カンクサは原発性および転移性ヒト結腸癌細胞の活性酸素種媒介アポトーシスを誘導する
Mar 28, 2024
導入
結腸直腸がんは、世界中で最も一般的ながんの 1 つです（ブレナー他。、2014)、現代の食事とライフスタイル、および身体活動の減少により、その発生率は常に増加しており、2035 年には推定 240 万人になると推定されています。 現在の結腸直腸がんの蔓延と闘うには、現在の取り組みでは不十分であるため、効果的な予防と治療には、ライフスタイルの変更と、より安全な代替介入を組み合わせた新たなアプローチが必要とされています。植物療法学 (ワイドナー)他。、2015）。 病気の治療に薬用植物を使用する植物療法は、古代人類の歴史において避けられない部分でした。 薬用植物は癌の代替治療源として長い間利用されており、従来の医学で使用される抗癌剤の 60% 以上を占めています (Balunas and Kinghorn、2005; Saibu)他。、2015）。 最もよく知られた例には、以下の抜粋が含まれます。ニチニチソウG.ドン。 (キョウチクトウ科)、Taxus baccata L. (イチイ科)、および Camptotheca acuminate Decne (ニッサ科) (Cragg and Newman、2005; da Rocha)他。、2001）。 いくつかのハーブ抽出物と植物化学物質は、結腸直腸癌において抗腫瘍効果を発揮することが示されており、これは、からの抽出物の場合と同様に、活性酸素種 (ROS) 産生とそれに伴う癌細胞のアポトーシスの誘導に起因すると考えられます。メリッサ・オフィシナリス(ワイドナー他。, 2015)
植物療法の候補の中には、カンクイアフリカ、アジア、地中海地域の乾燥および半乾燥地域に広く分布するオロバンチャ科の寄生砂漠植物（Jiang et al., 2009）は、貴重な薬効があることが示されています。 カンクサは伝統医学で広く使用されており、腎不全、病的白帯下、子宮出血、女性不妊症、老人性便秘の治療効果があることが示唆されています (Jiang et al., 2009)。その伝統的な薬用用途に加えて、重要な薬用薬も含まれています。血管弛緩作用（吉川ら、2006）、肝保護作用（森川ら、2010）、抗高血糖作用および脂質低下作用（Xiong ら、2013）など、カンカウの特性は過去 10 年間に集中的に研究されてきました。 カンクサは、免疫系の強力な増強剤、骨形成の促進剤、老化防止剤および抗疲労剤としても示唆されています (Xu et al., 2014)。 さらに、カンカ抽出物はアルツハイマー病モデルにおいてアミロイドの沈着をブロックすることが示されています（Wu et al., 2015）。 さまざまな治療用途にもかかわらず、潜在的な抗がん剤としてのカンカの効果はまだ研究されていません。
本研究では、2 つの原発性結腸癌細胞株と 2 つの転移性結腸癌細胞株に対するカンカの抗癌効果と、この効果の根底にある潜在的なメカニズムを研究しました。
性機能を改善するための天然シスタンケ チューブローサ PHGS75% ECH 30% ACT 12%
材料と方法
植物抽出物の収集と調製
カンクサのサンプルは 2014 年にカタールの砂漠地帯から収集され、植物学者によってこの植物が本物であることが確認されました。 バウチャーのサンプルは、ADLQ の毒性学および多目的部門にアーカイブされています。 天日乾燥した植物サンプルを Retsch Knife Mill Grindomix GM300 で微粉末に粉砕しました。 ２０グラムの粉末を、２００ｒｐｍのロータリーシェーカー上で３７度で一晩、２００ｍＬの超純水で抽出した。 粗野なカンカエキス（CTE）8000 rpmで 30 分間遠心分離して不溶性化合物をペレット化し、上清を収集し、Labconco Freezone 6 plus 凍結乾燥機を使用して凍結乾燥しました。 乾燥抽出物をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、SIGMA、ドイツ）で20 mg/mLの濃度に再構成し、0.2-ミクロンの膜フィルターで滅菌濾過しました。
細胞株と細胞のメンテナンス
