CistancheDeserticolaに関連する内生菌由来のクリソゲナミドAとSH-SY5Y細胞に対するその神経保護効果
Mar 03, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
序章
ニクジュヨウ（YC Ma）は、中国北西部に自生する寄生植物です。 この植物の茎は重要な伝統的な漢方薬であり、腎臓の欠乏と神経衰弱の治療に使用されます（「漢方薬辞書」、1977年）。 からのフェニルタノイド配糖体Cistancheニクジュヨウ脳神経疾患の予防と治療、およびフリーラジカルの除去に活動があることが報告されています[1、2]。 内生菌は宿主植物と同じ/類似の新しい薬用成分を生産できるという事実に基づいて、重要な薬用植物の内生菌から新しい活性化合物を探すことは、新しい薬用資源の開発の価値を示しています。 内生菌からの新しい神経保護化合物の検索の過程でCistancheニクジュヨウ中国北西部の内モンゴルから収集された3つの活性株は、SH-SY5Y細胞を使用してスクリーニングされました。 その中で、ペニシリウム・クリソゲナムとして認証された真菌No. 005の培養液は、SH-SY5Y細胞における酸化ストレス誘発性細胞死に対して有意な神経細胞保護効果を示しました。 この菌株の有効成分に関する研究により、バイオアッセイに基づく分離手順により、クリソゲナミドA（1）（図1）が分離されました。 さらに、4つの既知の化合物が分離され、G（2）[3]、2- [（2-ヒドロキシプロピオニル）アミノ]ベンズアミド（3）[4]、2-でサーカムダットとして同定されました。 、3-ジヒドロソルビシリン（4）[5]および（9Z、12Z）-2、3-ジヒドロキシプロピルオクタデカ-9、12-ジエノエート（5）[6] 、それらの分光データを文献データと比較することによって。 ここでは、クリソゲンアミドAの分離、同定、および神経保護効果について報告します。
材料および方法
真菌材料PenicilliumchrysogenumNo. 005のサンプルは、中国北西部の内モンゴルから収集されたC.deserticolaの根から分離されました。 ポテトデキストロース寒天培地では、肉眼で見える外観は広がり、滑らかで、ビロードのような、青緑色のコロニーであり、時には軽い菌糸が生い茂っていました。 コロニーの表面はしばしば多くの淡黄色の液滴を示しました。 逆黄色。 No. 005の18SリボソームDNA遺伝子配列（1676ヌクレオチド; Gen-Bankアクセッション番号EU203859）を用いたGenBank検索を実施した。 結果は、ペニシリウム・クリソゲナムの種が最も近いものであることを示しています。 その巨視的な外観と18SrDNA遺伝子配列に基づいて、No.005はPenicilliumchrysogenumの菌株です。
発酵と抽出
真菌は、静的条件下で24度で3 {{1 0}}日間、液体培地（3 0 {{2 {{22}）を含む35 1000-mlの円錐形のフラスコで増殖させました。 }}} ml / flflask）グルコース（10 g /リットル）、マルトース（20 g /リットル）、マンニトール（20 g /リットル）、グルタミン酸ナトリウム（10 g /リットル）、KH2PO4（0.5 g /リットル）、 MgSO4・7H2O（0.3 g / L）、コーンスティープリカー（1.0 g / L）、酵母抽出物（3.0 g / L）、およびpHを7.0に調整した後の海水。 発酵させた全ブロス（10.5リットル）をEtOAcで3回抽出してEtOAc溶液を得、これを減圧下で濃縮して粗抽出物（9.5g）を得た。
精製
粗抽出物（９．５ｇ）を、石油エーテル／ Ｍｅ２ＣＯの段階的勾配溶出を使用して、シリカゲルカラム上で１５の画分に分離した。 ８：２の石油エーテル／ Ｍｅ２ＣＯで溶出された画分２を、ＭｅＯＨから再結晶化して、３つを無色の針状物として得た（８。{{1 0}} mg）。 7：3石油エーテル/ Me2COで溶出したフラクション3（19。{{3 0}} mg）を、逆相カラム（RP18、4 0 6 {{38 }} mm、Merck; MeOH-H2O 3：2→4：1→MeOH）でfrを得る。 3 7（8。0 mg）、これは広範なPHPLC（{{7 0}}を含む60パーセントのMeOH、1パーセントのTFA、4。{{77}）によって精製されました。 } ml /分）4（2。{{8 0}} mg）を与えます。 6：4石油エーテル/ Me2COで溶出した画分4（26.0 mg）を、逆相カラム（RP18、40 60 mm、Merck; MeOH-H2O 3：2→4：1→MeOH）でさらに分離して得た。 fr。 4-3（5.4 mg）およびfr。 4-9（7.6mg）。 次に、fr。 4-3を大規模なPHPLC[YMCパックODS（A）、10 250 mm、5 mm、4.0 ml /分]（60パーセントMeOH、4.0 ml /分）で分離し、2（1.0 mg）を得ました。 