Cistanche Destericolaは、KEAP1/NRF2/HO -1抗酸化経路を調節することにより、パーキンソン病ラットの海馬の神経細胞損傷を改善します

抽象的な：

 

の効果を探るための目的パーキンソン病（PD）の神経細胞損傷に関するCistanche Destericolaラットとその関連メカニズム。方法Sprague-Dawley（SD）雄ラットは、コントロールグループ、モデルグループ、Cistancheグループの3つのグループ（各グループの1 0ラット）にランダムに分割されました。モデル群と治療群のラットには、6-ヒドロキシドパミン（6- ohda）を頭蓋内注射しました。シスチャン群のラットに0.216g/ mLのサイスンチェ溶液を投与し、空白群とモデル群のラットに通常の生理食塩水灌漑を投与し、灌漑の量は2週間1ml/（100g・d）を投与しました。ヘミマニ地域の西方体の形態は、西の染色によって観察されました。マロンジアルデヒド（MDA）およびスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）のレベルは、チオバルビツール酸法とニトロブルーテトラゾリウム法によって検出されました。 Kelch-like Ech関連タンパク質1（Keap 1）、核因子E 2-関連因子2（NRF 2）およびヘムシクロオキシゲナーゼ1（HO -1）タンパク質の変化は、ウエスタンブロットによって分析されました。 Cistanche Destericicola薬の治療後の結果、PDラットの海馬組織構造が改善され、ニューロンの形態が改善され、核ピレトーシスが緩和され、海馬における抗酸化酵素SODの含有量が緩和されましたが、酸化的なストレス産物の含有量は徐々に増加しました。 NRF 2およびHO -1のタンパク質発現が増加しました。結論Cistanche Destericolaは、海馬ニューロンの損傷を改善し、PDラットの海馬における酸化ストレス反応のレベルを低下させることができます。Cistanche Destericolaの効果でPDの治療ラットは、Keap {-1 /nrf 2 /ho -1シグナル伝達経路の調節と密接に関連しています。

 

 

 

PDの治療のための高品質のサイスチェ

 

キーワード：Cistanche Deserticola;パーキンソン病;酸化ストレス;海馬;ニューロン; Keap1; NRF2; ho -1

 

世界疾患データ研究の統計によると、神経疾患は世界中の障害の主な原因となっています。この分野では、パーキンソン病（PD）は、年齢標準化された有病率が大幅に増加し、障害症例が増加し、死亡率が上昇する最も急速に成長している疾患の1つになりました。 1つ。
1990年から2020年にかけて、世界中のPD患者の数は118％増加し、620万人に達し、発生率は年々増加しています[1-2]。 PD患者は通常、後期の脳、筋肉の剛性、ブラディキネシア、バランスの困難などの運動症状を呈します。ただし、認知機能の低下などの非運動症状は、病気の初期段階で発生する可能性があります。病気が進むにつれて、認知障害は徐々に悪化し、より深刻になります。

PDの治療のための高品質のサイスチェ

患者の生活の質に影響します[3]。海馬は、空間学習と外部情報を受け取るための脳の重要な組織です。これは、人間の認知機能を実現するための主要な構造です。海馬機能障害は、PD患者の認知機能障害の発症と密接に関連しています。酸化ストレスは、海馬組織の神経細胞の発生に関与しています。ダメージ[4-5]。したがって、PD患者で海馬ニューロンが保護されている場合、患者の認知を改善し、疾患の進行を遅らせる可能性があります。
近年、さまざまな中国の漢方薬が神経学的関連疾患の治療に効果的であることが証明されています[6]。 Cistanche Destericolaは、腎臓陽に栄養を与え、エッセンスと血を補充できる伝統的な漢方薬です。虚血性脳卒中や神経筋炎などの神経疾患の治療に使用されています[7]。研究グループによる以前の研究では、Cistanche DestericolaがPDモデルラットの挙動を改善し、中脳の主体領域におけるドーパミン神経細胞のアポトーシスを減らすことができることが示されています[{8-9]。ただし、サイスンチェデザイトコラがPDモデルラットの海馬組織損傷を改善できるかどうかは不明です。したがって、この研究は、PD治療のための新しいアイデアを提供するために、海馬組織の損傷に対するCistanche Destericolaの効果を観察し、そのメカニズムを調査するためのPDラットモデルを確立しました。 NISSL染色試薬（南ナンジンSenbeijia Biological Company）;イソフルラン（上海ヤジ生物学会）。

 

1つの材料と方法

1.1材料

1.1.1実験動物

30 6- 210-230 gの重量が使用された週前の雄ラットが使用されました。福建省伝統的漢方薬大学の実験動物センターは、実験動物と一般的な医学的実験的な動物環境施設を提供しました。この実験は、この機関の動物倫理委員会によって承認され、倫理登録番号は1N2023019です。

