カンザス属のフェニルエタノイド配糖体はミトコンドリア依存性経路を介して Eca-109 細胞のアポトーシスを誘導する

導入

食道がんは最も一般的ながんの種類の 1 つであり、世界で 11 番目に高い罹患率と 6 番目に死亡率が高いがんの種類であり、2015 年には約 439,000 人の死亡を引き起こしました。食道がんの発生率は地域によって顕著に異なり、東部では2012年、アジアとアフリカ東部と南部の発生率が最も高く、アフリカ西部が最も低い発生率を示した。中国では、食道がんの推定症例数と死亡者数はそれぞれ477人000、375人000であった2005年から2015年にかけて、社会人口動態指数が中・高中程度の国では食道がんの罹患率は減少しましたが、予後不良のため死亡率は依然として高いままです。 食道がんの治療には外科的切除と化学療法または放射線療法の組み合わせが使用されてきましたが、2003 年から 2014 年の間、5- 年生存率は依然として低いことが報告されています。<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyそれを実証したカンクサフェニルエタノイド配糖体(CTPG) は、インビトロおよびインビボで黒色腫 B16- F10 細胞の増殖を抑制する可能性があります (24)。 しかし、以前に使用されていたCTPGは水への溶解度が低いため、医薬品開発が制限されていました。 そこで、水溶性CTPG（CTPG-W）を使用し、食道がん細胞（Eca-109）に対する抗腫瘍効果を検討しました。 CTPG-W は、ミトコンドリア依存性経路を介したアポトーシスの誘導を通じて Eca-109 細胞の生存率を用量依存的に阻害できることが判明しました。

性機能を改善するための天然シスタンケ チューブローサ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

材料と方法

動物。

メスの C57BL/6 マウス (6-8 週、約 25 g) を北京実験動物研究センター (中国、北京) から購入し、温度管理 (25 ℃)、光サイクル (12/12 時間) の管理された環境で飼育しました。 12）新疆大学の動物施設（中国ウルムチ）。 すべての動物には病原体を含まない水と餌が与えられました。

細胞株と培養物。

ヒト食道癌細胞株 (Eca-109) は、新疆生物資源および遺伝子工学重点実験室 (中国ウルムチの新疆大学生命科学技術学部) によって保存され、RPMI で培養されました。{{1} } 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS; MRC、EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd、江蘇省、中国) を添加した培地 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム)、1% L -グルタミン (100 mM)、100 U/ml ペニシリン、および 100 μg/ml ストレプトマイシン、37 ℃、5% CO2 を含む加湿雰囲気下。

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)。

CTPG-W (カタログ番号 SGJG20170410) は、Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (上海、中国) から購入しました。 CTPG の主要化合物は、我々の以前の研究 (24) に従って HPLC によって認定および定量されました。 簡単に説明すると、HPLC は ZORBAX SB‑C18 カラム (250x4.6 mm; 5 µm) で 30 ℃ で実施し、0.2% ギ酸溶液と 23% から始まるメタノールの勾配で 1 ml を毎分加えながら溶出しました。 31% に達するまで 45 分間。 合計 10 µl のサンプルを注入し、330 nm で検出しました。 エキナコシド標準品はShanghai Baoban Biotech Co., Ltd.（中国、上海）から購入し、アクテオシド標準品はSigma-Aldrich（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）から購入しました。 この標準は、CTPG-W の成分を分析するために使用されました。

MTTアッセイ。

細胞増殖は MTT アッセイで測定されました。 Eca{{0}} 細胞を、100 μl RPMI 中に 5x103 細胞の密度で 96- ウェルプレートに接種しました{{5 }} 培地/ウェルに添加し、37℃で 24 時間培養した後、さまざまな濃度 (0、200、400、600、および 800 μg/ml) の CTPG-W または 0.4% ジメチルスルホキシド (DMSO) で 24 時間処理します。 48時間と72時間。 DMSOを溶媒対照として使用しました(0.4% DMSOを含む800μg/ml CTPG-W)。 シスプラチン (20 μg/ml) を陽性対照として使用しました。 続いて、室温で225×gで5分間遠心分離した後、上清を廃棄し、100μlのMTT溶液（FBSを含まないRPMI-1640培地中0.5mg/ml）を各ウェルに添加し、37℃で3時間インキュベートした。 h. 形成されたホルマザン結晶を200μlのDMSOに溶解した。 光学密度（OD）値は、96-ウェルマイクロプレートリーダー（Bio-Rad Laboratories, Inc.、Hercules、CA、USA）により490 nmの波長で測定しました。 相対的な細胞生存率は、次の式に従って計算されました: 細胞生存率 (%)=(処理されたOD/未処理のOD)x100%。 Eca-109 細胞の形態は、倒立蛍光顕微鏡 (倍率、200 倍) (Nikon Eclipse Ti-E、株式会社ニコン、東京、日本) で観察されました。

