シスタンチェデゼルティコーラ抽出物は、骨芽細胞の骨形成を増加させる
Mar 05, 2022
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李孝真央ある、シンチーホアンb、チェンミン・スーc、ティンユンホーある、ウー・チーミンある、チェン・ウェンチーd,イーチンフォンa,eとチーシン・タンf,c
要約
目標：の効果を検討したチスタンチェ・デゼルティコーラ・マー.(CD)培養骨芽細胞による骨形成に関する。メソッド石灰化結節形成アッセイを用いて、骨形成に対するCDのインビトロ効果を調べた。アルカリホスファターゼ(ALP)、骨形成タンパク質(BMP)-2、およびオステオポンチン(OPN)mRNA発現を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により分析した。CD抽出物の作用機序をウエスタンブロッティングを用いて調べた。CD抽出物のインビボ抗骨粗鬆症効果を卵巣摘出マウスにおいて評価した。主な調査結果CD抽出物は、培養骨芽細胞の増殖、遊走または創傷治癒に影響を及ぼさなかったが、ALP、BMP-2、およびOPN mRNAおよび骨石灰化を増加させた。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)または核因子(NF)-kB阻害剤は、CD抽出物誘導性骨形成およびALP、BMP-2、およびOPN発現を減少させた。しかしながら、CD抽出物は破骨細胞形成に影響を及ぼさなかった。さらに、CD抽出物は、インビボでの卵巣摘出術によって誘発される骨量減少を予防した。結論CDは、骨粗鬆症の治療のための新規な骨形成剤であり得る。
紹介
骨は、「骨リモデリング」と呼ばれる再生と修復の連続的なプロセスを受けるいくつかの細胞型で構成される複雑な組織です。骨のリモデリングを担う2つの主要な細胞型は、骨を再吸収する破骨細胞と、新しい骨を形成する骨芽細胞である。骨リモデリングは、いくつかの全身ホルモン(例えば、副甲状腺ホルモン、1,25−ヒドロキシビタミンD3、性ホルモン、およびカルシトニン)および局所因子(例えば、一酸化窒素、プロスタグランジン、成長因子、およびサイトカイン)によって調節される。[1]
骨粗鬆症は、骨の再吸収および形成が協調せず、過剰な骨破壊が骨構築を超える場合に生じる。骨粗鬆症の現在の治療法には、破骨細胞活性を阻害することによって骨量を維持する骨吸収阻害剤であるビスホスホネート、カルシトニン、およびエストロゲンが含まれる。しかし、骨量の増加または回復におけるこれらの薬物の効果は比較的小さく、確かに年間2%以下である。したがって、新しい骨形成を刺激し、確立された骨粗鬆症の特徴である線維柱帯マイクロアーキテクチャの変化を矯正するテリパラチドなどの骨構築剤が必要である。[4,5] 新しい骨形成は主に骨芽細胞の機能であるため、骨芽細胞系譜の細胞の増殖を増加させるか、または骨芽細胞の分化を誘導することによって作用する薬剤は、骨形成を増強することができる。[5,6]
骨粗鬆症のメカニズムは不明のままですが、骨形成タンパク質(BMP)などの骨成長因子の利用可能性または効果の低下に関連している可能性があります。BMPは、トランスフォーミング成長因子-bスーパーファミリーに構造的に関連しており、もともとはげっ歯類の異所性骨形成を誘導する能力によって同定された[7]。BMPはアルカリホスファターゼ(ALP)活性を刺激し、プロテオグリカン、コラーゲン、オステオポンチン(OPN)の合成により骨形成と骨細胞分化に重要な役割を果たしている[8]。最近の研究では、骨粗鬆症とBMP-2、ALP、OPN遺伝子の特定の多型との関連が発見され、骨粗鬆症の発症と関連していることが示唆された[9]。[10]
