Cistanche Deserticola多糖類は、腸内細菌叢-脳軸を回復することにより、老化モデルマウスの認知機能低下を緩和します
Mar 05, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Yuan Gao 1、*、Bing Li 1、*、Hong Liu 1、Yajuan Tian 2、Chao Gu 1、Xiaoli Du 1、Ren Bu 1、Jie Gao 1、Yang Liu 1、Gang Li 1
概要
最近の証拠は、腸内細菌叢-脳軸の変化が加齢に伴う認知障害を引き起こす可能性があることを示唆しています。 本研究では、マウスへのD-ガラクトースの長期投与が認知機能低下、腸内微生物性腸内毒素症、末梢炎症、および酸化ストレスを誘発することを観察しました。 加齢に伴う認知機能低下のこのモデルでは、ニクジュヨウ多糖類（CDPS）腸内微生物の恒常性を回復することにより、D-ガラクトース処理マウスの認知機能を改善し、それによって酸化ストレスと末梢炎症を軽減しました。 これらの老化モデルマウスにおけるCDPSの有益な効果は、抗生物質による腸内細菌叢の除去またはシクロホスファミドによる免疫抑制によって無効になりました。 血清メタボロミクスプロファイリングは、クレアチニン、バリン、L-メチオニン、o-トルイジン、N-エチルアニリン、尿酸、およびプロリンのレベルがすべて老化モデルマウスで変化したが、CDPSによって回復したことを示した。 これらの発見は、CDPSが腸内細菌叢の恒常性を回復することにより、マウスのD-ガラクトース誘発性老化モデルの認知機能を改善し、アミノ酸の不均衡、末梢炎症、および酸化ストレスを軽減することを示しました。 したがって、CDPSは、記憶障害および学習障害のある患者、特に腸内微生物性腸内毒素症に関連する患者に治療の可能性を示します。
ニクジュヨウ多糖類
前書き
D-ガラクトース（D-gal）とベリリウム塩の長期投与は、実験動物モデルとin vitro初代細胞培養で老化を誘発し、自然な老化プロセスの根底にあるメカニズムを特定するために使用されます[1–4]。 以前の研究では、D-ガラクトース誘発老化モデルマウスの認知機能低下は、脳内の神経成長因子（NGF）タンパク質レベルの低下と活性酸素種（ROS）の増加に関連しており、どちらも海馬ニューロンの変性を引き起こし、神経新生[3、4]。 最近の研究では、老化の過程でヒトの腸内細菌叢の組成と数が大幅に変化することも示されています[5]。
ニクジュヨウは主に中国北西部の砂漠地帯で育ち、漢方薬に使用されているハーブです。 一般に「砂漠の高麗人参」として知られています。 ニクジュヨウ抽出物には、フェニルエタノイド配糖体、イリドイド、リグノース、オリゴ糖、多糖類、アミノ酸など、いくつかの薬理学的に活性な化合物が含まれています。 これらの化合物は、抗炎症、抗酸化、抗老化、神経保護、および免疫調節の特性に関連しています[6、7]。 たとえば、Cistanchedeserticolaから抽出された多糖類は伝統的な中国医学で結腸直腸癌を治療するために使用されてきました[8]。 Chuanqiong多糖類、Ganoderma lucidum多糖類、Lycium barbarum多糖類などのいくつかの生物から、有用な生物活性を持つ広範囲の弱毒性多糖類が単離されています[9–11]。 CDA-
0 .05は、Cistanche deserticolaから分離されたガラクトグルカンで、バクテロイデス属やラクトバチルス属のいくつかの種を含む、いくつかの有益な腸内細菌の増殖を促進します[12]。
通常の老化プロセスの根底にあるメカニズムは、神経変性疾患、冠状動脈アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病（T2DM）、高血圧などのいくつかの人間の病気にも関係しています[13、14]。 最近の研究では、腸内細菌叢の変化が人間の老化に重要な役割を果たしていることが示されています[15]。 いくつかの研究は、実験マウスおよびラットへのD-ガラクトースの長期投与が通常の老化プロセスを模倣し、認知機能低下などの老化関連の表現型を研究するための有用なモデルであることを示しています[16]。 さらに、D-ガラクトース誘発性の老化モデルマウスは、腸内細菌叢の組成に変化を示します[17]。 したがって、腸内細菌叢の組成の変化がD-ガラクトース誘発老化モデルマウスの認知機能低下を引き起こす可能性があると仮定し、Cistanchedeserticola多糖類（CDPS）が腸内細菌叢の腸内毒素症を回復することによって認知機能低下を軽減できるかどうかを調査しました。
