選択されたフラボノイドのCYP3A4酵素阻害の可能性の特性評価パート2
Apr 27, 2022
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2.3。 疑似不可逆的阻害アッセイ
疑似不可逆阻害アッセイでは、サンプルをフラボノイドとインキュベートし、酸化剤で処理した後、透析を行いました。 疑似不可逆的阻害の場合、酵素活性を回復させる必要があります。 試験したすべてのフラボノイドとのインキュベーションでは、酸化剤による処理の有無にかかわらず、透析後の酵素活性の有意な阻害がありました（図4）。 すべての場合において、フラボノイドサンプルとヘキサシアノ鉄酸カリウムサンプル間の残留酵素活性の差は統計的に有意ではありませんでした（p<>
以前の実験と同様に、クリシンを阻害剤として使用した場合に、酵素活性の最大の低下が観察されました。 クリシンによるインキュベーションおよび透析後の酵素の残留活性は0.57％であり、ヘキサシアノ鉄酸カリウムによる前処理によるインキュベーションおよび透析後は1.31％でした（図4）。
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直接（可逆）阻害の場合、このタイプの実験は、透析後の酵素活性の回復を示します。 疑似不可逆的阻害の場合、酵素活性は、酸化剤および透析による治療後に回復するであろう。 これらは分析されたフラボノイドのいずれにも当てはまらなかったため、すべてのフラボノイドがシトクロムP450 3A4の不可逆的阻害を示すと結論付けることができます。
3.ディスカッション
一部のフラボノイドは、シトクロムP450酵素の活性を阻害する可能性があることが示されています。 Saric-Mustapicetal。 [28]およびKondzaetal。 [29]は、アカセチン、アピゲニン、クリシン、およびピノセムブリンが、マーカー基質としてテストステロンを使用したアッセイでCYP3A4酵素を阻害することを示しました。 CYP3A4酵素は、基質を異なる方法で収容できる大きな活性部位を持っているため、ニフェジピンやミダゾラムなどの別のマーカー基質を使用して活性アッセイを実施することをお勧めします[30]。 したがって、CYP3A4活性のマーカー反応としてニフェジピン酸化を使用し、不活化速度パラメーターを決定しました。 マーカー基質としてニフェジピンを使用して得られた阻害効果の値は、アピゲニン、アカセチン、およびピノセムブリンのテストステロンアッセイと比較した場合、同じ桁数です。 クリシンのみが、ニフェジピンアッセイと比較した場合、テストステロン[29]で4倍高い値を示しました。つまり、0.108分-1uM-1対0.029分-IμM-1です。 不活化速度論で観察された類似性は、ニフェジピンとテストステロンが重複する異なる結合部位を持っていることを確認する文献データと一致しています[31]。 シトクロムP4503A4は、最大の活性部位の1つを持ち、基質と阻害剤を同時に収容できます。一方が他方の結合に影響を与えるため、ニフェジピンとテストステロンのアッセイで観察された違いを説明できます。
阻害剤が治療を中止した場合、可逆的阻害剤の臨床的影響（すなわち、食品と薬物の相互作用）を回避することができます。 より重要な相互作用は不可逆的な相互作用ですが、阻害剤の使用を単に中止しても相互作用の問題は解決されません。 この研究では、クリシンは最高の阻害能を示し、IC50とKは最低でした。 値。 シトクロムP450 3A4に結合するフラボノイドの分子ドッキング研究は、酵素の活性中心にある鉄にB環をさらすことにより、クリシンの結合親和性が高いことを示しています[28]。 構造阻害関係の研究は、ヒドロキシルA環の基は、おそらくイオン-イオン相互作用による抑制効果に寄与しますが、B環は、抑制効果を観察するために非置換（ピノセムブリン、クリシン）または一置換（アカセチン、アピゲニン）にすることができます（図1）。 [28]。 非置換フラボノイド（ピノセムブリン、クリシン）は、CYP3A4を不活性化する反応性中間体のエポキシ化と生成の影響を受けやすくなっています。 クリシンで観察されたより強い阻害効果は、おそらくピノセムブリンと比較した場合の構造の剛性とC2=C3二重結合の存在によるものです。