fr。 4-9を大規模なPHPLC（80パーセントMeOH、4.0 ml /分）で分離して、1（4.0 mg）と5（2.6 mg）を得た。 1：淡黄色の固体として得られる。 [a] D 25 24.5度（c 0.155、MeOH）; UV（MeOH）l max 208、251 nm; CD（MeOH）（図4を参照）; IR（KBr）n max 3433、3200、3076、2928、2862、1677、1440、1370、1324、1188、1029 cm 1; 1 H-および13C-NMR（表1を参照）。 HRESI-MS m / z 448.2951 [MH]（C28H38N3O2の計算値、448.2964）
DPPHラジカルスカベンジング効果
さまざまなサンプル濃度（1。0 mg / ml 0.0001 mg / ml）のMeOH溶液（16 0 ml）を40 ml DPPH（1、1-ジフェニル{{8 }}ピクリルヒドラジル;シグマ）MeOH溶液（1.5 10 4M）。 穏やかに混合し、室温で30分間放置した後、分光光度計を使用して520nmで光学密度を測定しました。 各サンプルの抗酸化活性は、IC50（DPPHラジカル形成を50％阻害するために必要なmg / mlまたはmM）で表され、対数用量阻害曲線から計算されました。
ニクジュヨウの神経保護
細胞培養と薬物治療
ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞をDMEM培地で培養し、5。0パーセントのCO2を含む加湿雰囲気で37度に維持しました。 5 * 1 04細胞ml-1の密度のこれらの細胞懸濁液（18 0 ml）を96-ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングし、上記の条件。 対照群とモデル群を除く各ウェルに異なる濃度のクリソゲンアミドA溶液（DMSO中2.0ml）を加え、同じ条件でさらに1時間インキュベートした。 H2O2（Sigma Chemical Co.、MO、USA）を添加して、SH-SY5Y細胞に最終濃度200mMで24時間アポトーシスを誘導しました。 細胞生存率は、MTTアッセイを使用して決定されました。 リン酸緩衝生理食塩水に溶解したMTTを、インキュベーションの最後に最終濃度5.0 mg / ml（PBS）になるように添加し、37度で4時間インキュベートしました。 上澄みを捨てて、得られたホルマザン生成物を溶解した。
結果と考察
１は淡黄色の固体として得られた。 分子式は、HRESI-MSによってC28H37N3O2として決定されました（[MH] C28H38N3O2、448.2964と呼ばれるm / z 448.2951で[MH]を観測）。 IRスペクトルは、NH（3433および32 0 0 cm 1）およびカルボニル基（1677 cm -1）の存在を示唆しました。 DMSO-d6で記録された1H-NMR（表1）スペクトルは、3つのメチル基（d H 0。62、0.87、0.98）と2つの交換可能なプロトンシグナル（d H 10.36および8.29）を示しました。 さらに、3つのオルト結合芳香族シグナル（d H 6.90 dd、J 7.3、7.3 Hz、6.94 d、J 7.3 Hz、および7.18 J 7.3 Hz）は、1,2、3-三置換ベンゼン環を示しました。 オレフィンプロトン（d H 5.27）と結合したメチレンプロトン（d H 3.23）は、2つのビニルメチル（d H 1.67および1.70）とともに、3-メチル-2-ブテニル基の存在を示しました。これらのプロトンと別の14個のメチンおよび/またはメチレンプロトンの1結合結合性は、HMQC実験によって確立されました。 28個のシグナルを開示した13C-NMRおよびDEPT（表1）スペクトルでも、これら2つのフラグメント[三置換ベンゼン環（dC 123.6 CH、120.8 CH、127.7 CH、122.1 QC、および140.4 QC）と{ {79}}メチル-2-ブテニル（dC 28 CH2、121.9 CH、132.3 QC、25.5 CH3、および17.7 CH3）]; さらに、2つのカルボニル（dC 183.1および172.3）、4つのsp3第4炭素（dC 46.5、58.7、60.4、および62.3）、2つのsp3メチン（dC 46.1および58.7）、および6つのsp3メチレン（dC 20.7、31.8、34.3、 35.2、39.9および64.9）も観察された。 12個の不飽和のうち6個が考慮されたため、1個には6個のリングが含まれていると推測されました。 これらのスペクトルデータを1H-1 H COZYおよびHMBCの結果とともにさらに評価すると、1が真菌代謝物のマルクフォルチングループと密接に関連していることが明らかになりました[7]。 HMBC相関の解釈（図2）は、部分構造A（HMBC相関1-NHからC-8およびC-9;H-6からC{{の存在を示しました。 