ケンペロールはオートファジーを促進することによりLDミトコンドリアの損傷を軽減する：パーキンソン病への影響パート1
Mar 29, 2022
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概要：新たな証拠は、予期しない脂肪滴（LD）の沈着と過酸化がオルガネラストレスを加速し、神経変性疾患（NDD）の病因に重要な役割を果たすことを示しています。以前の研究では、天然のフラボノイド小分子であるケンペロール（Ka）を確認しました。 、LPS誘発性パーキンソン病（PD）のマウスに対して神経保護効果を示した。 さらに、以前の研究では、オートファジーが細胞のLD沈着の調節に重要な役割を果たすことが示されています。 現在の研究では、Kaが黒質緻密部（SNpc）の脂質酸化ストレスの低下を伴う、MPTP / p誘発PDマウスのTHプラスニューロン喪失および行動障害から保護することを示しました。培養神経細胞では、Kaは比較的安全な濃度範囲であり、MPPプラスによって誘発されるLD蓄積と細胞アポトーシスを大幅に抑制しました。 さらなる研究は、Kaの保護効果がオートファジー、特にリポファジーに依存していることを示しました。 重要なことに、Kaはオートファジーを促進してリソソームのLD分解を仲介し、脂質の沈着と過酸化、およびその結果生じるミトコンドリアの損傷を軽減し、その結果、神経細胞死を減少させました。 さらに、AAV-shAtg 5-を介したAtg5ノックダウンは、PDマウスの脂質酸化に対するKaの神経保護効果を無効にしました。 この作業は、Kaが脂質過酸化を介したミトコンドリア損傷の抑制を介して、唇のオートファジーを促進することにより、PDのドーパミン作動性ニューロンの変性を防ぎ、PDおよび関連するNDDの潜在的な新規治療戦略を提供することを示しています。
1.はじめに
パーキンソン病（PD）は、黒質緻密部（SNpc）のドーパミン作動性（DA）ニューロンの進行性喪失を病理学的に特徴とする一般的な神経変性疾患（NDD）です[]。 この病気の正確な病因と自然経過はまだ完全には解明されていませんが、ミトコンドリア機能、ドーパミン恒常性、神経炎症、オートファジーなど、多くのシステムレベルのプロセスと機能障害がPDの病因に関係しています[1 2]。 最近の報告では、脂肪滴（LD）関連の脂肪毒性がPDの病理に関与している可能性があることが明らかになりました[3,4]。 LDは、小胞体（ER）膜から出現する非常に動的な細胞小器官であり、通常、中性脂質貯蔵の細胞内部位として機能します[5]。 LDは最近、酪酸（FA）の貯蔵よりもはるかに幅広い役割を果たし、多くの病気に関与していることが示されました。 たとえば、マクロファージ、白血球、好酸球などの骨髄細胞は、炎症とストレスに反応してLDを形成し、LDは炎症性サイトカインの産生と貯蔵の部位であり、抗原提示と病原体クリアランスにさらに関与します[6]。 重要なことに、アテローム性動脈硬化症では、LDに富む泡沫細胞が病気のすべての段階で有害であることが示されています[7]。
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しかし、LDは中枢神経系（CNS）で広く研究されておらず、ヒトの脳組織におけるLDの組織学的存在を報告している論文はほとんどありません[8,9]。 それでも、グリア細胞の凝集したLDがショウジョウバエモデルの神経変性を加速することが最近の研究で確認されたように、LDは脳で重要な機能を持っている可能性があります[10]。 最近、マウスでは、ニューロン、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に加えて星状細胞、イオン化カルシウム結合アダプター分子を含むオイルレッドO陽性脂質含有細胞が報告されています-1（IBA -1 ）ミクログリアは、多くの脳領域に存在し、加齢に伴うプロセスに関与することが示されています[11]。 私たちの以前の研究はまた、PDマウスモデルにおける脳内のLD蓄積の増加を示しました[12]。 まとめると、これらの研究は、LDがPDや他のNDDの病因に関与している可能性があることを示唆しています。