1.1.2実験試薬
Cistanche Destericola Granules（Fujian Third People's Hospital）; 6-ヒドロキシドパミン（6- ohda）試薬（Beijing Biolabor Technology Co.、Ltd。）;ヘマトキシリン - エオシン（HE）染色試薬（Taizhou Yunke Biotechnology Co.、Ltd。）;動物組織タンパク質溶解物（北京ソレバオ生物学的企業）;タンパク質ホスファターゼ阻害剤（Wuhan Pujian Biological Company）;プロテアーゼ阻害剤（Hunan Yunbang Biotechnology Company）; Kelch-like Ech関連タンパク質-1（KEAP1）モノクローナル抗体（Wuhan Sanying Biotechnology Company）;グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）モノクローナル抗体（Wuhan huamei Biological）;核因子E2関連因子2（NRF2）、ヘムオキシゲナーゼ1（ヘモキシゲナス-1、Ho -1）モノクローナル抗体（Wuhan Pujian Biotechnology Co.、Ltd。）;スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびMalondialdehyde（MDA）検出キット（Shanghai Biotech Co.、Ltd。）; NISSL染色試薬（Nanjing Senbeijia Biotechnology Co.、Ltd。）; Isoflurane（Shanghai Yaji Biotechnology Co.、Ltd。）。

 

1.1.3楽器

JEA3001電子バランス（Shanghai Puchun測定機器Co.、Ltd。）; BSA224S電子バランス（ドイツ、Sartorius）; Stab S2T低温シェーカー（Shanghai Hetian Scientific Instrument Co.、Ltd。）; RM2235完全自動パラフィンスライサー（ライカ、ドイツ）; Pectramax I3X多機能マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、USA）; BX63
蛍光顕微鏡（オリンパス、日本）; dlabハンドヘルド遠心D1008/d1008e（北京ダロンxingchuang実験機器株式会社、Ltd。）; cryCube F740HIウルトラ低温冷蔵庫（ドイツ、Epend、Epend）; MINIPRO EPBASIC BASIC ELECOREPHORESING INSTRUMBER POWER SULTION（Shanghai Yisheng Biotechnology Co.、Ltd。）;一定の温度乾燥オーブン（hangzhou notting Scientific Equipment Co.、Ltd。）; Ascent Max Ductless Fume Hood（Shanghai Yishike Enterprise Development Co.、Ltd。）。

 

1.2メソッド

1.2.1モデルの確立と動物のグループ化

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0円、成功したモデリングと見なされました。その後、Cistanche Deserticolaグループのネズミは、毎日0.216 g/mlのCistanche Destericola溶液でgavagedされ、空白のグループとモデルグループは通常の生理食塩水でgavedされました。ラットの3つのグループの強制容積は、2週間にわたって1 ml/（100 g・d）でした[9]。ラットの各グループの治療が完了した後、ラットを2％イソフルラン吸入麻酔により安楽死させ、その後の実験研究のために脳組織を収集しました。

 

1.2.2ヘマトキシリン - エオシン染色による海馬組織の病理学的変化の観察

 

各グループのラットの海馬組織を収集し、ホルムアルデヒド溶液に入れ、勾配エタノールで脱水し、乾燥オーブンで焼き、溶解したワックス、乾燥した脱線を染色し、キシレンで透明化し、中程度のガムで密閉し、顕微鏡下で観察されました。

 

1.2.3海馬神経細胞の超微細構造の透過型電子顕微鏡観察

海馬組織を3％グルタルアルデヒド固定剤に入れ、勾配エタノールで脱水し、埋め込まれた（エポキシ樹脂）、および超薄切片を調製しました。クエン酸鉛およびアセテートウラニル染色を使用して、海馬神経細胞の超微細構造変化を観察しました（透過型電子顕微鏡下）。

 

1.2.4海馬組織におけるNISSL体の変化を観察するためのNISSL染色

上記の海馬組織パラフィン切片は、それぞれ95％および70％の勾配エタノールで無水エタノールで水分補給されました。蒸留水で3回洗浄した後、nissl染色溶液で5分間染色し、脱水勾配アルコールと蒸留水で洗浄し、キシレンで洗浄します。切片を中性接着剤で密封し、固化後に光学顕微鏡の下で観察および記録しました。

 

1.2.5海馬組織におけるMDAとSODの含有量を検出する化学比色法

異なる実験群の海馬組織を均質化した後、それらは1000 gで20分間遠心分離し、各実験群の上清を収集しました。キットの指示によると、MDAおよびSODアッセイキットを使用して、実験サンプルの各グループのMDAとSODの含有量を検出しました。

 

1.2.6海馬組織におけるKEAP1、NRF 2、およびHO -1タンパク質の特定の発現を検出するためのタンパク質免疫ブロッティング

各グループの海馬組織を溶解緩衝液で添加し、000 r・min -1で12で15分間遠心分離しました。上清は、スタンバイの使用のために収集されました。タンパク質濃度は、BCA法によって決定されました。タンパク質の定量化の結果によれば、対応する総タンパク質の体積を加え、タンパク質ゲル電気泳動を充填しました。サンプルを95度で10分間変性させ、膜に移し、切断し、ブロッキング溶液で1時間ブロックしました。希釈した一次抗体KEAP1、NRF 2、HO -1、およびGAPDH（1：500）を加え、4度で一晩反応し、1×TBSTで洗浄し、二次抗体（1：4000）でインキュベートし、1×TBSTで再び色のイメージングを洗浄しました。

