中枢神経系における神経変性疾患および急性神経障害におけるシャペロン媒介オートファジー パート 2
Aug 05, 2024
4. CMA 活性を評価するための実験研究ツール
このセクションでは、CMA 活性を in vitro および in vivo でアッセイするために利用できる実験研究ツールについて説明します。 CMA 活性および CMA 機能アッセイに関連する情報を取得するために一般的に使用される方法。
CMA（Certified Management Accountant）は、管理会計分野における十分な業務スキルと専門的知識を有する者を認定することを目的とした管理会計士の専門資格です。人間の脳の能力である記憶とは、情報、知識、経験を記憶する能力を指します。
CMA とメモリの間には特定の関係があります。まず第一に、CMA 試験では、受験者は多数の知識ポイントと概念を覚える必要があり、同時にこれらの知識ポイントを適用するスキルを習得する必要があります。したがって、優れた記憶力は、CMA 試験で良い結果を達成するために非常に重要な役割を果たします。
次に、学習と練習を通じて記憶力を向上させることができ、CMA 試験の勉強にも役立ちます。たとえば、ナレッジ ポイントを繰り返し確認し、さまざまな方法で情報を学習して記憶し、記憶テクニックを使用することで、記憶力を向上させ、受験者が CMA 試験に必要なナレッジ ポイントとスキルをよりよく習得できるようにすることができます。
最後に、CMA の学習は単なる試験ではなく、専門的な品質の向上にもつながります。キャリア開発において、専門的能力をより発揮したい場合、仕事のタスクをより適切に完了するためには、当然のことながら、一定の記憶力が必要です。
つまり、CMA と記憶の間には密接な関係があります。記憶力を向上させようとすることは、良い成績を得るのに役立つだけでなく、仕事のタスクをより適切に完了し、キャリアが発展するにつれて自分の個人的な価値やキャリア上の成果を実現するのにも役立ちます。私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサには抗酸化作用、抗炎症作用、および老化防止効果があり、脳の酸化と炎症を軽減し、それによって健康を守ることができるため、記憶力を大幅に向上させることができます。神経系。さらに、カンクサは神経細胞の成長と修復を促進し、それによって神経ネットワークの接続と機能を強化します。これらの効果は、記憶力、学習能力、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発生を防ぐこともできます。
4.1. CMA アクティビティのモニタリングに役立つ分析
CMA の主要な分子成分の量の変化を評価することは、CMA 活性を評価する間接的な方法として使用できます [46]。さらに、CMA 活性リソソームの数と分布を分析して、CMA 活性の変化を推測することもできます [46]。
ただし、これらの分析は CMA ステータスと相関するデータのみを提供します。したがって、これらの分析は機能アッセイで補完する必要があります [47]。CMA の主要成分の変化を評価するためのイムノブロッティングとイメージングは、CMA 活性を評価するために最も一般的に使用される方法です。
CMA では LAMP2A のリソソームレベルが制限されているため [48]、リソソーム内の LAMP2A タンパク質の存在量の変化は通常、CMA の活性と相関します。したがって、画像評価では、リソソーム膜における LAMP2A の存在を分析する必要があります [47]。
リソソームが豊富な画分または少なくとも膜細胞画分を使用した LAMP2A の免疫ブロッティングは、全細胞溶解物を使用したものよりも有益です [46]。リソソーム hsc70 のレベルも CMA 活性に関連しています [49]。
しかし、hsc70 は最も豊富な細胞シャペロンの 1 つであり、リソソームに存在する割合は少量です。したがって、全細胞溶解物中の hsc70 のイムノブロッティングは CMA については有益ではありません [46]。 hsc70 とリソソームマーカー (LAMP1 など) の共局在は、CMA 活性リソソームの検出に使用できます [49]。
CMAが活性化されると、リソソームプール全体に比例してhsc70と共局在するこれらのリソソームの数が増加します[12]。さらに、hsc70 の免疫金染色を使用した電子顕微鏡分析からも、CMA 活性リソソームのプールに関する情報が得られます [49]。