シスタンチェ・デゼルティコーラ・マ。(Orobanchaceae、CDと略記)は中国の天然ハーブで、その鎮静剤、鎮痛剤、免疫刺激性のために治療薬として伝統医学で広く使用されています。現代の薬理学的研究は、CD抽出物が免疫を刺激し[12]、フリーラジカルを捕捉し[13]、スーパーオキシドジスムターゼの活性を増加させることができることを示している。抗炎症剤および抗酸化剤は、骨形成の増加および/または骨吸収の抑制によって骨粗鬆症を治療する可能性を秘めている。[15,16] しかしながら、骨細胞機能に対するCDの効果はまだ決定されていない。ここでは、CD抽出物が培養骨芽細胞の増殖、遊走、または創傷治癒活性に影響を及ぼさなかったが、ALP、BMP-2、およびOPN発現および骨石灰化を増加させたことを報告している。さらに、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)および核因子(NF)-kBシグナル伝達経路が、CD媒介性の遺伝子発現および骨石灰化の増加に関与している可能性があることを示す。対照的に、CD抽出物は、インビトロで骨細胞形成を抑制しなかった。注目すべきことに、CD抽出物によるマウスの治療は、インビボでの卵巣摘出術によって誘発される骨損失を予防した。したがって、我々のデータは、CDが骨粗鬆症の治療のために骨形成を刺激するために使用され得ることを示唆している。
シスタンチェ・デゼルティコーラ
材料と方法
シスタンチェ・デゼルティコーラ抽出物および材料
CD抽出物は、荘松宗製薬会社(台湾高雄市)から購入した。CDの抽出および単離は、前述のように追跡した(スペクトルデータに基づいて、β−シトステロール、ダウコステロール、コハク酸、トリアコンタノール、アクテオシド、ベタイン、および多糖を含む化学組成を同定した)。p-細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)、ERK、p-p38、p38、p-c-Jun N末端キナーゼ(JNK)、JNK、p-p65、およびp65に特異的なウサギポリクローナル抗体は、サンタクルーズバイオテクノロジー(米国サンタクルーズ)から購入した[17]。オステオカルシンELISAキットは、バイオソース・テクノロジー(ベルギー、ニヴェル)から購入した。I型コラーゲンELISAキットのC末端テロペプチドをCross Laps(デンマーク、Herlev)から入手した。p38ドミナントネガティブ変異体は、J. Han博士(米国ダラス、サウスウェスタンメディカルセンター)によって提供されました。JNKドミナントネガティブ変異体は、M. Karin博士(カリフォルニア大学サンディエゴ校、米国)によって提供されました。ERK2ドミナントネガティブ変異体は、M. Cobb博士(サウスウェスタンメディカルセンター)によって提供されました。他のすべての試薬は、シグマ・アルドリッチ(米国セントルイス)から入手した。
細胞培養
マウス骨芽細胞株MC3T3-E1をAmerican Type Culture Collection(ATCC;ロックビル、米国)。細胞を95%空気中で培養し、5%CO2に20mmのHEPESおよび10%の熱不活化ウシ胎児血清、2mm-グルタミン、ペニシリン(100U/ml)、およびストレプトマイシン(100mg/ml)を添加したa-MEMで培養した。
石灰化結節形成の測定
鉱化結節形成は、記載したように評価した。簡単に言うと、骨芽細胞はビタミンC(50mg/ml)とb-グリセロリン酸(10mm)を含む培地で2週間培養し、3日ごとに培地交換を行った[18]。CD抽出物と共に12日間インキュベートした後、細胞を20mmトリス緩衝生理食塩水を含む20mmトリス緩衝生理食塩水で2回洗浄した。
0.15 m NaCl (pH 7.4) を氷冷 75% (v/v) エタノール中で 30 分間固定し、風乾した。カルシウム沈着は、アリザリンレッドS染色を用いて決定した。簡単に言えば、エタノール固定細胞およびマトリックスを40mmアリザリンred-S(pH4.2)で1時間染色し、水で広範囲にすすいだ。結合した染色剤を10%(w/v)塩化セチルピリジニウムで溶出し、サンプル中のアリザリンred-Sを550nmの吸光度を測定して標準曲線と比較することにより定量した。アリザリン赤-Sの1モルは、約2モルのカルシウムに選択的に結合する。
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
