（B）メタノール-水（50:50）で調製し、ミキサーはギ酸0.1でした。パーセント（o / v）オートサンプラーニードルは、サンプルの吸引の前後にメタノールでパージされました。 分析は3回行った。
3.6。 総フェノール含有量（TPC）
絹タンパク質抽出物中の総フェノール含有量は、フォリン-チオカルト法[30]に従って分析されました。 簡単に説明すると、0.3mLのSPEを2.25mLの蒸留水に溶解した10％Folin-Ciocalteu試薬と混合しました。 5分間のインキュベーション後、2.25 mLの6％炭酸ナトリウム（NazCO）溶液を添加し、混合物を室温で90分間静置しました。 溶液サンプルの吸光度は、分光光度計を使用して725nmで測定されました。 豆のTPCは、乾燥重量1 gあたりの没食子酸当量（GAE）mg（mg GAE / g DW）として表されました。 分析は3回行った。
3.7。 総フラボノイド含有量（TFC）
SPEの総フラボノイド含有量は、Kubotaおよび[3 0]に従って決定され、修正されました。 簡単に説明すると、0。5mLの各サンプル溶液を2.25mlの蒸留水および0。15mlの5％NaNO溶液（w / v）と混合しました。 溶液を6分間静置した後、0。3 mLの10％AlCl3（w / v）を溶液に添加しました。 5分後、0.1mLの1M NaOH（w /ø）溶液を加え、分光光度計を使用して510nmで吸光度を測定しました。 結果は、乾燥重量1 gあたりのルチン当量（RE）mg（mg RE / g DW）として表されました。
3.8。 DPPHラジカルスカベンジングアクティビティ
SPEの抗酸化活性は、Brand-Williams et al。[37]に従って、安定した1、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）フリーラジカルの除去活性として決定されました。 絹タンパク質抽出物0。1mLを3mlの0。001MDPPHinメタノールに加えました。 混合物を暗所、室温で30分間保持した。 吸光度は、分光光度計を使用して517nmで測定しました。 DPPH阻害の計算式は次のとおりです。
（1）抑制（パーセント）= [（Abs。control- Abs.sample）/Abs。 コントロール]×100）
ここで腹筋。 サンプルはサンプルとAbsの吸光度です。 コントロールは、コントロールの吸光度です。
3.9.ABTSアッセイによる抗酸化活性
ReらのABTSラジカルカチオン法。 （1999）[22]は、フリーラジカル消去効果を評価するために修正されました。 ATBS作業溶液は、7.4 mMABTSと2.6mM過硫酸カリウムを1：1（v / v）の比率で組み合わせ、暗所で室温で12時間反応させた後、脱イオン水で希釈して調製しました。 。 吸光度は、分光光度計を使用して、1.1±0。02に達するまで734 nmで測定しました。次に、150μLのSPEと2850μLのATBS作業溶液を、暗所で2時間混合しながら反応させ、分光光度計を使用した734nmでの吸光度、100％メタノールをコントロールとして使用しました。 抑制を計算するための式は式（1）のとおりでした。
3.10。 鉄還元/抗酸化力アッセイ（FRAP）
抽出物の還元力はFRAPアッセイに基づいていました[23]。 新鮮なFRAP試薬は、1 0 0 mLの酢酸緩衝液（0.3 mol LI、pH 3.6）、10mLの40mmol L -1 HCland10mLの20mmolLに溶解した10mLのTPTZ溶液を混合することによって調製しました。 -1 FeCl; 10∶1∶1の比率で、37度の蒸留水120ml。 簡単に説明すると、60μLのSPEと180uLの脱イオン水を1.8mLのFRAP試薬に添加しました。 ボルテックス混合により溶液を振とうした。 溶液を37度の水浴中で4分間インキュベートした後、対照に対して593nmで吸光度を測定した。 FRAP値は、乾燥ベース1 gあたりのFeSO4のmg（mg FeSO4 / g DW）として表示されました。
3.11。酵素-アミラーゼに対する阻害活性
-アミラーゼ酵素阻害活性は、Xiaoらの方法を使用して測定されました。 （2 0 06）[38]わずかな変更。 基質は、100mgの馬鈴薯澱粉を5mLのリン酸緩衝液（pH 7.0）で5分間煮沸し、次に室温まで冷却することによって調製しました。 SPE（50μL）、基質（300μL）および5ug / mL-アミラーゼ溶液（20μL）を混合し、溶液を37度で15分間インキュベートした。 50μLの1MHClを添加して反応を停止し、次に50μLのヨウ素溶液を添加しました。 マイクロプレートリーダーにより650nmで吸光度を測定した。 アカルボースを陽性対照として使用した。 x-アミラーゼの阻害率は式（1）のように評価されました。