ニクジュヨウ
結果
D-ガラクトース誘発性老化モデルマウスは、認知機能低下と腸内微生物性腸内毒素症を示します
野生型（WT）マウスと、体重1kgあたり150mgのD-galで2か月間（モデルまたはMod）処理したマウスの行動パフォーマンスを、新しい物体認識とモリス水迷路（MWM）テストを使用して分析しました。 新規物体認識テストの優先指標値は、WTグループのマウスと比較してModグループのマウスで大幅に減少しました（図1A、1B）。 MWMテストの結果は、6日後の逃避潜時がWTグループと比較してModグループで有意に増加したことを示しました（図1C、1D）。 さらに、ターゲット象限内のターゲットプラットフォームの交差と水泳時間は、WTグループと比較してModグループで大幅に短縮されました（図1E、1F）。 これらの結果は、D-gal誘発老化モデルマウスの学習能力と記憶能力の有意な低下を示しました。
次に、糞便サンプルからの16SリボソームRNA（rRNA）シーケンスデータを使用して、マウスのModおよびWTグループの糞便サンプルにおける腸内微生物門、属および種の存在量と組成の違いを分析しました。 WTおよびModグループのマウスの主な腸内細菌叢はFirmicutesとBacteroidesでした。 ただし、WTグループと比較してModグループでは、バクテロイデスの存在量が大幅に減少し、ファーミキューテスの存在量が大幅に増加しました（図2A）。 次に、線形判別分析（LDA）を実行してLDA効果サイズ（LEfSe）スコアを決定し、続いてクラスカル・ウォリス検定とウィルコクソン検定を実行して、WTグループとModグループのマウスにおけるさまざまな分類群の相対的な存在量を評価しました。 LDAの結果を図2Bに示します。 さらに、WTおよびモデルグループのBacteriodesおよびFirmicutes門に属するさまざまな属および種の異なる濃縮を示すクラドグラムを作成しました（図2C）。 全体として、我々の結果は、D-ガラクトース誘発性の老化モデルマウスにおける認知能力の障害と腸内微生物の腸内毒素症を示した。
CDPS治療は、D-gal誘発老化モデルマウスの認知能力を改善します
CDPS治療がD-gal誘発老化モデルマウスの認知機能低下を軽減するかどうかを分析しました。 間に
投与2ヶ月後、1日おきに体重を測定した。 モデルとマウスのCDPSグループの体重は類似していた（図3A）。 最後の投与後に行動実験を行います。 新規物体認識およびモリス水迷路試験の結果は、短期記憶がマウスのモデルグループと比較してマウスのCDPSグループで有意に高かったことを示しました。 CDPSグループのマウスの長期記憶は、モデルグループのマウスと比較して高かったが、統計的に有意ではなかった（図3B、3C）。 これは、CDPS治療がD-gal治療マウスの短期間の物体認識記憶の喪失を無効にしたことを示唆しました。
これらのマウスの空間学習と記憶はモリス水迷路試験によって評価され、その結果は、CDPSグループのマウスの逃避潜時がWTグループのマウスに匹敵し、Modグループのマウスよりも有意に短いことを示しました（図3D ）。 さらに、脱出潜時は、モデルグループと比較して、CDPS投与後6日目で有意に短かった（図3E）。 対象象限内の水泳時間は、モデルグループと比較してCHグループとCMグループで有意に長かった。 CLグループはモデルグループよりも高いですが、統計的有意性はありません（図3F）。 さらに、プラットフォーム交差の数は、モデルグループと比較してCMおよびCLグループで有意に多かった。 ただし、CHグループはモデルグループよりも高く、統計的有意性はありません（図3G）。 これらの結果は、CDPS治療がD-gal誘発老化モデルマウスの空間学習と記憶を改善したことを示した。
CDPS治療は、D-ガラクトース老化モデルマウスの腸内細菌叢組成の恒常性を回復します
単糖類と多糖類は、バクテリアの成長に必要な必須栄養素です[18–21]。 CDPSが腸内細菌叢の組成を調節することも報告されています[22]。 したがって、CDPS治療が、WT、モデル、およびCDPSグループのマウスからの糞便サンプルの16S rRNAシーケンスデータを評価することにより、モデルグループのマウスの腸内微生物性腸内毒素症を軽減するかどうかを分析しました。