 

1.3統計分析

カウントデータは、平均±標準偏差として表されました。正規分布と分散の均一性に準拠したデータはt検定にかけられ、正規分布と不均等な分散に準拠したデータは修正されたt検定にかけられました。正規分布に準拠していなかったデータは、ノンパラメトリックテストにかけられました。一元配置分散分析を使用して、異なるグループ間の違いを比較し、その後、LSDメソッドを使用して2つのグループを比較しました。 p <0。05は統計的に有意と見なされました。

 

2つの結果

2。モデル群の神経細胞はより無秩序に配置され、細胞核が縮んでいて、核染色が深くなり、神経細胞の損傷は明らかでした。 Cistanche Destericolaグループのニューロン細胞は、モデルグループの細胞よりも定期的に配置され、核凝縮の数は比較的減少し、神経細胞の損傷が軽減されました。結果を図1に示します。

 

 

図1パーキンソン病の海馬のCA1領域における病理学的構造に対するCistanche Destericolaの効果（HE、×400）注：A：コントロールグループ。 B：モデルグループ。 C：サイスンチェグループ。黒い矢印は、神経細胞の損傷を示しています。

 

2.2 PDモデルラットの海馬ニューロンの超微細構造に対するCistanche Destericolaの効果

空白のグループでは、海馬ニューロンを観察すると、細胞構造が明確な形態を維持し、核が通常の丸いまたは楕円形を示し、核膜は滑らかで無傷のままで、核内のクロマチンは均等に分布しており、核染色性の核凝集はありません。対照的に、モデル基の海馬ニューロンは明らかな変化を示しました。細胞の全体的な電子密度が増加し、核が凝縮し、核膜の底部に付着し、核膜が肥厚し、細胞質に濃縮され、核膜が濃縮され、核膜が濃縮されました。モデルグループと比較して、Cistanche Destericolaとの介入後、Cistanche Destericolaグループの海馬ニューロンは一定の回復傾向を示しました。神経細胞体のサイズは回復しました。細胞膜は無傷のままでした。減少し、Cistanche Deserticolaが神経細胞に特定の保護または修復効果があることを示しています。図2を参照してください。

 

図2パーキンソン病ラットの海馬におけるニューロンの超微細構造に対するサイスンチェデザイトコラの効果（×7000）注：A：対照群。 B：モデルグループ。 C：サイスンチェグループ。

 

2。

NISSL染色の結果は、空白群のニューロンが密接に配置され、通常の形態、豊富なNISSL体、暗い染色があることを示しました。モデルグループのニューロンはゆるく配置され、腫れ、ほとんどのNISSL体が溶解し、軽く染色されました。 Cistanche Deserticolaグループのニューロンは密接に配置され、定期的な形態があり、NISSL体の数と染色がモデルグループと比較して改善されました。結果を図3に示します。

 

図3パーキンソン病ラット（NISSL、×200）におけるNISSLの海馬神経細胞の身体に対するCistanche Destericolaの効果注：A：対照群。 B：モデルグループ。 C：サイスンチェグループ。

 

2。

 

ブランクグループと比較して、モデルグループの海馬のSOD含有量は減少しましたが、MDA含有量は増加しました。モデルグループと比較して、Cistanche Destercolaグループの海馬のSOD含有量は増加し、MDA含有量は減少しました。表1を参照してください。

 

タブ。パーキンソン病ラットの海馬における芝とMDAの含有量に対するサイスンチェデザイトコラの1つの効果

グループ	芝（pg/ml）	MDA（pg/ml）
コントロール	12.36±2.75	2.85±0.83
モデル	2.75±0.83*	9.95±0.37*
rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

注：コントロールグループと比較 *p<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5パーキンソン病ラットの海馬におけるKEAP1、NRF2、およびHO -1タンパク質の発現に対するCistanche Destericolaの効果

ウエスタンブロット実験の結果は、モデル群のラットの海馬におけるNrf2およびHo -1タンパク質の発現が減少し、Keap1タンパク質の発現が増加することを示した。モデル群と比較して、Cistanche Destercolaグループのラットの海馬におけるNrf2およびHo -1タンパク質の発現は増加し、Keap1タンパク質の発現は減少しました。図4と表2を参照してください。

図4パーキンソン病ラットの海馬におけるKEAP1、NRF2、およびHO -1の発現に対するCistanche Destericolaの効果

注：A：コントロールグループ。 B：モデルグループ。 C：サイスンチェグループ

 

 

タブ。 2パーキンソン病ラットの海馬におけるKEAP1、NRF2、HO -1の発現に対するCistanche Destericolaの2つの効果

 

グループ	Keapl	NRF2	ho -1
空白のグループ	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
モデルグループ	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
ポジティブグループ	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

注：コントロールグループと比較して、 *p <{{0}}。05;モデルグループと比較して、#P <0.05。