これらの記載された酵素反応速度論の重要性は、クリシン（20-100μM）の投与がラットのニトロフラントインのAUCおよびピーク血清濃度（Cmax）を有意に増加させた食物-薬物相互作用の文脈で観察することができます[32]。 。ニクジュヨウ、たとえば、CYP3A4 / 5酵素の比較的弱いメカニズムベースの阻害剤であるエリスロマイシン[33]は、健康なボランティアでセリバスタチンと中程度の相互作用を引き起こすことが報告されています（セリバスタチンのAUCが21％増加）[34]。 クリシンはまた、他の薬との重要な相互作用のために中止された降圧薬であるミベフラジルよりも大きな阻害の可能性を持っています。 この研究の結果は、クリシンが強力な阻害剤であり、他の使用済み薬剤と相互作用する可能性があることを示唆しています。ニクジュヨウこれらの薬のAUCとCmaxを変更します。 クリシンはプロポリス（28 g / L）に豊富に含まれており、蜂蜜の5.3 mg/kgの3番目の主要なフラボノイドです[35]。 したがって、これらの食品が豊富な食事は、CYP3A4基質である医薬品と相互作用する可能性があります。
CYP3A4酵素の証明された不可逆的阻害剤であるピノセムブリンは最低のkを示しました。 0。04±0。01分-1のmg値。 その不活化効果はアカセチンとアピゲニンのそれと同様でした（0.01分-1μM-1）。 ピノセムブリンは主に蜂蜜や飲料（お茶や赤ワイン）などの食品に含まれており、このフラボノイドの豊富な供給源となっています[29]。 これらの速度論的パラメーターによると、CYP3A4基質として作用する薬剤と一緒にこれらのピノセムブリン源を消費する際には注意が必要です。
アカセチンはクリシンの3倍のIC50値と5倍のKを示しました。 他のフラボノイドと同様の影響値を維持しながら、より低い抑制効果を示します。 アカセチンは主にTurneradiffusa、Robinia pseudoacacia、Betula pendula [36]などの植物種に見られますが、特定の食品もこのフラボノイドの供給源です。 たとえば、キンカンジュースはアカセチンの豊富な供給源であり、アカセチンは0.1 mg /100gのフレッシュジュースの濃度で見つけることができます[37]。 アカセチンの親化合物であるアピゲニンは、最高のIC50値と最高のKを示しました。 テストされた4つのフラボノイドの中での値。 アピゲニンとパクリタキセルの併用治療がパクリタキセルの経口バイオアベイラビリティの増加をもたらしたとき、アピゲニンの阻害能力がインビボで確認されました。これは主に、P糖タンパク質の阻害による消化管での吸収の増強および初回通過の減少に起因しました。小腸および/または肝臓におけるCYP3Aサブファミリーのアピゲニンによる阻害を介したパクリタキセルの代謝[38]。 アピゲニンは、セロリ、パセリ、カモミールの主要なフラボノイドです。 乾燥パセリは、45035ug/gで最大量のアピゲニンを持っていると報告されています。 アピゲニンの追加の供給源は、3000〜5000 ug/gを含むカモミールのドライフラワーや786.5ug/gを含むセロリの種子などのハーブに含まれています[39]。
シトクロムP450 3A4の可逆的阻害は、シトクロムP450触媒サイクルの最初のステップに関連しています（図5）。 ほとんどの場合、活性部位（第二鉄）への結合における基質と阻害剤の間の競合が観察されます。 その場合、CYP3A4は複数の基質/阻害剤を収容できる大きな活性部位を持っているため、結合実験（酵素滴定）を実施し、複数の基質でテストすることをお勧めします[26,30。 この研究では、基質としてニフェジピンを使用しました。阻害効率の結果は、マーカー基質としてテストステロンを使用して実施された以前に報告されたアッセイと同等の大きさでした（表1）。