まず、アルファダイバーシティインデックスを計算して、これらのグループ間の全体的な糞便微生物叢の豊富さと構造の違いを評価しました。 観察された種、シャノン、チャオ1、ACE、シンプソン指数などのアルファ多様性（-diversity）指数を分析して、さまざまなマウスグループの糞便サンプル中のさまざまな細菌種の組成の変化を判断しました。 多様性（観察された種、シャノン、チャオ1、ACE、およびシンプソンのインデックス）インデックスは、モデルグループと比較してマウスのWTおよびCDPSグループで高かったが、統計的有意性は、CM間のチャオ1インデックス値でのみ観察された。グループとModグループ。 CDPSを投与すると、微生物叢の豊富さが増すことが示されました（図4A–4E）。 次に、多様性指標を分析して、非計量的多次元尺度構成法（NMDS）、主成分分析（PCoA）、および主成分分析（主成分分析）を使用して、マウスのWT、モデル、およびCDPSグループ間の腸内微生物種の違いを特定しました。 PCA）。 PCAは、老化プロセス中にモデルグループのマウスの腸内微生物組成に変化を示しました。これには、寸法の縮小やパターンと傾向の維持が含まれます（図4F）。 WT、モデル、およびCDPSグループ間の糞便微生物叢の違いは、16S rRNA遺伝子の重み付けされていないUniFrac距離のPCoAに基づいて特定されました（図4G）。 クラスタリング分析では、モデルグループとWTおよびCDPSグループの間でNMDSに有意差が見られました（図4H）。
腸内細菌叢の上位10門を評価したところ、バクテロイデス門の存在量は、モデルグループと比較してCH、CM、およびCLグループで有意に高かったことがわかりました（図4I）。 これは、CDPSがD-gal処理マウスの腸内細菌叢の恒常性を回復したことを示唆しています。 クラドグラムは、WT、モデル、およびCDPSグループのBacteriodesおよびFirmicutes phylaに属するさまざまな属および種の異なる濃縮を示しました（図4J）。 ヒートマップに示されているように、CDPS処理は、Thermoplasmata、Bacilli、未確認の放線菌、Fusobacteriia、および未確認のElusimicrobiaの相対的な存在量を減らし、Methanobacteria、Spirochaetia、Deltaproteobacteria、未確認の_ Deferribacteres、Mollicuteの相対的な存在量を増やしました。 、Erysipelotrichia、およびモデルグループと比較した未確認の_シアノバクテリア（図4K）。 これらの結果は、CDPS治療がD-gal誘発老化モデルマウスの腸内細菌叢の恒常性を有意に回復させたことを示した。
CDPS治療は、酸化ストレスを軽減することにより、D-gal誘発性老化モデルマウスの神経変性を緩和します
次に、炎症性サイトカイン（IL -2とTNF-）、および抗炎症性サイトカイン（IL-4とIL-10の血清レベルを分析することにより、炎症に対するCDPSの影響を分析しました。 ）マウスのさまざまなグループで。 モデルと比較して、IL -2およびTNF-の血清レベルは有意に低く、IL-4およびIL-10の血清レベルはCH、CM、およびCLグループで有意に高かった。グループ。 CDPSには抗炎症作用があることが示されています（図5A–5D）。
酸化ストレスは、活性酸素種（ROS）の生成の増加によって引き起こされ、老化を促進する主な要因の1つです[23]。 したがって、抗酸化酵素SODと脂質過酸化生成物マロンジアルデヒド（MDA）の血清レベルを評価することにより、D-gal誘発老化マウスモデルの酸化ストレスに対するCDPSの影響を分析しました。 WTグループと比較してModグループではMDAの血清レベルが有意に高く、SODの血清レベルが有意に低下しましたが、CDPS治療はこれらの効果を逆転させました（図5E、5F）。 これらの結果は、酸化ストレスがD-gal誘発老化モデルマウスで上昇したが、CDPS治療によって減少したことを示した。
さらに、高度酸化タンパク質生成物（AOPP）、直接脂質過酸化（LPO）、MDAのレベル、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）などの抗酸化酵素の活性を分析することにより、脳組織の酸化ストレスレベルを評価しました。 ）および脳組織ホモジネート中のスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）。 Modグループのマウスの脳は、WTグループと比較してSODおよびGSH-PXの活性が大幅に低下し、AOPP、LPO、およびMDAのレベルが大幅に上昇しましたが、これらの効果はCH、CM、およびCLグループで逆転しました（図6A– 6E）。