細胞または組織から単離されたリソソームを使用した分析では、よく知られている CMA 基質 (GAPDH など) のレベルの増加は CMA の活性の低下を示す可能性があります [46]。
一般に、CMA 基質は転座後に急速に分解されます [6]。したがって、リソソームプロテアーゼの阻害剤（すなわち、ロイペプチン）で処理または未処理のモデル間の細胞または動物のCMA基質のリソソームレベルの比較により、CMA値のフラックスの測定が可能になります[24]。
4.2.機能アッセイ
いくつかの機能アッセイにより、細胞、組織、および単離された細胞小器官における CMA 活性を経時的に追跡することができます。
4.2.1.細胞内タンパク質分解の評価
総サイトゾルタンパク質の約 30% が CMA によって分解される可能性があります [9]。ただし、CMA によって分解されるサイトゾルタンパク質の実際の割合は、細胞の種類と細胞の状態によって異なります [6]。
したがって、CMA による分解を受ける細胞タンパク質のプールの測定は、CMA 経路の全体的な活性を決定するための一般的な方法です [46]。
放射性標識アミノ酸とリソソームプロテアーゼまたは他のオートファジー経路の阻害剤を使用したパルスアンドチェイス実験は、CMA分解を受けているタンパク質を他の経路によって管理されるタンパク質から区別するために使用できます[50]。
4.2.2.フォトコンバーチブル CMA レポーター
さらに、人工蛍光CMAレポーターのリソソーム会合をモニタリングする方法も、CMAを介した基質送達と分解を追跡するのに役立つであろう[51]。
光変換可能な蛍光レポーター[51]を使用すると、光変換されたタンパク質とリソソームの結合を異なる蛍光チャネルで追跡することが可能です。細胞あたりの蛍光点の数の増加は、CMA 活性化の良い指標となるでしょう [46]。
4.2.3.単離されたリソソームを使用した CMA の in vitro 分析
異なるオートファジー経路間のクロストークにより、無傷の細胞における CMA 活性を正確に評価することが困難になります [41]。したがって、CMA経路の動的分解プロセスに関与するすべての機能ステップを個別に分析する必要があります[46、49]。
CMA 活性を分析するための最も信頼できるアプローチは、単離されたリソソームを使用した CMA の in vitro 再構成によって得られます [52]。CMA で活性なリソソームの特定の画分の単離により、CMA コンパートメント内の内因性 CMA 基質の含有量の分析が可能になります [47]。
単離されたリソソームは、CMA プロセス - 基質結合、リソソーム取り込み、およびリソソーム分解に関与するステップをたどるための、in vitro での CMA の再構成も可能にします [50]。
リソソームプロテアーゼ阻害剤による処理とそれに続く CMA 基質とのインキュベーションにより、基質に結合したものとリソソームへの移動（結合と取り込み）の測定が可能になります [39]。
タンパク質分解が妨げられなかったリソソームに結合した基質の量を割り引くことによって、取り込みを計算することが可能となる[39,53]。
単離されたリソソーム画分により、リソソーム膜での CMA 成分の内容、翻訳後修飾、組織化の変化を直接比較することもできます。単離されたリソソームにおけるリソソーム LAMP2A または lys-hsc70 レベルの低下は CMA 活性の低下を示します [54,55]、LAMP2A レベルの増加は CMA 活性の上方制御を示唆します [56]。
さらに、特定の時点で多量体複合体に組み立てられたリソソーム LAMP2A の比率は、単離されたリソソームのブルーネイティブ電気泳動と LAMP-2A の免疫ブロットを使用して決定できます [57]。
5. 神経変性疾患とCMA
ニューロンは有糸分裂後の細胞であり、ストレス条件下で細胞の恒常性を維持するために効率的なタンパク質分解機構を必要とします[58,59]。 CNSにおけるタンパク質分解プロセスの障害は、異常または損傷したタンパク質の凝集を引き起こします。これは、多くの神経変性疾患の明確な特徴です。
CMA の機能不全が、CNS に影響を与えるさまざまな神経変性疾患のさまざまな病態に関連しているという実質的な証拠が収集されています [1、14]。
これらの疾患では、PD の -シヌクレイン [60]、AD のタウタンパク質 [61]、HD のハンチンチン (Htt) [62,63]、TDP{{5} など、さまざまな病原性タンパク質が CMA の基質として同定されています。 } ALS および FTLD では [64,65]。