ヒト結腸癌細胞株 CaCo2、SW620、および LoVo は Cell Lines Service (CLS、エッペルハイム、ドイツ) から入手しましたが、HCT 116 細胞株はカタール大学生物環境科学部からの好意で寄贈されました。 CaCo2 と HCT11 は結腸癌の原発部位に由来し、SW620 と LoVo は転移部位に由来しました。 SW620、HCT116、および LoVo 細胞は DME 培地で培養および維持され、一方、CaCo2 細胞は Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM、SIGMA、ドイツ) で維持されました。 細胞は、５％二酸化炭素を含む加湿雰囲気中、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＳＩＧＭＡ、ドイツ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ、ドイツ）を補充したそれぞれの培地中で３７度で単層培養して増殖させた。
細胞生存率アッセイ
{{0}}[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム (MTT) アッセイを使用して、次の細胞毒性活性を評価しました。 CTE は前述と同様です (Jaganjac et al., 2010)。 96- ウェル プレートで培養した CaCo2、HCT116、SW620、および LoVo 細胞の播種密度は、ウェルあたり 104 細胞でした。 処理の２４時間前に、細胞を１０％ＦＢＳを補充したそれぞれの培地に播種した。 24 時間後、培地を除去し、細胞を 0、0.25、0.5、1、および 2 mg/mL の CTE で 24、48、および 72 時間、5% CO2 を含む加湿雰囲気中、37 度で処理しました。 CTE 処理後、培地を除去し、40 μL の MTT 溶液 (0.5 mg/mL) を各ウェルに添加しました。
3 時間のインキュベーション後、MTT 溶液を除去し、ホルマザン生成物をジメチルスルホキシド (DMSO、SIGMA、ドイツ) に溶解し、マイクロプレート リーダー (Infinite 200 PRO NanoQuant、Tecan Trading AG、スイス) で 590 nm で吸光度を測定しました。 。
アポトーシスアッセイ
CaCo2、HCT116、SW620、および LoVo 細胞のアポトーシスは、生体色素として 7- アミノアクチノマイシン D (7- AAD) を使用した PE Annexin V アポトーシス検出キット I を使用して検出されました (Becton) Dickinson International、ベルギー）製造元の指示に従ってください。 簡単に説明すると、CTE（0、0.5 、または 1 mg/mL)。 24 CTEのインキュベーション後、細胞を回収し、冷リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、フィコエリトリン(PE)アネキシンVおよび7-AADで暗所、室温で15分間染色した。 染色された細胞は、FACS を使用したフローサイトメトリーによって 1 時間以内に分析されました。 Aria III フローサイトメーターおよび FACSDiva ソフトウェア (Becton Dickinson)、低流速、最小 104 細胞。 6 μM カンプトテシン (SIGMA) で細胞を 4 時間処理したものを、アッセイの陽性対照として使用しました。
細胞内ROS産生
細胞内 ROS 産生は、2,7- ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテート (DCFH-DA、SIGMA、ドイツ) を使用して調べました。 DCFH-DA は非蛍光プローブであり、細胞内 ROS により酸化されて蛍光化合物 27- ジクロロフルオレセイン (DCF) になります (Poljak-Blazi et al., 2011)。 DCFH DA アッセイは、以前に記載したのと同様に実行されました (Cindric et al.、2013; Poljak-Blazi et al.、2011)。 簡単に説明すると、96- ウェル黒色プレートで培養した CaCo2、HCT116、SW620、および LoVo 細胞の播種密度は、ウェルあたり 104 細胞でした。 細胞を、10% FBSを補充したそれぞれの培地に24時間播種した。 処理前に、細胞を 10 μM DCFH-DA とともに 5% CO2 / 95% 空気中、37 度で 30 分間インキュベートしました。 次いで、細胞を洗浄し、フェノールレッドを含まない培地中の０、０．５、および１ｍｇ／ｍＬのＣＴＥで処理した。 細胞内 ROS 形成は、上部蛍光およびガス制御モジュールを備えたマイクロプレート リーダー (Infinite 200 PRO、Tecan Trading AG、スイス) を使用して、37 度、5% CO2 で 25 時間継続的にモニタリングされました。 蛍光強度は、500 nmの励起波長および529 nmの発光検出で測定されました。 任意の単位である相対蛍光単位 (RFU) は、蛍光強度に直接基づいていました。