さらに、D-gal誘発老化モデルマウスの脳に対するCDPSの保護効果を評価するために、H＆EおよびNissl染色で脳切片の組織学的染色を行いました。 Modグループのマウスは、WTグループと比較して、ニューロンの数と体積の有意な減少、ニューロン間のギャップの増加、ニューロンの不規則な配置、および海馬CA1領域の核濃縮を示しましたが、これらの病理学的変化はCDPS治療によって有意に減少しました（図6F）。 これらの結果は、CDPS治療がD-gal誘発老化モデルマウスの酸化ストレスと脳病変を有意に減少させたことを示しました。
CDPS治療は、D-gal誘発モデルマウスの腸内微生物恒常性を維持することにより、末梢炎症と酸化ストレスを軽減します
次に、腸内細菌叢の組成の変化が、加齢中の末梢炎症と酸化ストレスの増加に関連しているかどうかを分析しました。 これに向けて、トリプル抗生物質カクテル（ABXグループ）またはシクロホスファミド（Cyグループ。材料と方法も参照）を使用して、腸内細菌叢を切除するか、CDPS処理した老化モデルマウスの免疫抑制を誘導しました。 抗生物質治療は、老化モデルマウスにおけるCDPS治療の有益な効果を無効にしました。 CDPS治療群と比較して、ABX群マウスでは学習と記憶の障害（図7A）、および腸内細菌叢の組成の変化（図7B、7C）が観察されました。 上記の結果は、CDPSの投与でさえ、腸内細菌叢を変化させた後のマウスの学習能力と記憶能力を高めることができないことを示しています。 さらに、CDPSグループと比較してABXグループのマウスの脳と血清で炎症性サイトカインのレベルの上昇が観察されました（図7D–7N）。 ABX群とCY群の結果は、腸内細菌叢と免疫機能が破壊された後、CDPSの投与でさえマウスの学習能力と記憶能力を改善できないことを示しました。 これらの結果は、CDPS治療が腸内毒素症を予防することにより、D-gal誘発老化モデルマウスの末梢炎症、酸化ストレスおよび認知機能低下を減少させることを示唆しました。
次に、免疫抑制薬であるシクロホスファミド[24]を使用して、CDPSの有益な効果における炎症の役割を決定しました。 シクロホスファミドで治療したCDPSマウス（Cyグループ）は、野生型およびCDPSグループのマウスと比較して、学習能力と記憶能力の低下、腸内細菌叢の組成の変化、脳と血清の炎症性および抗炎症性サイトカインの異常なレベルを示しました。 ただし、モデルやABXグループと比較して意味はありません。 （図7A– 7N）。 これらのデータは、腸内細菌叢の組成の変化が、D-gal誘発性の老化モデルマウスの末梢炎症を増加させることを示しています。
CDPSは、アミノ酸代謝を調節することにより、D-galによる老化を防ぎます
宿主の免疫系は、腸内細菌叢によって生成される代謝物の影響を受けます[25]。 糞便代謝物は、腸内微生物代謝および腸内微生物組成の機能的読み出しを表しています[26]。 さらに、腸内細菌叢の代謝物は血液循環に入り、宿主の代謝と健康に影響を与えます[26、27]。 fWT、Mod、およびCDPSマウスの血清サンプルで合計1058の代謝物が同定されました。 次に、BioCyc、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Human Metabolome Database（HMDB）を使用してこれらの代謝物を分析し、WTグループと比較してModグループで65の代謝物が異なって発現していることを発見しました。 さらに、8つの代謝物（クレアチニン、バリン、L-（-）-メチオニン、o-トルイジン、N-エチルアニリン、尿酸、プロリン、およびフェニルアラニン）のレベルが、WT、Mod、およびCDPSグループ間で大幅に異なることがわかりました。 。 MetaboAnalyst [28、29]を使用したこれら8つの代謝物の経路濃縮分析は、これらの代謝物がアルギニン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、およびプリン代謝に関連していることを示しました（図8A、8B）。 WTグループのMODグループとCDPSグループの7つの異なる代謝物。