脾細胞の増殖のために、C57BL/6 マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、脾臓を摘出した。 単細胞懸濁液を作成し、脾細胞を 100 μl RPMI-1640 培地中 1x105 細胞/ウェルの密度で 96- ウェル プレートに播種し、さまざまな濃度で処理しました。 (0、200、400、600、および 800 µg/ml) の CTPG-W を 37℃、5% CO2 で 24、48、および 72 時間処理しました。 脾細胞の増殖は、前述のプロトコルに従って、MTT アッセイによって測定されました。 刺激指数=OD処理済み/OD未処理。

アポトーシスと細胞周期の測定。 Eca{{0}} 細胞を 60 mm ディッシュ内で 2.5x105 細胞/ディッシュの密度で 24 時間培養し、さまざまな濃度で処理しました ({{31} }、200、400、600、および 800 µg/ml) の CTPG-W または 0.4% DMSO を 37˚C、5% CO2 で 24 時間処理します。 細胞を収集し、メーカーのプロトコールに従って、アネキシン V-フルオレセイン イソチオシアネート (FITC)/ヨウ化プロピジウム (PI) アポトーシス検出キット (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd.、上海、中国) で染色しました。 サンプルをフローサイトメトリー (BD FACSCalibur; BD Biosciences、フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国) によって収集し、FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc.、米国オレゴン州アッシュランド) によって分析しました。 細胞周期に対する CTPG-W の効果を分析するために、2.5x105 Eca-109 細胞を 60 mm 培養皿に播種し、CTPG-W (0、100、200、および 400 μg/ml) または 0.4 μg/ml で処理しました。 % DMSO、37℃、5% CO2 で 24 時間。 すべての細胞を回収し、氷冷 PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) で 2 回洗浄し、70% 氷冷エタノール中で 4℃ で 30 分間固定しました。 氷冷したPBSで2回洗浄した後、細胞を300μlのPI/RNase染色バッファー（BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）に室温で10分間再懸濁しました。 細胞周期分布は、ModFit LT 3.0 ソフトウェアを使用し、フローサイトメトリー (BD FACSCalibur) により分析しました。

天然カンクサ ツブロサ抗疲労肝臓を保護 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ミトコンドリア膜電位 (Δψm) と活性酸素種 (ROS) の分析。Δψm を分析するために、Eca{{0}} 細胞を CTPG-W (0、400、600、および 800 µg/ml) または 0.4% DMSO で処理しました。 37℃、5% CO2で24時間、JC-1（Beyotime Institute of Biotechnology、上海、中国）を含むミトコンドリア膜電位アッセイキットを使用して、メーカーのプロトコールに従って、37℃で20分間染色しました。 C. JC-1 洗浄バッファー (Beyotime Institute of Biotechnology) で 2 回洗浄した後、サンプルを 300 µl の JC-1 洗浄バッファーで再懸濁し、フローサイトメトリー (BD FACSCalibur) で分析しました。 Eca-109 細胞における JC-1 色素の蛍光も倒立蛍光顕微鏡 (倍率 200 倍、Nikon Eclipse Ti-E) で観察されました。 ROS の分析のために、Eca-109 細胞を CTPG-W (0、400、600、および 800 μg/ml) で 2、4、6、12、および 24 時間処理し、反応性酸素種アッセイで染色しました。キット（Beyotime Institute of Biotechnology）を製造業者のプロトコールに従って、37℃で20分間処理した。 氷冷 PBS で 3 回洗浄した後、フローサイトメトリー (BD FACSCalibur) でサンプルを収集し、FlowJo 7.6 ソフトウェアで分析しました。

図 1. CTPG-W の適格なコントロール。 CTPG-W の成分を高速液体クロマトグラフィーで定性・定量分析し、​​エキナコシドおよびアクテオシドの標準物質と比較しました。 CTPG-W、水溶性フェニルエタノイド配糖体C. 尿細管.