TRIzolキット(MDBio社、台北、台湾)を用いて骨芽細胞から全RNAを抽出した。逆転写は、2mgの総RNAおよびオリゴ(dT)プライマーを用いて行った。[19,20]定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、TaqMan®ワンステップPCRマスターミックス(アプライドバイオシステムズ、カールスバッド、米国)を用いて行った。全cDNAを配列特異的プライマーおよびTaqman®プローブと共に添加した(反応25mlあたり100ng)。すべての標的遺伝子プライマーおよびプローブは、内部コントロールとしてb-アクチンを含む商業的に購入された(アプライドバイオシステムズ)。qPCRアッセイは、Ste−pOnePlus配列検出システム(アプライドバイオシステムズ社)上で3連で実施した。サイクル条件は、95°Cで10分間のポリメラーゼ活性化に続いて、95°Cで15秒間、60°Cで60秒間を40サイクル行った。閾値を非鋳型対照バックグラウンドより上方に設定し、標的遺伝子増幅の直線段階内で、転写産物が検出されたサイクル数(CTと表記)を計算した。
ウェスタンブロット分析
細胞溶解物は、前述のように調製した。タンパク質はSDS−PAGEによって分解され、イモビロンポリフッ化ビニル膜(ミリポア、ビリカリカ、米国)に転写された[21]。ブロットを4%ウシ血清アルブミンで室温で1時間ブロッキングし、次いでp−65またはp−p65(1:1000)に対するウサギ抗ヒト抗体で室温で1時間プローブした。3回の洗浄後、ブロットをペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギ二次抗体(1:1000)と共に室温で1時間インキュベートした。ブロットを、X−OMAT LSフィルム(イーストマンコダック、ロチェスター、米国)を用いた増強化学発光によって視覚化した。
卵巣摘出術誘発性骨粗鬆症
4週齢の雌ICRマウス、22〜28gを、本研究に使用した。マウスをトリクロロアセトアルデヒド(100mg/kg)麻酔下で両側的に卵巣切除し、対照マウスを比較のために偽手術(Sham)した。骨塩密度および骨塩量は、種々の濃度のCD抽出物を2日毎に4週間経口投与した後に測定した。全身骨塩密度および骨塩含有量は、二重エネルギーX線吸収光度計(DEXA;XR-26;ノーランド、フォートアトキンソン、米国)は、前述のように小さな被験者のためのモードを使用する。すべてのプロトコルは機関のガイドラインに準拠しており、中国医科大学の動物ケア委員会によって承認された[18,23]。
統計解析
統計解析は、Prism 4.01soft-wareを用いて行った。(GraphPad Software Inc., San Diego, USA).与えられた値はSEM±平均であり、2つのサンプル間の統計分析はスチューデントのt検定を使用して実施された。3つ以上のグループの統計的比較は、ボンファーロニのポストホック検定を伴う一元配置分散分析を用いて実施した。いずれの場合も、P< 0.05="" was="" considered="">
シスタンチェ・デゼルティコーラ抽出物
業績
シスタンチェ・デゼルティコーラ抽出物は骨芽細胞による骨石灰化を増加させる
CD抽出物を24時間または48時間添加しても、MTTアッセイにおけるマウス骨芽細胞MC3T3−E1細胞の増殖に影響を及ぼさなかった(データは示さず)。骨芽細胞分化は細胞の増殖と遊走を伴う複雑な過程であるため、CD抽出物で処理した後のMC3T3-E1細胞の遊走能も試験した。トランスウェルおよび創傷治癒アッセイを用いて、CD抽出物が骨芽細胞遊走に影響を及ぼさなかったことを見出した(データは示さず)。石灰化結節の形成は、骨芽細胞成熟のマーカーの1つである。アリザリンレッドS染色は、骨芽細胞をビタミンC(50mg/ml)およびb-グリセロリン酸(10mm)を含む培地で2週間培養すると石灰化結節が形成され、CDの添加により濃度依存的に増加したことを示した(図1a)。したがって、CD抽出物は培養骨芽細胞によって骨結節形成を誘導したが、それらの増殖または遊走は誘導しなかった。また、RANKL誘導性破骨細胞形成におけるCD抽出物の役割についても検討したが、効果は認められなかった(データは示さず)。
シスタンチェ・デゼルティコーラ抽出物は、培養骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ、骨形成タンパク質-2、およびオステオポンチン発現を増加させる