5.1.パーキンソン病
PD は最も一般的な神経変性疾患の 1 つです。 PD の主な病理学的特徴は、黒質内のドーパミン作動性ニューロンの漸進的な喪失と、レビー小体におけるタンパク質 - シヌクレインの凝集である。
多くの研究により、CMA の障害が PD の主な病因に関連していることが示されています [4,66]。 PD患者では、脳内のLAMP2Aタンパク質のレベルが低下し、CMA活性が減弱していることが示されている[67,68]。
これまでの多くの研究は、CMA分解経路の阻害によりα-シヌクレインの蓄積が引き起こされ、これがドーパミン作動性ニューロンの漸進的な喪失に関連していることを示唆している[8]。
重要なことは、家族性PDで同定されたβ-シヌクレインの変異型A53TおよびA30PはCMAによって分解できないことである。さらに、これらの変異型はリソソーム膜で LAMP2A に強く結合し、その結果、インビトロで他の CMA 基質の正常な分解を阻害します [60,69]。ロイシンリッチリピートキナーゼ 2 タンパク質 (LRRK2) の G2019S 変異は、家族性 PD の病理学的原因である可能性があります。 [70]。
G2019S 変異体は、リソソーム膜での CMA 転座複合体の動的集合を阻害し、PD のマウスモデルおよび変異体 LRRK2 PD 患者の脳において CMA の機能不全を引き起こす [25]。さらに、LRRK2 の病原性変異型はサイトゾル Hsc70 に結合し、CMA 成分と異常に相互作用して、他の CMA 基質の分解と in vitro での神経タンパク質恒常性をブロックします [25,71]。
ユビキチン C 末端加水分解酵素 L1 (UCH-L1) は、LAMP-2A、Hsc70、および Hsp90 と物理的に相互作用し、CMA 経路の制御機構に関与しています [72]。以前の研究では、I93M 変異体フォームのUCH-L1は単一のPDファミリーで同定された[73]。
UCH-L1 の I93M 変異が LAMP2A のサイトゾル領域との相互作用を異常に強化し、in vitro で CMA 経路を阻害することも報告されている [74]。さらに、哺乳動物細胞内での UCH-L1 の I93M 変異型の発現は、CMA 阻害に関連したシヌクレイン量の増加を誘導しました [74]。
これらの発見は、UCH-L1 の I93M 変異型と CMA 機構との異常な相互作用が、-シヌクレインの凝集に関連する PD の病因の根底にある可能性を示唆しています。DJ-1 としても知られるパーキンソン病タンパク質 7 (PARK7) は、酸化耐性を含むさまざまな細胞活動に関与する多機能タンパク質 [75]。
PARK7/DJ-1はミトコンドリアの恒常性の維持に重要な役割を果たしています[75]。 DJ-1 遺伝子の変異が常染色体劣性型および初期型の PD を媒介することが報告されています [76]。DJ-1 欠損はリソソーム内の LAMP2A の分解を加速し、-シヌクレインの凝集を引き起こします [77] ]。
対照的に、DJ-1 は、CMA を制御することで -シヌクレインの蓄積を阻害することができました [78]。全体として、CMA の機能不全を引き起こすさまざまな分子機構が PD の病因の根底にあると考えられています。
しかし、CMA に関連する病理学的メカニズムはほとんど不明のままです。 CMAプロセスとPDの実際の病態との関係を明らかにするには、さらなる研究が必要である。
5.2.アルツハイマー病
AD は高齢者に最も一般的な神経変性疾患です。 AD の主な病因は、タンパク質の恒常性の障害によって引き起こされるアミロイド斑の形成とタウの凝集です。 AD に関連するいくつかのタンパク質が CMA 基質として同定されている。これらのタンパク質基質の CMA 分解は、AD 患者では損なわれていることが示されている [45、61、79]。
アミロイドオリゴマーの進行性の蓄積は、AD における中枢毒性事象である [80,81]。最近の研究では、複数の KFERQ モチーフでアミロイド オリゴマーをタグ付けすると、エンドソームとリソソームへの侵入が促進され、ヒト初代培養皮質ニューロンが神経毒性から保護されることが示されました [82]。アミロイド前駆体タンパク質 (APP) は、加工されて生成する可能性があるため、アルツハイマー病における重要な病原性分子です。アミロイド-[83]。