通常、細胞内LDはリソソームで分解され、FAをミトコンドリアに送達して、栄養素が枯渇した期間中の代替エネルギー源として消費します[13]。 しかし、ニューロンはエネルギー生産のためのミトコンドリアFA消費能力が低い[14]。 この特性により、ニューロンはLDの蓄積と過酸化に特に敏感になります。 さらに、LDの蓄積は、FA酸化速度を高め、ミトコンドリアの電子伝達系に持続的な圧力をかけます。これにより、電子伝達系複合体IおよびII [15]による活性酸素種（ROS）の生成が増加し、酸化ストレスが増幅されます。 脂質の過負荷は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）オキシダーゼや他の酸化酵素などのミトコンドリア外の供給源によるROS産生にもつながります。 抗酸化酵素の発現の低下とニューロンでのFA消費能力の低さと相まって、LDの蓄積は酸化ストレスを媒介し、さらにミトコンドリアの損傷、リソソームの機能不全、オートファジーの欠陥、炎症反応の活性化につながる可能性があります[16,17]。 蓄積されたLDを抑制または除去できない限り、高活性ニューロンは病態生理学を起こし、神経変性を引き起こします[17]。 証拠は、オートファジーと呼ばれるリソソームを介した異化プロセスが、複数の組織で細胞のLDホメオスタシスを維持する上で極めて重要な役割を果たしていることを示しています[17、18]。 詳細には、LDはオートファゴソームに選択的に隔離され、リソソーム酸性リパーゼによる分解のためにリソソームに送達されます。これは、特にリポファジーとして知られているプロセスです[19]。 したがって、LDとそのオートファジー除去経路をターゲットにすることは、神経変性を管理するための新しいアプローチを表す可能性があります。
潜在的なNDD治療および戦略の情報源としての天然物および食事療法剤の研究は、近年大きな関心を集めています[20]。 ケンペロール（Ka）は、多くの中国の薬草や食事源に含まれている天然のポリフェノール小分子です[21]。 Kaは、抗酸化作用、抗老化作用、免疫調節作用に加えて、抗酸化作用や神経保護作用を発揮することが報告されています[20、22、23]。 以前、KaはinvitroでBV2ミクログリア細胞の炎症を抑制し[24]、invivoでの神経炎症に対するDAニューロンの耐性を高めることが報告されていました[25]。 ただし、PDのLDに対するKaの影響はまだ調査されていません。
LDの重要性と、PDに関与するLD、ミトコンドリア、オートファジー[16]の密接な関係を考えると、KaはLDの過酸化を抑制し、PDのDA神経変性を防ぐと仮定します。 本研究では、KaがLDの蓄積を阻害することにより、マウスPDモデルの神経変性を有意に防御することを実証しました。 さらなる研究により、Kaはオートファジーを引き起こし、酸化されたLDの蓄積を減らして、ミトコンドリアの機能障害とミトコンドリアのROS（mtROS）の生成を軽減し、それによってニューロンのアポトーシス死を防ぐことが明らかになりました。 この研究で得られた発見は、PDなどのNDDにおける天然分子Kaの使用に関する直接的な臨床的決定に役立つ可能性があります。
2。材料と方法
2.1。 実験動物
C57BL / 6Jマウス（オス、4-月齢）は南京医科大学動物コア（南京）から入手しました。 マウスは、南京医科大学医学部の動物資源センターと南京ドラムタワー病院の動物施設で飼育され、飼育されました。 マウスは、周囲温度が22度±2度で、明暗サイクルが12:12時間の部屋で、餌と水を自由に摂取できます。 すべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所ガイドのガイドラインに厳密に従って実施されました。
2.2。 試薬
MPTP (M0896),3-MA (M9281), penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol(HPLC>99. 0パーセント、96,353）in vitro実験は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。 BODIPY 493/5 0 3（D3922）、BODIPY 581/591 C11（D3861）、DHE（D11347）は、ThermoFisherScientificから購入しました。 動物実験では、Kaを滅菌生理食塩水中の16パーセントSBE - -CD中の10パーセントDMSOの溶液に溶解しました。 細胞実験のために、KaはDMSO（Sigma-Aldrich）およびPBS（最終DMSO濃度は0.01パーセント）、pH7.4で調製されました。
2.3。 メチル-4-フェニル-1、2,3、6-テトラヒドロピリジン（MPTP）誘発PDマウスモデルの誘発と治療