腎機能改善のための天然シスタンケチューブローサ PHGS75% ECH 30% ACT 12%
ミトコンドリアスーパーオキシドの生成
ミトコンドリアによるスーパーオキシド生成を誘導するCTEの能力は、細胞透過性のミトコンドリア標的MitoSOX Redプローブ（Life Technologies）および核染色用のHoechst 33342（Life Technologies）を使用して評価されました。 CaCo2、HCT116、SW620、および LoVo 細胞を、10% FBS を補充したそれぞれの培地で 1 ウェルあたり 104 細胞の密度で 96- ウェルプレートに播種し、24 時間培養しました。 次に、細胞に 4 μM の MitoSOX および 2 μM の Hoechst 33342 を 20 分間ロードし、過剰な色素を洗浄し、ウェルを 0、0.5、および 1 mg/mL の CTE で 37 度、5% CO2 で 24 時間処理しました。 蛍光強度は、上部蛍光を備えたマイクロプレートリーダー (Infinite 200 PRO、Tecan Trading) を使用して、MitoSOX の場合は励起波長 510 nm、発光検出は 580 nm で、Hoechst 33342 の場合は励起波長 350 nm、発光検出は 461 nm で測定しました。 AG、スイス)
統計分析
記述統計は平均 +/- SD として示されました。 グループ間の差異の有意性は、Student t 検定とカイ 2 乗検定を使用して評価されました。 3 つ以上のグループを比較する場合、適切な事後テストを伴う片側 ANOVA を使用しました。 Mircosoft Windows 用の SPSS 11.01 が使用されました。 0.05未満のPの差は統計的に有意であるとみなされました。
結果
ヒト結腸癌細胞株の増殖に対する CTE の影響を図 1 に示します。試験したすべての CTE 濃度は、濃度および時間依存的に CaCo2 細胞株に対して強い阻害効果を示しました (図 1A)。 72 時間の CTE 処理により、対照と比較して CaCo2 細胞の増殖が 60% 以上阻害されました (すべての濃度で p < 0.05)。 HCT116 細胞増殖に対する CTE 処理の重大な影響も、2 つの最高濃度 (1 mg/mL および 2 mg/mL) ですべての時点で検出され、後者の濃度では 70% を超える減少に達しました (図1B、p < 0.05)。 2 つの低い CTE 濃度 (0.25 および 0.5 mg/mL) では、24 時間後の HCT116 細胞の増殖が大幅に減少しました (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}。{{10}}5)。 LoVo 細胞では、CTE による時間および濃度依存的な増殖阻害が最高濃度で 60% 以上確認されました (p < 0.05) (図 1C)。そして、試験した 4 つの CTE 濃度はすべて、48 時間後に SW620 細胞の増殖を減少させました (図 1D、すべてにおいて p < 0.05)。 72 時間の治療後、同じ効果は 2 つの最高濃度でのみ観察されました (p < 0.05) が、0.25 および 0.5 mg/mL 濃度では対照と比較して有意な効果は示されませんでした (p > 0.05)。 アポトーシスの誘導に対する 0.5 および 1 mg/mL CTE 処理の影響を、4 つの細胞株すべてでさらにテストしました (図 2)。 0.5 mg/mL で 24- 時間処理した後、HCT116 および LoVo で初期アポトーシスの細胞数の増加が検出されました (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.