2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (DPPH) ラジカル消去活性。 CTPG-W のフリーラジカル消去活性は、DPPH を溶解するためにメタノールをエタノールに置き換えて若干の変更を加えた公開プロトコールに従って DPPH フリーラジカル アッセイで測定しました (25,26)。 定常状態の測定では、エタノール中の 150 μl DPPH (100 mmol/l) をさまざまな濃度の CTPG-W (25、50、75、100、250、300、 400、500 および 600 μg/ml) を 50 μl PBS に溶解し、暗所で室温で 30 分間インキュベートしました。 CTPG-Wの存在下および非存在下で517nmの吸光度を検出した。 合計 50 μl のビタミン C を陽性対照として使用しました。 DPPH ラジカル消去活性は次の式を使用して計算されました: 消去 (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100、ここで Ablank は対照 (DPPH なし)、Asample の吸光度です。はサンプルの吸光度、A0 は DPPH を含む PBS の吸光度です。

ウェスタンブロット分析。 Eca{{0}} 細胞を CTPG-W (0、200、600 μg/ml) または 0.4% DMSO で 24 時間、37℃、5% CO2 で処理しました。 続いてＰＢＳで２回洗浄し、細胞を 

図 2. Eca-109 細胞および脾細胞の増殖に対する CTPG-W の効果。 (A) Eca-109 細胞をさまざまな濃度の CTPG-W で 24、48、および 72 時間処理し、MTT アッセイで細胞生存率を検出しました。 (B) 24 時間の CTPG-W 処理時の Eca-109 細胞の形態学的変化。 (C) C57BL/6 マウスの脾細胞をさまざまな濃度の CTPG-W で 24、48、および 72 時間処理し、MTT アッセイで増殖を分析しました。**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. 尿細管.

を、放射免疫沈降アッセイ溶解緩衝液（Beijing ComWin Biotech Co., Ltd.、北京、中国）中で氷上で20分間溶解した。 4℃、10,000 xgで10分間遠心分離した後、上清を回収し、製造元のプロトコールに従ってビシンコニン酸キット（Thermo Fisher Scientific, Inc.）を使用してタンパク質濃度を検出しました。 ウェスタンブロット分析は、我々の以前の説明に従って実施されました(24)。 カスパーゼ-7 (カタログ番号 D120077)、カスパーゼ-8 (カタログ番号 D155240)、カスパーゼ-9 (カタログ番号 D220078)、B 細胞リンパ腫{ {13}} (Bcl-2) 関連 X (Bax) (カタログ番号 D220073) および Bcl-2 (カタログ番号 D260117)、および抗マウス IgG ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ (HRP) ) (カタログ番号 D111050) および抗ウサギ IgG-HRP (カタログ番号 D110058) は、BBI Life Sciences (上海、中国) から購入しました。 カスパーゼ-3 (カタログ番号 E-AB-10050) および活性カスパーゼ -3 (カタログ番号 E-AB-22115) に対する抗体は Elabscience (中国武漢）。 カスパーゼ-7 (カタログ番号 9492)、ポリ (ADP-リボース) ポリメラーゼ (PARP) (カタログ番号 9542)、シトクロム c (カタログ番号 AC909)、c-Jun NH{ に対するその他の抗体{37}} ターミナル キナーゼ (JNK) (カタログ番号 9252S) および -actin (カタログ番号 58169) は、Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) から入手しました。 すべての一次抗体と二次抗体は 1:1 に希釈されました。000。 一次抗体は 4℃で一晩インキュベートし、二次抗体は 37℃で 1 時間インキュベートしました。

図 3. CTPG-W によって誘導される Eca-109 細胞のアポトーシス。 細胞をさまざまな濃度のCTPG-Wで24時間処理しました。 (A) アポトーシスおよび壊死を起こした Eca-109 細胞をフローサイトメトリーで分析しました。 上のパネルは個々のドット プロットを示し、下のパネルは要約データを示します。 *P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. 尿細管.