MPTP / p毒性のPDモデルにおけるKaの効果を評価するために、マウス（男性、4-5か月齢）を生理食塩水治療群、MPTP治療群、MPTPとKa治療群にランダムに分けました。グループ、およびKaだけがグループを扱いました。 MPTP治療群では、マウスは以前に説明されたものと同様のプロトコルで慢性MPTP投与を受けました[26]：MPTPを生理食塩水に溶解し、25 mg / kgで皮下注射し、続いて250 mg / kgプロベネシド（ジメチルスルホキシドに溶解）を注射しました。 5週間にわたって3。5日ごとに1時間間隔で腹腔内（ip）注射。 対照マウスは生理食塩水とプロベネシドの注射を受けた。 MPTPとKaで治療したグループでは、マウスにKa（50 mg / kg、実験中は1日1回の注射、Jingzhu Biotechnology、南京、中国）を毎日3日間腹腔内（.p。）投与した後、MPTPで治療しました。 MPTP注射週。 最後のMPTP注射の1週間後、マウスはグループを知らされていない行動テストを受けました。 その後、すべてのマウスを40 mg / kgのペントバルビタールナトリウムで麻酔し、脳タンパク質の検出と免疫組織化学またはqPCR分析のために犠牲にしました。
2.4。 インビボ定位手術および実験的治療
ペントバルビタールナトリウム麻酔（4 0 mg / kg、ip）下での定位手術は、記載されているように実施されました[25]。 マウスAtg5とコントロールshRNAをパッケージングベクター（AAV-U 6- CMV-shR-NA-EGFP）でトランスフェクトして、AAVを生成しました。 マイクロインジェクションの場合、麻酔をかけたマウスを定位固定装置に入れます。 それらは、DG（AP：-0。3 mm; ML：±0。13mm; DV：-0 .45 mm）を狙うガラス電極によって1μLAAVを速度で注入されました。次に、ウイルスのマイクロインジェクション後、さらに2-分2週間針を保持し、マウスにMPTP誘導PDモデル伝導および（または）Ka処理を施しました。
Atg5 shRNAは、Hanbio Biotechnology（Shanghai、China）Co.、Ltdから入手しました。Atg5サイレンスのプライマーを補足表1に示しました。
2.5。 行動分析
MPTPまたは生理食塩水の最終注射の1週間後、ロータロッドテストとポールテストが前述のように実行されました[27]。 ロータロッド試験では、実験開始前の2日間、1日2回の試行（加速速度12-20 rpmで6分間）でマウスをロータロッドに順応させました。 次に、マウスを20 rpmで300秒間、他の3日間連続してテストしました。 落下までの待ち時間は、Rotarod Analysis System（Jiliang、上海、中国）を使用して記録されました。 ポールテストでは、マウスを垂直の木製ポール（表面が粗い、高さ50 cm、直径1 cm）の上に頭を上にして置きました。 すべてのマウスは、試験の２日前に装置に慣れ、その後、３日目に３回試験された。 合計時間（T-total、マウスが4本の足で床に到達するまで）と回転時間（T-turn、マウスが完全に頭を下に向けるまで）を記録しました。 実験は、各行動試験についてマウス群を知らされておらず、試験は３回行われた。
2.6。 脳サンプルコレクション
最終的な行動試験の後、マウスをペントバルビタールナトリウム（40 mg / kg、ip）で麻酔しました.qPCR、ウエスタンブロッティング、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析では、脳全体を動物から、次に中脳と線条体組織を迅速に解剖し、液体窒素で予備凍結した。 すべてのサンプルは、分析まで-80度で保存されました。
免疫組織化学的分析のために、マウスを4パーセントのパラホルムアルデヒド（PFA）で経心的に灌流した。 脳を抽出し、固定後、脱水し、OCT（Tissue-Tek）に埋め込み、凍結ミクロトーム（Leica CM1950、Nussloch、ドイツ）を使用して、脳の連続切片を各層全体と中脳で凍結切片化しました（スライスあたり30 um）。 ）。 すべてのセクションは6つの別々のシリーズに収集され、脳スライスは50％グリセリンに保存され、分析まで-20度で凍結されました。
TEMの場合、マウスは、[12]に記載されているように、2.5％のグルタルアルデヒドと2％のパラホルムアルデヒドで灌流されました。 少量（<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">
2.6。 免疫組織化学的分析