分化した骨芽細胞は、高レベルの酵素発現と相関するALP活性の上昇を示す。[18] CD抽出物を72時間にわたって処理すると、骨芽細胞ALP活性が有意に増加することを見出した(図1b)。骨芽細胞分化におけるBMP-2、ALP、およびOPNの重要な役割を考慮して、CD抽出物がBMP-2、ALP、およびOPN発現を調節することによって骨芽細胞分化にその効果を発揮するかどうかを試験した。CD抽出物による細胞の処理は、ALP、BMP-2、およびOPNのmRNA発現を濃度依存的に増加させ(図1c)、CD抽出物がALP、BMP-2、およびOPN発現をアップレギュレートすることによって骨芽細胞の分化を誘導したことを実証する。
シスタンチェ・デゼルティコーラ抽出物は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路を介して骨結節形成を増加させる
MAPKが骨形成に重要な役割を果たしていることが報告されているので[24,25]、次にこのシグナル伝達経路がCD抽出物誘発骨石灰化に関与しているかどうかを調べた。ERK阻害剤U0126、p38阻害剤SB203580、またはJNK阻害剤SP600125による細胞の前処理は、CD抽出物を減少させ、骨石灰化を増加させた(図2a、3a、および4a)。さらに、阻害剤はまた、CD抽出物誘導性ALP、BMP-2、およびOPN発現を遮断した(図2b〜4c)。ERK2、p38、またはJNK変異体による細胞のトランスフェクションは、ALP、BMP-2、およびOPN mRNA発現におけるCD抽出物増加を減少させた(図2c、3c、および4c)。次に、CD抽出処理後のERK、p38、およびJNK活性化を直接調べた。CD抽出物との細胞のインキュベーションは、ERK、p38、およびJNKリン酸化を誘導した(図2d、3d、および4d)。したがって、ERK、p38、およびJNKは、骨芽細胞のCD治療によって誘導される骨形成の増加を媒介する。
シスタンチェ・デゼルティコーラ抽出物は、核因子-kB経路を介して骨結節形成を増加させる
前述のように、NF-kB活性化は骨形成に必要である。我々は次に、NF-kB活性化がCD抽出物誘発骨石灰化に関与するかどうかを決定するために、カルバイオケム(ダルムシュタット、ドイツ)から購入したNF-kB阻害剤ピロリジンジチオカルバメート(PDTC)およびN-トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン(TPCK)で骨芽細胞を処理した。図5aは、PDTCまたはTPCKによる骨芽細胞の前処理がCD抽出物誘発骨結節形成を阻害し、またALP、BMP-2およびOPN発現の増加を減少させたことを示す(図5bおよび5c)。NF-kB p65サブユニットのリン酸化は、NF-kB活性化の指標である。[28] これと一致して、CD抽出物が骨芽細胞におけるp65リン酸化を増加させることを見出した(図5d)。これらの結果は、NF-kB活性化がCD抽出物誘導性ALP、BMP-2、およびOPN発現および骨結節形成に重要であることを示した。
卵巣摘出マウスにおけるシスタンチェ・デゼルティコーラ抽出物による骨量減少の抑制
骨量減少に対するCD抽出物の効果を調べるために、卵巣摘出術により雌マウスにおいて骨粗鬆症を誘導した。予想通り、卵巣摘出マウスは、全身骨塩密度および骨塩含有量の減少を示した(図6aおよび6b)。CD抽出物による4週間の処理は、用量依存的に骨塩密度および骨塩含有量の損失を抑制した(図6aおよび6b)。ALPの血中濃度は、骨芽細胞活性を反映することができる。[29]図6cに示すように、CD抽出物は卵巣摘出術により誘導される血清ALP活性の低下を抑制した。加えて、CD抽出物はまた、骨形成のマーカーであるオステオカルシンのレベルを増加させ、そして骨吸収のマーカーであるI型コラーゲンのC末端テロペプチドのレベルを低下させた(図6dおよび6e)。したがって、これらの知見は、インビボでの骨量減少の予防におけるCD抽出物の効力および有効性を支持する。
議論
シスタンチェ・デゼルティコーラ中国のネイティブハーブであるMaは、その鎮静剤、鎮痛剤、および免疫刺激活性のために、様々な治療的治療のために伝統医学で広く使用されている。[11–15]ここで、CD抽出物が培養骨芽細胞において骨石灰化を誘導することを示したが、それらの細胞遊走または増殖には影響しなかった。さらに、ALP、BMP-2、OPNは、ERK、p38、JNK、NF-kBの活性化を必要とするCD抽出物誘導シグナル伝達の標的タンパク質であることを見出した。