3.12。酵素-グルコシダーゼに対する阻害活性
-グルコシダーゼ酵素阻害アッセイは、Wang and Zhao [39] .SPE（2mLをジメチルスルホキシドに溶解; DMSO）および0 .5 U / mL a-グルコシダーゼ（4 0）の方法に従って実施しました。 mL）を12 0mLの0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.0）に混合しました。 5分間のプレインキュベーション後、5 mMp-ニトロフェニル- -D-グルコピラノシド溶液（40 mL）を添加し、溶液を37度で30分間インキュベートしました。 吸光度は、UV/Vis吸光度分光光度計マイクロプレートリーダーによって405nmで測定されました。 -グルコシダーゼの阻害率は式（1）のように評価した。
3.13。抗AGEs形成活性の評価
絹タンパク質およびその画分のAGEs形成の阻害能力は、VinsonおよびHowardの方法[40]を使用して測定されました。 糖化反応溶液の総量（2.5 mL）は、5 {{1 0}}0μLのSPE、500μLの20 mg / mL BSAをリン酸緩衝液に、500μLの0.5Mグルコースをリン酸緩衝液および0.02パーセント（w / v）アジドナトリウムを含むpH7.4の0.1Mリン酸緩衝液1mL。 この混合物を暗所で37度で5日間インキュベートし、次に形成された蛍光AGEの数を、励起波長330nmおよび発光波長410nmの蛍光分光計を使用して決定しました。 抗AGEs形成のパーセンテージは、次の式を使用して、得られた蛍光強度（FI）に基づいて計算されました：（2）n=[1-（FIsample-FIsample blank）/（control-control blank ）]×100ここで、Flsampleはサンプルの蛍光強度、サンプルブランクはサンプルブランクの蛍光強度、controlはコントロールの蛍光強度、FIcontrolブランクはサンプルコントロールブランクの蛍光強度です。
3.14。 統計分析
すべてのデータは、SPSSソフトウェア（IBM SPSS、シカゴ、イリノイ、米国）によって分析されました。 結果は、3回の反復の平均±標準偏差（SD）として報告され、データは、一元配置分散分析（ANOVA）と最小有意差（LSD）テストを使用して分析され、コントロールとピアソンの相関に対する有意性が決定されました。平均間の相関を評価するためのテスト。 すべての場合において、p<0.05 was="" considered="">
4.結論
絹タンパク質の抽出効果に関する私たちの研究では、100度の蒸留水で6時間抽出しました。 この手順により、タンパク質含有量、アミノ酸、総フェノール含有量（TPC）、総フラボノイド含有量（TFC）、DPPHラジカル除去活性、ABTSラジカル除去能力アッセイ、FRAPアッセイ、抗- -アミラーゼの最高値が得られました。他の抽出時間と比較した場合の抗α-グルコシダーゼ、および抗グリケーション。 さらに、Nangsew株のSPEは、Eri株の抽出物と比較した場合、これらすべての栄養的に有益な物質の含有量が高くなりました。 この結果は、繭処理中に抽出されたセリシンに基づいて機能性食品の天然添加物を開発するという現在進行中の計画では、ナンシューが好ましい菌株であり、機能性飲料の製造における代替手段の機会を提供することを示唆しています。
著者の貢献：概念化、CBおよびSS; 方法論、CBおよびSS; 検証、CBおよびSS; 正式な分析、CBおよびSS; 調査、CBおよびSS; 執筆—オリジナルドラフト準備、CBおよびSS; 執筆—レビューと編集、CBとSS; 視覚化、CBandS.S。 すべての著者は、出版された原稿を読み、同意しました。
資金：この研究は、Thailand Science Research and Innovation（TSRI）とSiam Natural Products Co.、Ltdによって資金提供されました。
倫理委員会の声明：適用できない。
インフォームドコンセント声明：適用できない。 データ可用性ステートメント：該当なし。
謝辞：協力と科学的援助のためのマハサラカム大学の実験装置センター。 英語の校正をしてくれたオーストラリアのクイーンズランド大学のColinWrigleyにも感謝します。
利害の対立：著者は、利害の衝突はないと宣言します。
この記事は、Molecules 2021、26、2033から抽出されています。https：//doi.org/10.3390/molecules26072033 https://www.mdpi.com/journal/molecules