脳スライスをPBSでリンスし、続いて3パーセントのH2O2を1 0分間リンスし、次に5パーセントのBSAを添加したPBS中の0。3パーセントのTritonX-100と1時間インキュベートしました。 その後、スライドを一次抗体と4度で一晩、5％BSAを含むPBSで一晩インキュベートし、次に洗浄し、二次抗体で室温で1時間インキュベートした後、ジアミノベンジジン（DAB）とインキュベートするか、 5分間の免疫蛍光染色としてのDAPI（Life Technologies、Cat P36931）。 ニッスルステインの場合、スライドをクレシルバイオレット（CV）溶液（クレシルバイオレット0.1 g、H2O 99 ml、1％酢酸1 ml）で、室温で30分間混合した後、アルコールとキシレンで脱水しました。 Olympus BX52顕微鏡（Olympus America Inc.、Melville、NY、United States）で画像を観察し、写真を撮影しました。 SNpc内のTH陽性およびニッスル陽性ニューロンの総数は、MicroBrightField Stereo-Investigatorソフトウェア（MicroBrightField、ウィリストン、バーモント州、米国）を使用した光学分画法を使用して血清学的に取得されました。
2.7。 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析
マウス線条体サンプルを{{0}}。1M過塩素酸（100μL過塩素酸中1 mg組織）および0.1mMEDTAでホモジナイズしました。
2.17。 フローサイトメトリー
細胞を消化し、D-hankでリンスした後、アネキシンV-FITC（5ulを500ul PBSで希釈）/ PI（0.1ulを500ul PBSで希釈）アポトーシスキット（CA1020、Solarbio、北京、 Chian）メーカーのプロトコルによる。 その後、アポトーシス細胞をフローサイトメトリー（guava easyCyteTM 8、Millipore、USA）を使用して分析しました。 ミトコンドリアのROSおよびミトコンドリア膜電位の測定は公開されているように実施しました【12】。SH-SY5Y細胞をMitoSOX（2.5μM、Invitrogen、米国）またはJCl（10 ug / ml、T -3168、Invitrogen、米国）で染色しました。 ）37・Cで30分間。 PBSで2回洗浄した後、フローサイトメトリー分析のために、細胞を1％FBSを含む冷PBSに再懸濁しました。 データは、FCS Expressソフトウェア（Guava Easy CyteTM8、Millipore、Hayward、CA、USA）を使用して分析しました。
2.18。 タツノオトシゴ呼吸アッセイ
生きているSH-SY5Y細胞のミトコンドリア呼吸機能は、タツノオトシゴの細胞外フラックス（XFe96）アナライザー（Agi-lent、サンタクララ、米国）を使用して、酸素消費率（OCR）の変化を介して測定されました。 3×103cells/ウェルで播種されたSH-SY5Y細胞は、Seahorse細胞培養プレートに付着し、実験時に約80％のコンフルエンシーに達することができました。 翌日、細胞をKaで前処理し、MPPplusにさらに24時間曝露しました。 OCRは基本的な条件下で検出され、続いて1μMのオリゴマイシン、1μMのFCCP、および1μMのロテノンとアンチマイシンAが順次添加されました。
2.19。 統計分析
データは平均±SEMとして表された。 差の有意性は、スチューデントのt検定、二元配置分散分析、または一元配置分散分析（ANOVA）とそれに続くテューキーの事後検定によって決定されました。 差はPで有意であると見なされました<>
3.結果
結果1.Kaは運動機能障害を回復し、MPTP /pPDモデルマウスの線条体のドーパミンレベルを上昇させます
Kaon PDの病因の神経保護効果を調査するために、4-月齢の雄C57BL/6マウスに神経毒MPTPを注射してMPTP/p PDモデルを確立し、Kaで治療しました（図1a）。 モデル誘導後、ロータロッドテストとポールテストを使用して、異なるグループのマウスの運動と行動のパフォーマンスを評価しました。 示されているように、ロータロッドのパフォーマンス時間は、MPTP処理マウスで著しく短縮され、この効果はKaによって防止されました（図1b）。 Kaはまた、マウスの体重に影響を与えることなく（図1e）、ポールテストでの回転時間と合計時間の短縮（図1cとd）によって示されるように、MPTPによって誘発された行動障害を回復しました。 さらに、HPLC分析は、線条体のドーパミンのレベルがMPTP / pチャレンジマウスで有意に減少し、このレベルがKa処理によって回復したことを示しました（図1f）。 Ka処理はまた、線条体のジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC、ドーパミンの代謝物）レベルのMPTP / p誘発性の低下を軽減しました（図1g）。 これらの結果は、Kaが運動機能障害を回復し、MPTP誘発性PDマウスの線条体のドーパミンレベルを上昇させることを示唆している。
結果2.Kaは、MPTP /pPDモデルマウスのSNpcにおけるDAニューロンの喪失を軽減します