骨は、継続的に再生と修復のプロセスを受けているいくつかの細胞型で構成される複雑な組織です。骨の再吸収と形成が不均衡になると、骨の破壊が骨の形成を上書きし、骨粗鬆症が生じる[30]。[30] 我々は、CD抽出物の抗骨粗鬆症効果を調べるために卵巣摘出マウスを用いた。卵巣摘出マウスは、全身骨塩密度および骨塩含有量を減少させていたが、これはCD抽出物による処理によって緩和された。CD抽出物はまた、骨形成マーカーALPおよびオステオカルシンの血清レベルを増加させた。したがって、CDは、生体内の卵巣摘出術によってもたらされる骨量減少を防止する骨形成剤である。
骨粗鬆症のメカニズムは完全には明らかではありませんが、ALP、BMP-2、OPNなどの骨成長因子の利用可能性の低下または効果の低下に関連している可能性があります。これら3つの因子は骨形成とリモデリングの過程において重要な役割を果たしており[31]、骨芽細胞分化の刺激は主にALP、BMP-2およびOPNの発現増加によって特徴付けられることが十分に文書化されている。この研究では、CD抽出物がALP、BMP-2およびOPN発現を増加させ、骨石灰化を増強することを見出した[32]。したがって、CD抽出物は、ALP、BMP-2、およびOPNの発現をアップレギュレートすることによって骨形成を部分的に媒介する。
p38が骨芽細胞の分化中のALP発現の調節に関与することが報告されている。同様に、ERK1/2は骨芽細胞の増殖および分化に重要である。JNKは破骨細胞形成に関与している[34]。我々はここで、CD抽出物がERK、p38およびJNKリン酸化を誘導し、これらの酵素の阻害剤がCD抽出物媒介性骨石灰化の増強に拮抗することを示し、ERK、p38およびJNK活性化が骨芽細胞によるCD抽出物誘発骨形成において義務的な役割を果たすことを示唆した。加えて、酵素阻害剤および優性陰性変異体のERK、p38およびJNKはCD抽出物増強ALP、BMP−2およびOPN発現を減少させた。これらのデータは、骨芽細胞におけるCD抽出物によって引き起こされるALP、BMP-2およびOPN発現および成熟の増加にERK、p38およびJNK経路の活性化が必要であることを示唆している。ERKは骨芽細胞の増殖および分化を増加させることが報告されている。[34,35] しかしながら、骨芽細胞増殖に対するCD抽出物の効果は検出されなかった。したがって、他の経路は、CD抽出物刺激後のERK効果を打ち消したか、または増殖に必要であり得る。これに関して、PI3KおよびAkt阻害剤はまた、CD抽出物誘発骨石灰化およびALP、BMP-2またはOPN mRNA発現を減少させることを見出した(データは示さず)。したがって、これらの経路は、CD抽出物誘導性骨形成に必要であり得る。
NF-kBは骨における骨芽細胞機能を制御することが示されている。この研究の結果は、NF-kB活性化がCD抽出物誘発骨石灰化およびALP、培養骨芽細胞におけるBMP-2およびOPN発現に寄与し、NF-kB依存性シグナル伝達経路(PDTCおよびTPCK)の阻害剤がCD抽出物誘発骨石灰化およびALP、BMP-2およびOPN発現を阻害することを示している。p65は、いくつかのシグナル伝達経路において様々なキナーゼによってSer536でリン酸化され、これはp65トランス活性化能を増強する。この研究の結果は、CD抽出物がp65のリン酸化を増加させることを示した[38]。まとめると、これらの結果は、NF-kB活性化が培養骨芽細胞におけるCD抽出物誘導骨形成に必要であることを示唆している。我々はまた、ERK、p38およびJNK阻害剤がCD抽出物誘導NF-kBルシフェラーゼ活性を逆転させること(データは示さず)、これらの酵素がCD抽出物誘導NF-kB活性化の上流メディエーターであることと一致した。したがって、CD抽出物は、ERK/p38/JNK/およびNF-kB経路を介して骨形成を誘導する。
結論
この研究は、CD抽出物が骨芽細胞の分化および成熟を誘導するが、増殖または遊走を誘導しないことを実証した。CD抽出物はまた、ALP、BMP-2およびOPN発現ならびに骨石灰化を増加させた。我々は、ERK、p38、JNKおよびNF-kB経路がCD抽出物媒介性骨形成ならびにALP、BMP-2およびOPN発現に関与していることを示した。さらに、CD抽出物は卵巣摘出術により誘導される生体内骨量減少を予防した。したがって、CDは、骨粗鬆症性疾患の治療における骨形成を刺激するのに有益であり得る。