図5.シトクロムP450の触媒サイクルは9つのステップで構成されています。 最初のステップは、基質の結合と可逆的阻害剤との相互作用のポイントを表しています。 2番目のステップでは、ヘム鉄が鉄の形に還元され、疑似不可逆阻害剤が結合します。cistanche効果不可逆的な阻害が観察された場合、それは通常、基質（ステップ7で形成された）および/または生成物（ステップ8で形成された）のラジカル形態に関連しています。 無駄なシトクロムP450サイクル（ステップ3aおよび5a）で形成された活性酸素種は、酵素破壊を引き起こす可能性があります。これは、SODおよびCATの添加によって防ぐことができます。 抑制に関係のないステップの説明は省略されています。 参考文献[26]に従って作成。
しかし、以前に[28,29]を示し、実施した実験でここで確認したように、研究されたすべてのフラボノイドは不可逆的な阻害を示します。 不可逆的阻害のタイプ（ヘムまたはアポタンパク質への中間体の疑似不可逆的または共有結合）に関係なく、マーカー基質の添加前にプレインキュベーションを行うと、阻害が最も顕著になります[26]。 プレインキュベーションでは、補酵素（NADPH）を生成するための生成システムを追加することで触媒サイクルが活性化され、酵素の不活性化を観察するのに十分な時間が与えられます。 したがって、すべての不可逆的なタイプの阻害には、酵素を鉄の形に還元する必要があります（図5）。
シトクロムP450はヘムタンパク質であるため、フラボノイドの鉄型の活性部位への結合と、反応性中間体の可能性のあるヘムへの結合を研究しました[26]。 ヘム付加物形成の可能性を評価するために、ヘモクロモピリジンアッセイを実施しました。 テストされたすべてフラボノイド両方のアッセイでヘム濃度が50パーセント以上大幅に減少しました。 クリシンもまた最も強力な阻害剤であり、この研究で観察された阻害動態値と一致していました。 ピノセムブリンのヘム濃度は5倍高く、アピゲニンの場合はクリシンの場合のほぼ10倍でした（それぞれ25.3±0.4％と45.1±1.7％）。 ヘム濃度のこの減少は、研究されたフラボノイドによるCYP3A4の不可逆的阻害が、ヘムへの反応性中間体の共有結合に起因する可能性があることを示しています。 ヘムは活性酸素種によって破壊され、ヘモクロモピリジンアッセイの結果を低下させる可能性があることに注意する必要があります。 この可能性を排除するために、SODおよびCATの存在下でインキュベーションを実施し（表2）、前述の結論を確認しました。
シトクロムP450酵素の触媒サイクルの最初のステップは、基質が第二鉄イオンに結合することです。 阻害剤が基質に対して競合的阻害を示す場合、阻害剤の除去により酵素活性の完全な回復が可能になるため、酵素活性は透析によって回復することができます[26]。 ただし、阻害剤が第一鉄に結合する場合は、酵素活性を回復するために、透析の前にPCFなどの酸化剤を使用する必要があります。 酵素活性が回復した場合、阻害は疑似不可逆的として特徴付けられます[26]。 PCFの有無にかかわらず、透析後に酵素活性を回復できなかったため、テストしたフラボノイド（25 uM濃度）はいずれもCYP3A4酵素の可逆的または疑似不可逆的阻害剤として機能しません。 これはまた、ヘムまたはアポタンパク質のいずれかに共有結合することによる不可逆的な阻害が、酵素の不活性化の考えられる原因であることを確認します。
クリシンは、インキュベーション中にヘムのほぼ完全な減少を引き起こしたことに注意する必要があります。SODとCATを使用しない場合は97.1％、使用する場合は94.5％です（表2）。 一方、同様の条件下での残留酵素活性の結果は、酵素活性が約99％低下することを示しました（図4）。 ヘムクロモピリジンアッセイは、インキュベーション中のすべてのソース、すなわちシトクロムP450、およびシトクロムbからのヘムを登録します。 クリシンの結果は、シトクロムP450によって生成された反応性中間体が、シトクロムP450およびシトクロムb5のヘムと反応したことを示しています。