次に、アミノ酸代謝の変化が腸内細菌叢の組成の変化に関連しているかどうかを分析しました。 WT、Mod、およびCDPSグループの7つの異なる代謝物（クレアチニン、バリン、L-（-）-メチオニン、o-トルイジン、N-エチルアニリン、尿酸、およびプロリン）がABX、Cy、 WTおよびCDPSグループと比較したModグループ。 さらに、ABXグループとCyグループの間に重要性はありません（図8C）。 最後に、探索するために、代謝差と他の老化関連疾患との間に相関関係があります。 MetaboAnalystデータベースを使用して、これら7つの差次的に発現する代謝物とヒトの疾患との相関関係を分析し、これらの代謝物がアルツハイマー病に関連していることを発見しました（p =0。00173;図8D、8E）。 全体として、これらのデータは、CDPSがアミノ酸代謝を調節することによってD-galによって誘発される老化から保護することを示唆しました。
討論
認知機能の進行性の低下は、老化の特徴です。 以前の研究では、CDPS治療により、老化モデルマウスの学習と記憶が大幅に改善されることが示されました[30–33]。 この研究では、CDPS治療が、D-gal誘発老化モデルマウスの腸内微生物恒常性の回復を通じて末梢炎症と酸化ストレスを阻害することにより、認知機能を改善することを実証しました（図9）。 Cistanche多糖類を与えられたSprague-Dawleyラットは、有益な腸内細菌の増殖の増加と腸内微生物の多様性の強化を示しました[34]。 CDA -0。05、Cistanche中性多糖類は、プロバイオティクス乳酸桿菌の成長を改善しました[22]。 これらのデータは、Cistanche多糖類が腸内細菌の恒常性を改善したことを示唆しています。
この研究では、CDPSが抗炎症作用を持ち、バクテロイデス門、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門などの腸内細菌属の存在量を調節することにより、老化モデルマウスの認知能力を改善することを実証しました。 したがって、CDPは、腸内細菌叢の組成を再形成することにより、加齢に関連する疾患に対して治療的に有益である可能性があります[35、36]。 さらに、以前の研究では、血清および結腸の炎症性サイトカインのレベルが、バクテロイデス門、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門などの細菌属の相対的な存在量と関連していることが示されています[37、38]。 さらに、腸内微生物の組成は、いくつかのサイトカインの循環レベルを調節することによって脳機能を調節します[39–43]。 私たちの結果は、CDPS処理により、テルモプラズマ、バチルス、未確認の放線菌、フソバクテリア、および未確認のエルシミクロビウムの相対的な存在量が減少し、メタノバクテリア、スピロケチア、デルタプロテオバクテリア、未確認の_デフェリバクター、モリクテス、タウム古細菌の相対的な存在量が増加したことを示しました。エリュシペロトリキア、および未確認の_シアノバクテリア。
腸内微生物の代謝物は血流に放出され、宿主の健康と代謝を調節します[26、27]。 腸内微生物の代謝物は、腸内微生物の組成の変化に伴って変化する糞便中の代謝物の組成を評価することで推定できます[44]。 最近の研究では、シトルリン、プロリン、アルギニン、アスパラギン、フェニルアラニン、スレオニンの血漿レベルがアルツハイマー病などの神経変性疾患に関連していることが示されています[45、46]。 私たちの研究は、クレアチニン、バリン、L-メチオニン、o-トルイジン、N-エチルアニリン、尿酸、およびプロリンの血清レベルが、マウスのD-gal誘発性老化と関連していることを示しました。
免疫系の先天性および適応性の腕は、腸管腔表面の宿主微生物の恒常性を維持する上で重要な役割を果たします[47]。 腸内細菌叢はまた、サイトカインと代謝物を血流に放出することにより、中枢神経系（CNS）と免疫を調節する上で重要な役割を果たします[48、49]。 炎症性サイトカインは、いくつかの神経変性疾患で重要な役割を果たします[50–52]。 たとえば、加齢性黄斑変性症（AMD）と緑内障は、アミロイドの細胞外蓄積（A）と、網膜神経節細胞（RGC）における高リン酸化タウ（p-タウ）と鉄の細胞内沈着に関連しています[44]。 さらに、炎症は緑内障に関連する病因において重要な役割を果たします[53]。 視覚障害はアルツハイマー病（AD）の初期症状であり、認知機能低下が始まる前に現れます[54]。 私たちの研究は、CDPSが腸内細菌叢の恒常性を維持することによって認知機能低下と末梢炎症から保護することを示しました。
この研究にはいくつかの制限があります。 第一に、アミノ酸代謝と腸内細菌叢の組成との関係はよく知られていません。 第二に、CDPSの組成と分子構造は不明です。 したがって、腸内細菌叢-脳シグナル伝達軸を介してADを軽減するCDPSの調節的役割をさらに調査するために、将来の研究が必要です。