標的タンパク質は、強化化学発光アッセイキット (Beyotime Institute of Biotechnology) を製造業者のプロトコールに従って使用して検出しました。

統計分析。 統計的有意性は Tukey の事後検定による一元配置分散分析によって計算され、結果は GraphPad Prism 5.0 ソフトウェア (GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して治療群と対照群間で分析されました。 すべてのデータは平均±標準偏差として表されました。 P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

腎機能改善のためのカンカエキス PHGS75% ECH 30% ACT 12%

結果

CTPG-W は Eca-109 細胞の増殖を抑制します。

CTPG-W の成分は HPLC によって認定および定量され (図 1)、エキナコシドおよびアクテオシドの標準物質と比較されました。 ピーク保持時間とピーク面積によると、CTPG-W には 39.16% のエキナコシドと 2.44% のアクテオシドが含まれていました。 まず、Eca-109 細胞の生存率に対する CTPG-W の効果を MTT アッセイで測定しました。 CTPG-W を 200 mg/ml で DMSO に溶解し、10% 熱不活化 FBS を含む RPMI-1640 培地で指定の濃度に希釈しました。 Eca-109 細胞を CTPG-W で処理し、指定された時点で MTT アッセイで細胞生存率を分析しました。 CTPG‑W 治療は、用量および時間依存的に Eca-109 細胞の生存率を大幅に低下させました (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

図 4. Eca-109 細胞の細胞周期分布に対する CTPG-W の効果。 異なる濃度の CTPG-W を使用して Eca-109 細胞を 24 時間処理し、細胞周期分布をフローサイトメトリーで分析しました。 *P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. 尿細管.

CTPG-W は Eca-109 細胞のアポトーシスを誘導します。 CTPG-Wがアポトーシスまたは壊死の誘導を通じてEca-109細胞の増殖を抑制するかどうかを調べるために、細胞をさまざまな濃度のCTPG-Wで処理しました。 24 時間後、Eca-109 細胞のアポトーシスと壊死がアネキシン V/PI 染色で検出されました。 図 3A に示すように、アネキシン V- /PI+ 細胞は壊死細胞としてゲートされ、アネキシン V+ /PI+ およびアネキシン V+ /PI- 細胞はアポトーシス細胞としてゲートされました。 CTPG-W は主に用量依存的に Eca-109 細胞のアポトーシスを誘導しましたが、壊死した Eca-109 細胞も 600 および 800 µg/ml CTPG-W の処理下で有意に増加しました (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W は、Eca-109 細胞の S 期での細胞周期停止を誘導します。 がん細胞周期の乱れは細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを促進します(27)。 Eca-109 細胞の細胞周期の分布は、24 時間の CTPG-W 処理後の PI 染色で検出されました。 CTPG-W 処理により、S 期の細胞が増加し、G0/G1 期の細胞が全体的に大幅に減少したことが観察されました (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W は Δψm を減少させ、シトクロム c の放出を誘導します。 アポトーシスはミトコンドリア依存性経路によって誘発される可能性があります(28,29)。 BCL-2 タンパク質ファミリーのプロアポトーシスおよび抗アポトーシスのメンバーは、ミトコンドリア膜の完全性の制御において重要な役割を果たします (30,31)。 24 時間の CTPG-W 処理後、JC-1 染色を使用して Δψm を評価しました。 Δψm が減少すると、JC-1 凝集体 (FL-2 で検出される赤色蛍光) はモノマー (FL-1 で検出される緑色蛍光) に分解します (32)。 図5Aに示すように、FL-1+ FL-2-/+ 細胞の頻度は用量依存的に大幅に増加し、Eca-109 細胞のΔψm が減少したことを示しています。 Eca-109 細胞の蛍光変化は倒立蛍光顕微鏡でも観察されました (図 5B)。 CTPG-W の濃度が増加すると、赤色蛍光が減少し、緑色蛍光が増加しました。これはフローサイトメトリーのデータと一致しています。 また、サイトゾル中のシトクロム c のレベルが顕著に増加していることも観察されました (図 5C)。これは、Δψm の減少の結果です。 これは、CTPG-W処理の結果としてΔψmが減少したというFL-1+ FL-2-/+細胞数の増加から導かれた結論を補強するものである。 JNK は、シトクロム c (33-35) の放出を引き起こす BCL-2 タンパク質ファミリーの活性化を調節できることが報告されています。 CTPG-W治療後にJNKレベルが顕著に上方制御されたことも判明した(図5C)。 結果は、CTPG-W がミトコンドリア依存性経路を通じて Eca-109 細胞のアポトーシスを誘導する可能性があることを示しました。