次に、K中間子MPTP / p誘発性DAニューロン障害の神経保護効果をさらに評価するために、チロシンヒドロキシラーゼ（免疫染色によるマウスSNpcのTHDプラスニューロン。図2aおよびbに示すように、MPTP /pは有意な減少を誘発した）を調べた。 K中間子処理によって軽減されたTHプラスニューロンの数でさらに、Nisslによって定義されたSNpcの総ニューロンの立体的カウント
図1.Ka治療は、MPTP / p PDモデルマウスの線条体における運動機能障害を軽減し、ドーパミンレベルを増加させます。
（a）実験計画の概略図。 （b）ロッド上の時間を3日間連続してロータロッド試験のために測定した。 （cd）ポールテストのために、振り返る時間（回転する時間）とポールを降りる時間（登る時間）を記録しました。 （e）研究の最後にマウスの体重を測定し、線条体中の（fg）ドーパミン（DA）およびジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）を高速液体クロマトグラフィーで分析した。 データは、（b、C、d）の各グループの平均±SEM.n=9-10として表されます。 各グループのn=6-8in（f、g）.ns、有意ではない、* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">
染色により、THt細胞の喪失は細胞死を反映しているが、TH発現のダウンレギュレーションは反映していないことを確認し、Ka処理によりMPTP処理マウスのSNpcのニッスル陽性ニューロン数の減少が43.3％から25.4％に回復したことを示しました（図2cおよびd）さらに、Kaは、ウエスタンブロッティングで測定した場合、MPTPによるTHおよびDATタンパク質発現の低下を有意に改善しました（図2e-g）。 この証拠は、PDマウスモデルに対するKaの神経保護効果を裏付けています。
結果3.Kaは、MPTP/p処理マウスのSNpcにおけるLD液胞の蓄積と酸化ストレスを軽減します
増加する証拠は、NDDへのLDの関与を示しており[10]、一貫して、私たちの以前の研究は、MPTP誘発PDマウスのSNpcにおける増加したLDを特定しました[12]。 LDは簡単に識別でき、均質なアモルファス含有量の丸い低密度構造を示します[28]。 通常、LDは蓄積を避けるためにオートファジーによって分解することができます[29]。 KaがPDのLDを調節できるかどうかを調べるために、LDの蓄積を、コントロール、MPTP / p、およびMPTP / pとKaマウスのSNpcで透過型電子顕微鏡（TEM）によって分析しました。 以前の研究[12]に示されているように、LDの数とサイズは生理食塩水で処理したコントロールと比較してMPTP / pマウスで増加し（図3aおよびb）、Kaで処理したマウスでは大幅に減少しました（図3c- e）。 さらに、Ka処理マウスでは、LDは、電子密度の高いリポフスチン顆粒として定義されるオートリソソームの近くで、より頻繁に観察され、囲まれ、または分解されました。 中性脂質を特異的に標識し、LDの検出に一般的に使用される色素であるBODIPYによるTHプラスニューロンのさらなる組織学的染色[30]は、SNpcのBODIPYプラスLDの数とサイズの両方がコントロールよりもPDマウスの方が高いことを示しました、およびKa処理によって大幅に減少しました（図3f-h）。
LDを適時に分解できない場合、蓄積されたLDは過酸化反応を起こし、神経毒性と疾患の進行を増幅するミトコンドリアのROSを介したストレスに寄与する可能性があります[4]。 したがって、我々はさらに、報告されているように、遊離FA毒性（Gpx8）、中和酸化種、スーパーオキシドラジカル（Sod3）および過酸化水素（Cat）、およびFA代謝（Acsbg1およびDbi）に対する保護に関連する遺伝子の発現プロファイルを調べました[31]。 、これらはすべて、コントロールと比較してMPTP処理マウスのSNpcで著しく減少し、これらの効果はKa処理PDマウスで改善されました（図3i）。 同様に、MPTP/pもmRNA発現レベルを増加させました
MPTP / pマウスのSNpcにおけるNox1、Nox2、Nox4などのNADPHオキシダーゼサブユニットの発現。これらはKa処理によってさらに鈍化されました（図3j）。 まとめると、これらのデータは、KaがMPTP / pによって誘発されるLDの蓄積、過酸化、およびROSによって媒介されるストレスを軽減することを示唆しています。
この記事は、ScienceDirect Redox Biologyジャーナルのホームページ（www.elsevier.com/locate/redox）で入手できるコンテンツリストから抜粋したものです。