結論として、私たちの研究は、CDPSが腸内細菌叢の恒常性を回復し、それによってアミノ酸の不均衡、末梢炎症、および酸化ストレスを回復することにより、D-gal誘発老化モデルマウスの認知能力を改善することを示しました。 これらの発見は、CDPSが学習障害および記憶障害のある患者、特に腸内毒素症に関連する患者の潜在的な治療法であることを示唆しています。
材料および方法
CDPSの準備
約1.0洗浄したCistanchedeserticolaを40℃のオーブンで風乾し、粉砕して粗粉末にしました。 粉末を熱エタノールで3時間抽出した。 残留物をガーゼで濾過して濾液を除去し、次に水（8X）で希釈し、90℃で2時間、1.5時間、および1時間連続して還流した。各時点で、溶液を遠心分離して上澄みを分離した。茶色がかった赤色のろ液と合わせます。 次に、濾液を減圧下で濃縮し、室温に冷却し、９５パーセントエタノール（３Ｘ）にゆっくりと加え、そして４℃で２４時間放置した。 次に、溶液を６０００ｒ ／分で４℃で２０分間遠心分離した。水抽出およびアルコール沈殿を３回繰り返した後、沈殿物を収集した。 沈殿物を水中で再構成し、除タンパクし、透析し、凍結乾燥して、粗製のニクジュヨウ多糖類（CDP）を得た。 多糖類の含有量は、紫外分光光度法で評価した場合、90％以上でした。
動物のグループ化と治療
8週齢の雄昆明マウス（SCXKライセンス番号2019-0010）は、SPF Biotechnology Co. Ltd（北京、中国）から購入し、光と温度が制御された部屋に収容し、餌と水を与えました。 すべての動物実験は、内モンゴル医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。 実験は、国立衛生研究所（NIH）の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。
新しい環境に1週間適応した後、120匹のマウスを次の7つのグループに分けました。（1）野生型コントロール（WT）。 モデルグループ（150mg / Kg/日D-gal;Mod）; （3）CH：D-galと100 mg / kg CDPS; （4）CM：D-galと50 mg / kg CDPS; （5）CL：D-galと25 mg / kg CDPS; （6）ABXグループ：抗生物質+D-gal + 50 mg / Kg CDPS; （7）Cyグループ：シクロホスファミド+D-gal + 50mg /kgCDPS。
モデル、ABX、Cy、およびCDPSグループのマウスは、生理食塩水に溶解した皮下注射を受けました。
15 0 mg /kgD-galを2か月間毎日。 WT群に等量の生理食塩水を2ヶ月間皮下注射した。 CDPSグループのマウスには、1 {{1 0}} 0 mg / kg、5 0 mg / Kg、または25 mg /KgCDPSを含む胃内注射を2か月間毎日投与しました。 。 ABXグループのマウスは、D-galおよびCDPS注射に加えて、0.1 mg/mLアンピシリンおよび0.5mg/mLストレプトマイシンを含む飲料水を2か月間投与されました。 D-galを投与する前に、マウスはABXグループで7日間、0.1 mg / mLアンピシリン、0.5 mg / mLストレプトマイシン、および0.1 mg/mLコリスチンを含む注射を受けました。 Cyグループのマウスは、D-galおよびCDPSの毎日の注射に加えて、2ヶ月間隔日（qod）で20mg/Kgのシクロホスファミドの腹腔内注射を受けました。
新規物体認識テスト
最後の投与後に行動実験を行います。 オブジェクト認識テストには、習熟、トレーニング、およびテストの段階が含まれていました。 習熟段階の間、マウスを空の試験室に10分間2日間慣れさせた。 次に、3日目（トレーニング日）に、同じサイズ、形状、色の2つのオブジェクト（A1とA2）をチャンバーの両端に配置しました。 次に、すべてのマウスに10分間の時間を与えて、2つの類似したオブジェクトを探索しました。 1-時間（3日目）および24-時間（4日目）のトレーニングからテストまでの間隔の後、同様のオブジェクトの1つ（A1またはA2）がBまたはCに置き換えられました試験当日の大きさ、色、形が異なるもの。 テスト段階では、各マウスを5分間テストし、優先指数を計算して、次の式を使用して新規オブジェクト（BまたはC）認識の記憶を決定しました。優先指数=オブジェクトBまたはCの時間/（オブジェクトBまたはCの時間とオブジェクトAの時間）×100パーセント。