図 5. Δψm の減少とシトクロム c および JNK の上方制御。 Eca-109 細胞をさまざまな濃度の CTPG-W で 24 時間処理しました。 (A) Δψm は JC-1 染色によって検出され、サンプルはフローサイトメトリーによって分析されました。 個々のドット プロットは、JC-1 蛍光の変化を示しています。 FL-1+ FL-2-/+ セルの頻度は下のパネルに示されています。 ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

図 6. CTPG-W 処理時の Eca-109 細胞の ROS レベルと CTPG-W の抗酸化活性。 (A) Eca-109 細胞をさまざまな濃度の CTPG-W で処理し、指定された時点で ROS レベルをフローサイトメトリーで分析しました。 *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

細胞内 ROS 生成に対する CTPG-W の影響。ROS は Δψm を減少させてアポトーシスを誘導する可能性があります (36)。 CTPG-W が ROS 産生を増加させることができるかどうかを調べるために、Eca-109 細胞をさまざまな濃度の CTPG-W で処理しました。 細胞を指定の時点で収集し、DCFH-DA で染色しました。 Eca-109 細胞における細胞内 ROS の産生はフローサイトメトリーによって測定されました。 図6Aに示すように、800μg/ml CTPG-Wは、2-6時間からROS産生を有意に増加させ、12-24時間から減少させました。 さらに、400 µg/ml CTPG‑W は、12-24 時間から ROS 産生を大幅に増加させました。 さらに、200 μg/ml CTPG-W は ROS 産生を顕著に変化させませんでした。 ROS 産生の動的な変化は Eca-109 細胞のアポトーシスに関連している可能性があります。 CTPG-W にはフリーラジカル消去活性があることも判明しました (図 6B)。これは、800 μg/ml CTPG-W で 12 時間処理した Eca-109 細胞における ROS 産生の減少に関連している可能性があります。

図 7. CTPG-W 処理後の切断型カスパーゼおよび切断型 PARP のレベル。 CTPG-Wで24時間処理したEca-109細胞からタンパク質を単離し、切断型カスパーゼおよび切断型PARPのレベルをウェスタンブロット分析で検出しました。 DMSO、ジメチルスルホキシド; CTPG-W、水溶性フェニルエタノイド配糖体C. 尿細管; PARP、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ。

CTPG-W は、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、カスパーゼ-9、PARP の活性を上方制御します。 Δψm の減少によるシトクロム c の放出は、カスパーゼ プロテアーゼを活性化してアポトーシスを誘導する可能性があります (29、30、37)。 24 時間の CTPG-W 処理後、カスパーゼ -3、7、8、9、および PARP の活性化がウェスタンブロット分析によって検出されました。 対照と比較すると、切断型カスパーゼ-9、切断型カスパーゼ-7、切断型カスパーゼ-3、および切断型PARPのレベルは変化しましたが、切断型カスパーゼ{{20のレベルはそうではありませんでした。 }} は、CTPG 治療により用量依存的に上方制御されました (図 7)。 これらの結果は、CTPG-WがΔψmを減少させ、シトクロムc放出を促進して、Eca-109細胞のアポトーシスを誘導するカスパーゼを活性化することを示した。