APP はその C 末端に KFERQ 様モチーフを含みます。このモチーフは、APP-C 末端フラグメントの蓄積を防ぐための APP の正常なプロセシングと分解にとって重要です [84]。最近の研究では、APP が Hsc70 に結合する CMA 基質であることが明らかになりました [85]。
APP の CMA 分解を阻害すると、APP の細胞毒性が強化されます。さらに、Hsc70 の過剰発現またはメトホルミンによる CMA の活性化は、AD マウスモデルにおける脳の蓄積アミロイド斑レベルを低下させ、分子的および行動的 AD 表現型を逆転させました [85]。タウは、通常、神経細胞の微小管を安定化するサイトゾルタンパク質です。
タウタンパク質は CMA を標的とするモチーフを持ち、CMA 経路によって分解される可能性があります [79]。タウの過剰リン酸化と神経原線維変化の形成を引き起こす変異タウタンパク質の凝集は、AD および関連するタウオパチーの特徴である [86,87]。
さらに、変異タウタンパク質はLAMP2Aと異常に相互作用し、リソソーム内腔への移行を阻害し、CMA活性を損なう可能性がある[79]。カルシニューリン 1 の調節因子 (RCAN1) は CMA の基質であり [45]、AD 患者では上昇しています [88]。
RCAN1 は、カルシニューリン依存性のタウタンパク質の脱リン酸化の阻害剤です。重要なことは、CMA 活性は RCAN1 のレベルを増加させることで阻害でき、それによって CMA の他の基質の分解が損なわれることです [45]。
5.3.ハンチントン病
HD は、制御不能な運動、認知症、情緒障害を特徴とする遅発性神経変性疾患です。 HD は、線条体および皮質ニューロンにおける変異型 Htt タンパク質の蓄積と凝集によって引き起こされる優性遺伝性疾患です。
Htt には、異常に拡張した N 末端ポリグルタミン (polyQ) トラクトが含まれています [62、63、89]。Htt 分解の機能不全が HD の主な病因として示唆されています。
これまでの研究では、CMA が HD の細胞モデルおよびマウスモデルにおける変異体 Htt の分解に関与していることが示されています [62]。 Htt は推定上の KFERQ モチーフを保持しており、CMA、Hsc70、および LAMP2A の重要な構成要素と相互作用します。さらに、polyQ トラクトの拡張を伴う変異体 Htt は、in vitro で CMA による取り込み障害を示します [89]。
CMAだけでなくマクロオートファジーもHttの分解に関与している[90]。 Htt は、分解プロセスにおいて LAMP2A とマクロオートファジー関連タンパク質 Atg7 の両方に結合できます [89、91、92]。
CMA 活性は、HD の細胞モデルおよび動物モデルにおいて疾患の初期段階で上方制御されていると報告されています。しかし、CMAの活性は疾患の後期段階では低下します[91]。これらの発見は、CMA活性の早期増加がマクロオートファジーの非効率性に応答した代償的な調節である可能性を示唆しています。リソソーム LAMP2A レベルの低下は、HD の後期段階で CMA 機能の喪失があることを示しています [91]。
5.4.筋萎縮性側索硬化症と前頭側頭葉変性症
ALS と FTLD は、多くの同様の臨床的および病理学的特徴を持つ神経変性疾患です [93]。トランス活性化応答 DNA 結合タンパク質 43 kDa (TDP-43) は、RNA 代謝の多くの側面を制御するリボ核タンパク質です。
神経細胞におけるTDP-43 C末端フラグメントの蓄積は、ALSおよびFTLD患者で頻繁に検出されます[65]。したがって、TDP-43 の蓄積はこれらの疾患の特徴であると広く考えられています。
TDP-43 タンパク質は、Hsc70 に結合する KFERQ 様モチーフを含み、CMA プロセスによって分解される可能性があります [94,95]。 Hsc70 発現は散発性 ALS 患者のリンパ単球で減少し、TDP-43 の蓄積に寄与していると報告されています [64]。
TDP-43のKFERQ様モチーフの変異はCMAを介した分解を妨害し、培養細胞におけるTDP-43の蓄積とCMAの阻害を誘導する可能性がある[94]。 CMA は、TDP の生理学的および病理学的形態の代謝回転を制御するのに役立ちます-43 [94]。
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