モリス水迷路テスト
モリス水迷路試験は、深さ45cm、直径90cmの丸いプールで行った。 Ruediger S、etal。によって記述されたプロトコル。 （2011）[55]およびWood RA、etal。 （2018）[56]はここで採用されました。 プール内の水深は30cm、水温は20±1℃でした。プラットフォームは直径6cm、水中1cmでした。 トレーニングとテストの時間はそれぞれ60秒でした。 トレーニングでは、プラットフォームを非表示にして、それぞれ60秒で4回の試行を、5日間連続して実施しました。 プラットフォームが60秒以内にマウスによって発見されなかった場合、それらはプラットフォームに導かれ、5秒間プラットフォーム上に置かれました。 テスト段階では、トレーニングおよびプローブトライアルセッションで隠れたプラットフォームに到達するまでの待ち時間、削除されたプラットフォームの場所を通過する回数、およびターゲット（プラットフォーム）象限で費やされた時間が記録および分析されました
ELISAアッセイ
IL -2（）、IL -4、IL -10、TNF-などの炎症性サイトカインの血清レベルを、ShanghaiYiから購入したELISAキットを使用してマウスの各グループについて分析しました。 Li Biological Technology Co.、Ltd.（上海、中国）は、製造元の指示に従います。 各グループのマウスの血清中の抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の活性、および脂質過酸化生成物であるマロンジアルデヒド（MDA）のレベルを、南京江城生物工学研究所（中国、南京）から購入したアッセイキットによって分析しました。 。 マウス海馬サンプル中の高度酸化タンパク質産物（AOPP）のレベルは、Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd.（Shanghai、China）のELISAキットを製造元の指示に従って使用して推定しました。
マウスの脳における酸化ストレスの推定
1 0 0mgの海馬組織を0.9mlの氷冷生理食塩水でホモジナイズし、ホモジネートを12000 rpmで30分間、4℃で遠心分離しました。上清中のタンパク質含有量をBCA Protein Assay Kit（ Beyotime Biotechnology、上海、中国）。 脂質過酸化（LPO）とマロンジアルデヒド（MDA）のレベル、および海馬サンプル中のGSH-PxとSODの活性は、製造元の指示に従って南京江城生物工学研究所（南京、中国）のキットを使用して比色分析によって分析されました。
腸内細菌叢の組成
糞便サンプルをすべてのマウスから収集し、すぐに-80℃で保存しました。16SrRNA遺伝子のV3プラスV4領域は、Illumina MiSeq（Beijing Novogene Co. Ltd.、Beijing、China）を使用してシーケンスされ、腸内細菌叢プロファイルを決定するためのQIIMEオープンプラットフォーム。
血清代謝物のLC/MS分析
血清サンプルを、事前に冷却したメタノールと1：3の比率で1 0分間インキュベートして、タンパク質を沈殿させました。 サンプルを12000r / minで15分間、4℃で遠心分離しました。上清をThermo ScientificDionexUltiMate3000高速液体クロマトグラフィーおよびQExactiveマススペクトルで分析しました。 クロマトグラフィー条件を表1に示します。分析対象物は、XBridge BEH Amideクロマトグラフィーカラム（2.1×100 mm; Waters Co.、米国マサチューセッツ州ミルフォード）で、移動相AおよびBとして0.1％ギ酸とアセトニトリルを使用して分離しました。それぞれ。 流量は0.4ml/ min、注入量は5 µl、カラム温度は25℃に設定しました（表1）。 マススペクトル信号は、正および負のイオンスキャンモードを使用して取得されました。 イオンスプレー電圧およびその他の特定のMSパラメータを表2に示します。
統計分析
Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0およびp< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">
参考文献
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