議論

従来の CHM は、外因性死受容体、内因性ミトコンドリアおよび小胞体ストレス経路などのさまざまな経路を通じて食道がん細胞のアポトーシスを誘導する可能性があります (29)。 私たちの以前の研究では、C. tubulosa の主成分としての CTPG が、ミトコンドリア依存性経路を介したアポトーシスの誘導を通じて黒色腫 B16-F10 細胞の増殖を阻害することが実証されました (24)。 本研究では、Eca-109細胞に対するCTPG-Wの抗腫瘍効果が調査され、CTPG-WがEca-109細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導し、細胞周期停止を引き起こすことが判明した。 Δψm が減少し、シトクロム c の放出が増加し、カスパーゼが活性化されました。 CTPG および CTPG-W は、がん細胞のアポトーシスおよび細胞周期停止を誘導する可能性があります。 ただし、CTPG (エキナコシド 26.64%、アクテオシド 10.19%、イソアクテオシド 1.71%) と CTPG-W (エキナコシド 39.16%、アクテオシド 2.44%) では成分が異なるため、正確なメカニズムは異なります。 CTPGはB16-F10細胞をG0/G1期で停止させたが、CTPG-WはEca-109細胞をS期で停止させた(24)。 ROS 産生は CTPG によって用量依存的に増加しましたが、高用量の CTPG-W によって時間依存的に変化することが示され、CTPG-W 治療の開始時 (2-6 時間) に大幅に増加しました。対照と比較して、12 時間後に有意に減少しました。 考えられる理由は、CTPG-W の主成分がエキナコシドであることです。 いくつかの研究では、エキナコシドが ROS 生成と ROS 誘導性アポトーシスを阻害し、神経保護効果と老化防止効果を発揮できることが報告されています (38-40)。 同様に、フリーラジカル消去活性が本研究でも観察されました。 したがって、高用量の CTPG-W に含まれるベルバスコシド、イソベルバスコシド、サリドロシドなどの一部の成分は、直ちに ROS 生成を誘導して Eca-109 細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があると推測されました (41,42)。 ROS は echi によって清掃されましたナコシド。 CTPG と CTPG-W による ROS 産生の違いのもう 1 つの考えられる理由は、この研究と以前の研究では異なる細胞株が使用されたことです (24)。 Dong et al (43) は、エキナコシドが ROS レベルを増加させることなく、酸化的 DNA 損傷の生成を通じてヒト SW480 結腸直腸癌細胞のアポトーシスを誘導できることを報告しました。

CTPG-W処理はΔψmを減少させ、カスパーゼ-9の切断を促進するシトクロムcの放出を引き起こした(28)。 一貫して、切断型カスパーゼ-9のレベルはCTPG-W処理によって上方制御されました。 その後、活性型カスパーゼ-9がカスパーゼ-3を活性化してアポトーシスを誘導します(44)。 切断型カスパーゼ-3のレベルもCTPG-W処理によって上方制御されました。 しかし、カスパーゼ-8はCTPG-Wによって活性化されず、外因性デスレセプター経路がCTPG-Wによって誘導されるアポトーシスに関与していないことを示した。 これらの観察は、CTPG-W がミトコンドリア依存性経路の活性化を通じて Eca-109 細胞のアポトーシスを誘導することを示しています。

PARP はゲノムの安定性において重要な役割を果たしており、活性カスパーゼ、特にカスパーゼ -3 と -7 によって切断されます (45)。 CTPG-W処理はカスパーゼ-3と-7を活性化し、これがPARPを切断してDNA修復を阻害し、アポトーシスを引き起こす可能性があることが判明しました。

CTPG-W はまた、ヒト肝細胞癌 BEL-7404 細胞の増殖を用量および時間依存的に抑制します (未発表データ)。 CTPG-W は Eca-109 および BEL-7404 細胞の増殖を阻害しますが、脾細胞の増殖を促進します。これは、CTPG-W に含まれる多糖類 (約 50%) によるものと考えられます (46 ）。 同様に、いくつかの研究で、多糖類が脾細胞の増殖を促進する可能性があることが報告されています (46-49)。 マウスモデルでは、CTPG-Wが対照群と比較して脾臓指数を有意に増加させたが、体重や心臓、肝臓、腎臓、肺を含む他の臓器指数には影響を及ぼさなかったことが判明した（未発表データ）。これは、CTPG-W が正常細胞に対して細胞傷害作用を及ぼさないことを示しています。

まとめると、データは、CTPG-W がミトコンドリア依存性経路を介したアポトーシスの誘導によって Eca-109 細胞の増殖を阻害することを示しました。

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