さらにLC-MS分析を実施して、ヘム付加物の形で、またはラジカルスカベンジャーとしてグルタチオンを使用してトラップされた可能性のある反応性フラボノイド中間体を決定しました（データは示していません）。 しかし、おそらく反応性フラボノイド中間体および/またはヘム/グルタチオン付加物の不安定性のために、予測された付加物のいずれも分離できませんでした。 同様の行動は、薬物/薬物相互作用のために市場から撤退した降圧薬であるミベフラジルでも観察されました。 ミベフラジルはヘムの還元を引き起こしましたが、反応性中間体は確立されませんでした[40]。
4.材料と方法
4.1。材料
この研究では、4つのフラボノイド（アカセチン、アピゲニン、クリシン、およびピノセムブリン）を使用しました（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）。 常染色体でニコチンアミド-アデニン-ジヌクレオチドリン酸（NADPH）レダクターゼおよびシトクロムbsと共発現する組換えシトクロムP 450 3 A4は、Thermo Fisher Scientific（米国、マサチューセッツ州ウォルサム）から購入しました。
シトクロムP450一酸化炭素アッセイ[41]に基づいて、製造業者によって宣言されたCYP3A4酵素の含有量は1μuMであることが確認されました。 グルコース-6-リン酸（G6P）、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）、および-ニコチンアミド-ジヌクレオチドリン酸二ナトリウム塩（NADP plus）はSigma-Aldrichから購入しました。 リン酸カリウム（pa）とジクロロメタン（pa）はKemika dd（ザグレブ、クロアチア）から購入し、ギ酸（85％、pa）はSemikem doo（サラエボ、ボスニア、ヘルツェゴビナ）から購入し、メタノールは試薬の溶解とクロマトグラフィーに使用しました。 Merck KGaA（ダルムシュタット、ドイツ）。 インキュベーション混合物とクロマトグラフィーには超純水を使用しました。 リン酸二水素カリウム（Kemika dd）を使用して、リン酸カリウム緩衝液pH7.85を調製しました。 Semikem dooニフェジピン（Sigma-Aldrich）から購入した水酸化ナトリウムを使用してpHを調整し、酸化ニフェジピン（欧州薬局方、薬局方、第10版、ストラスブール、フランス）を残留酵素活性の研究に使用しました。不活化の動力学。 テストステロン（Sigma-Aldrich）および6 -ヒドロキシテストステロン（Cayman Europe、Tallinn、Estonia）を、疑似不可逆的阻害のアッセイに使用しました。 トロレアンドマイシンとジルチアゼムは、Agency for Medicinal Products and Medical Devices（ザグレブ、クロアチア）から入手しました。 ピリジン（pa）（Semikem doo）、ウシヘミン（Sigma-Aldrich）、およびジメチルスルホキシド（Semikem doo）をヘモクロモピリジンアッセイで使用しました。 カリウムヘキサシアノ鉄酸塩（Siegfried AG、Zofingen、Switzerland）は、可逆的および疑似可逆的阻害の研究に使用されました。 スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）（Sigma-Aldrich）、カタラーゼ（CAT）（Sigma-Aldrich）、および塩酸（36％、pa）（Semikem doo）を結合特異性アッセイに使用しました。 酵素のインキュベーションは、ウォーターバス（Inkolab、ザグレブ、クロアチア）で行いました。 残留酵素活性とフラボノイド不活性化動態のアッセイは、UV-Vis検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（HPLC UV-Vis、Agi-lent 1100、Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ、米国）を使用して実施しました。 プログラムR（統計計算のためのRプロジェクト、ウィーン、オーストリア）およびMicrosoft Excel（マイクロソフト、レドモンド、ワシントン州、米国）を使用して、残留活性の計算および阻害動態パラメーターを作成しました。