136}};H-5からC-7およびC-9;H-26からC-28およびC-8およびH{{143 }}からC-29およびC-30）およびB（HMBC相関H-10からC-3、C -22、C -21、 C -11、C -12; H-20からC-13、C -18、C -22、C -11、および{ {157}}NHからC-13、C -10）、およびC、C -17にメチル化炭素を持つ6員G環[8]（HMBC相関H {{ 163}}からC-17、C -16）。 C -3を介した下部構造AからBへの接続は、H-4および1-NHからC-3への主要なHMBC相関によってサポートされていました。 H-10からC-2およびC-9へ。 構造BとCの間の窒素原子との関係は、H-12からC-17およびC-13への主要なHMBC相関と、C{{176の対応する化学シフトの比較によって推定されました。 }}およびC-17（dC 64.9および58.7）。 上記の分析は、ベンゼン環の側鎖と6員G環のC-17のメチルの違いを除いて1がマルクフォルチンAと同様の構造を持っていることを示しました。 したがって、1の全体構造は図1に示すように割り当てられました。
1の相対的な立体化学はNOESYデータに基づいて解明されました（図3）。 以前の研究では、2-オキシインドールアルカロイド型化合物は、中央の5員環がオキシインドールサブユニットの平面に直交するコンフォメーションを採用していることが明らかになっています[9]。
H{{0}}とH-10a、H -25の間、および19-NHとH-10 aの間のNOESY相関は、両方がそれらをH-4に向けるシクロペンタノン環の面で、示されているようにC-3での相対的な立体化学を固定します。 H -21、H -12 a、H -10 b、H -23、およびH -24間のNOESY相互作用により、対応する置換基がシクロペンタノン環。 1に対して提案された相対的立体化学は、マルクフォルチンAの相対的立体化学の関連する特徴と一致しています[7]。 200-250 nmでのコットン効果は、ジケトピペラジンアミド結合のnp *遷移から生じます。これは、ビシクロ-[2.2.2]ジアザオクタンジケトピペラジンコアの診断になります[10、11]。 1のCDスペクトル（図4）は、-ブレビアナミドAの関連領域と相関していました[11]。 したがって、1の絶対立体化学は3S、11S、13S、17S、21Rであり、クリソゲナミドAという名前が付けられました。神経細胞に対するクリソゲナミドAの保護効果の予備評価は、SH-SY5Yの酸化ストレス誘発性細胞死を使用して評価されました。 MTTアッセイによる細胞。 クリソゲンアミドAのフリーラジカル捕捉活性は、フリーラジカル供与体としてDPPHを使用して最初に調べられました。 ビタミンC（IC50：29.0 mM）とは対照的に、クリソゲナミドAは、100 mMまでの濃度でDPPHフリーラジカルを除去する能力（IC50 100 mM以上）を示しませんでした。 一方、SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫において、クリソゲナミドAが酸化ストレスによる細胞死から細胞を保護するかどうかをテストしました。
細胞。 過酸化水素による酸化ストレスは、対照群と比較して、細胞生存率を43パーセント低下させました。 クリソゲンアミドAは、1 * 10-4 mMの濃度で細胞の生存率を59.6％向上させることにより、過酸化水素によって誘発される細胞死を抑制しました。 これらのデータは、クリソゲンアミドAが、その抗酸化活性を介さずに、酸化ストレスによって誘発される細胞死に対して神経細胞保護効果を示したことを示唆しました。 珍しいビシクロ[2.2.2]ジアザオクタン環系を有するインドールアルカロイドは、アスペルギルス[12、9、13]、ペニシリウム[14 16]、マルブランチア[17]などのさまざまな属の真菌から単離されています。 1はこのグループの化合物の新しいメンバーであり、2005年に新しいクラスの五環性スピロインドリノンアルカロイドとして報告されたシトリン投与者AおよびBの生合成の中間体であると予想される骨格を持っていました[18]。 構造の観点から、1はC -17の位置にメチル化があり、2-オキシインドール部分がC-7にイソプレンユニットを持っているユニークな構造であることを指摘することが重要です。 現在までに単離されたこれらのインドールアルカロイドのいくつかは、強力な駆虫活性[19]、ヒト腫瘍細胞の阻害[13]、および細胞毒性[10]を示します。 私たちの知る限りでは、これはこのタイプのアルカロイドによる神経保護の最初の報告です。
了承この作品は、中国国立自然科学基金（No. 30472136）によって財政的に支援されました。
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