4.2。方法
4.2.1。 酵素反応速度論と残留活性の測定
酵素のインキュベーションは、37度の水浴中で機械的に攪拌しながら、3回行った。 最終濃度が1μMのフラボノイドのアリコートをメタノールに溶解し、ガラス管に移し、蒸発乾固させました。ただし、阻害剤（フラボノイド）を含まないコントロールサンプルを除きます。 溶媒を蒸発させた後、5pmol CYP3A4酵素、5 0 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）からなる100μLの容量になるようにインキュベーション混合物を調製しました。 、および超純水。 0.1 M G6P：10 mg / mL NADPと：1000 IU / mL G6PDH =50：25：1（v / v / v）で構成されるNADPH生成システムを使用直前に準備しました。 この生成システムには、NADPをNADPHに再生するグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼが含まれており、インキュベーション中にシトクロムP450補酵素（NADPH）の濃度を一定に保ちます。 生成システムの追加（最終インキュベーションでの体積の15％、v / v）が反応を開始しました。 ニフェジピンを使用して、200μMの最終濃度で残留酵素活性をテストしました。 ジクロロメタン中のギ酸の氷冷1パーセント溶液1mLを使用して反応を停止させた。 サンプルを混合し、1900g（Rotofix32、Westfalia、Germany）で10分間遠心分離しました。 遠心分離後、2つの層（水と有機層）が形成されました。850μLの有機層をキュベットに移して蒸発させた後、分析対象物を30μLのメタノールに溶解しました。AgilentZorbaxSB C18カラム（4.6×250 mm、 3μm、Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA）を使用して、HPLCでサンプルを分析しました。移動相は、64：36の比率のメタノールと水で構成されました。分析はアイソクラティックでした。フローは1.0に設定されました。 mLmin-。注入量を10μLに設定しました。マーカー基板としてニフェジピンを使用しました。観察された反応はニフェジピンの酸化でした。クロマトグラムは254nmで記録しました。分析時間は25分に設定しました。保持ニフェジピンの時間は7.1分、酸化ニフェジピンの時間は10.8分です[42]。どちらの場合も、得られた生成物の量は、コントロールサンプルと比較した曲線下面積（AUC）の量として観察されました。すべてのフラボノイドについて、最大阻害濃度の半分（ICs0）、定数 阻害（K;）、不活性化速度の定数（Kinect）、および不活性化効果（impact / K;）を決定しました。 トロレアンドマイシンを陽性対照として使用した--シトクロムPの不可逆的阻害剤450 3A4.25μM濃度のトロレアンドマイシンは酵素活性を35±5パーセントに低下させた。
4.2.2。 ヘモクロモピリジンアッセイ
ヘムクロモピリジンアッセイは、シトクロムP45 0サイクルの反応性中間体によるヘム破壊の可能性を評価するために使用され、Flink andWatson[43]およびPauletal。[44]によって記述された方法に従って実行されました。いくつかの変更。 ジメチルスルホキシド（0。6〜 0。1μM）に溶解したヘミンを使用して検量線を作成しました。スペクトルは5 0 0〜600nmの波長で記録しました。 25μMの阻害剤（フラボノイド）を200μLの容量に調製しました。NADPH生成システム（組成についてはセクション4.2.1を参照）を追加して反応を開始し、インキュベーションを30分間継続しました。その後、反応を停止しました。ピリジン（最終濃度0.83 M）と水酸化ナトリウム（最終濃度0.06 M）を添加して30分。サンプルを分光光度計（UV -1280、島津株式会社、京都、日本）で1分以内に記録しました。塩基性条件下でのピリジンヘモクロモゲンの不安定性によるアルカリ溶液の添加[44]。サンプル中のヘミン濃度は、作成された検量線に基づいて計算されました。このアッセイは3回実行されました。インキュベーションは、カタラーゼとスーパーオキシドを使用して繰り返されました。のジスムターゼ（各5 IU） 無駄な触媒サイクルによる過酸化水素の生成を防ぐためのインキュベーション混合物。
4.2.3。 疑似不可逆的阻害アッセイ
このエッセイの目的は、酸化剤の添加の有無にかかわらず、透析後の酵素活性の回復を評価することにより、第一鉄（Fe-）との共有結合複合体の形成をテストすることです。 フラボノイドごとに3種類の実験を行いました。フラボノイドを含まないインキュベーション混合物（コントロール）、フラボノイドを含むインキュベーション混合物、およびインキュベーション後に酸化剤を添加したフラボノイドを含むインキュベーション混合物です。 阻害剤との各インキュベーションは、上記と同じ実験設定を使用して30分間実行されました（セクション4.2.1）。 インキュベーション後、サンプルを透析カートリッジに移しました。 酸化剤—ヘキサシアノ鉄酸カリウムの20 mM溶液を、透析前のインキュベーションの1つに添加しました[45]。 カセット（Slide-A-Lvzer透析カセット、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）に30分間浸漬しました（透析溶液を3回交換しました）。 透析後、サンプルをカセットからガラス管に戻し、テストステロンをマーカー基質として使用して残留酵素活性を評価しました（最終濃度200μM）。 NADPH生成システムも透析されたため、酵素反応を開始するために再度インキュベーションに追加されました。 サンプルを同じ設定で30分間インキュベートしました（セクション4.2.1で説明）。 ジクロロメタン中のギ酸の氷冷溶液を加えることにより反応を停止させた。 サンプルをHPLCで分析した。 シトクロムP450 3A4の既知の疑似不可逆的阻害剤であるジルチアゼムを、第二鉄型への酸化を評価するための陽性対照として使用しました（完全な酵素活性の回復が観察されました）。
4.2.4。結果の処理
片側t検定は、残留活動の測定に基づいて、サンプルとコントロール間の差異の統計的有意性を評価するために使用されます。 非線形方程式を使用してIC50値を計算しました。 ミカエリス・メンテン式を使用して、阻害剤の不活性化定数と不活性化率を決定しました。 統計処理とグラフの準備は、プログラムR（統計コンピューティングのRプロジェクト、ウィーン、オーストリア）とMicrosoft Excel（マイクロソフト、レドモンド、ワシントン州、米国）を使用して行われました。
5。結論
アカセチン、アピゲニン、クリシン、およびピノセムブリンは、invitroでCYP3A4酵素活性を阻害します。 クリシンは最も強力な酵素阻害剤であり、IC50、Kが最も低くなっています。 Kinect値と最高の不活化効果。 すべてのフラボノイドは酵素のヘム濃度を低下させ、これが反応性中間体による不可逆的な阻害であり、SODとCATの添加では防ぐことができないことを確認しました。 試験したフラボノイドはいずれも、25μM濃度のCYP3A4酵素の可逆的または疑似不可逆的阻害剤として機能しません。これは、ヘキサシアノ鉄酸カリウムを添加した場合と添加しない場合の透析では酵素活性を回復できなかったためです。 これらのフラボノイドは、果物、野菜、香辛料、お茶、赤ワインなどのさまざまな食品に豊富に含まれているため、CYP3A4基質であるさまざまな生体異物に干渉する可能性があります。 このような食品と薬物の相互作用の可能性、および相互作用における他の酵素とトランスポーターの寄与の可能性を完全に調査するには、さらなるinvivo研究が必要です。
この記事は、Molecules 2021、26、3018から抜粋したものです。