図1:の影響カンクイ結腸癌細胞株の生存率に関する研究。 (A) CaCo2、(B) HCT116、(C) LoVo、および (D) SW620 細胞の MTT アッセイによって測定された細胞生存率は、対照の未処理結腸癌細胞株のパーセンテージとして表示されます。 代表的な実験の 5 回の反復の平均値 (±SD) を示します: (*) 有意差 p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.
図 2: カンカウ水抽出物はヒト結腸癌細胞のアポトーシスを誘導します。 (A) CaCo2、(B) HCT116、(C) LoVo、および (D) SW620 細胞のアネキシン V-FITC フローサイトメトリー分析は、対照の未処理結腸癌細胞株のパーセンテージとして表示されます。 代表的な実験の 3 回の反復の平均値 (±SD) を示します: (*) 有意差 p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.
図 3: カンカウ水抽出物は、時間および用量依存的に細胞内 ROS 産生を誘導します。 (A) CaCo2、(B) HCT116、(C) LoVo、および (D) SW620 細胞における DCFH-DA アッセイによって測定された ROS 産生は、それぞれの 5- 反復の平均 RFU 値 (±SD) として示されます。代表的な実験です。 (*) 意義 p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.
図 4: カンカ水抽出物は、ヒト結腸癌細胞におけるミトコンドリア スーパーオキシドの生成を誘導します。 A) CaCo2、(B) HCT116、(C) LoVo、および (D) SW620 細胞におけるミトコンドリアを標的とした MitoSOX Red プローブの蛍光強度を、対照の未処理結腸癌細胞株のパーセンテージとして示します。 代表的な実験の 5 回の反復の平均値 (±SD) を示します: (*) 有意差 p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.
議論
これまでの研究でカンカの多くの薬効が報告されてきましたが、悪性細胞における増殖抑制効果についてはこれが初めての報告です。 高極性溶媒である水で抽出されたカンカンキの生理活性化合物は、強力な抗がん生理活性を示しました。 我々は以前、水に可溶化したカンカの効率をメタノールや酢酸エチルなどの他の溶媒と比較しましたが、水抽出物が最も有望な抗がん活性を示しました（データは示されていません）。
我々は、1 mg/mL および 2 mg/mL の CTE が原発性および転移性結腸癌細胞株の両方の増殖を 60% 阻害する能力を実証し、CTE の潜在的に重要な役割を明らかにしました。ニクジュヨウ結腸がんの治療法として。 正常細胞と比較して、がん細胞は一般に酸化還元ホメオスタシスの乱れを特徴とし、現在の抗がん治療の一般的な戦略は細胞の酸化ストレスを増加させることである(Yang et al、2013)。 生理学的に低レベルの ROS はシグナル伝達分子として重要な役割を果たしますが、過剰な ROS 産生は癌の不安定性や悪性化の一因となる可能性があります (Liou および Storz、2010)。 逆説的ですが、細胞の酸化還元ホメオスタシスのこの不均衡により、がん細胞は ROS 誘発細胞死に対してより脆弱になります (Jaganjac et al., 2008; Nogueira and Hay, 2013)。 この研究で報告されたCTEの抗増殖効果は、アポトーシスに重要な役割を果たす複数の経路を標的とした、抽出物内の既知および未知の化合物のさまざまな細胞外および細胞内メカニズムによって媒介される可能性があります。 細胞死の異なるモードを区別するために、観察された CTE 誘発細胞毒性の原因となる潜在的なメカニズムを調査しました。
カンカ ツブロサ エキス 抗アルツヘルマー病 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
我々のデータは、CTEが細胞内ROS産生を増加させ、その結果、ROS誘発細胞死を増加させることを示しています。 細胞の酸化還元状態もアポトーシスの制御に重要な役割を果たしており、ミトコンドリアの電子伝達鎖は細胞の ROS 生成の主要な部位の 1 つです (Trachootham et al., 2008)。 さらに、細胞内 ROS は、ミトコンドリア依存性経路と独立性経路の両方を介して細胞アポトーシスを引き起こす可能性があります (Sinha et al., 2013)。 実際、我々のデータはまた、CTE誘導性のホスファチジルセリンの外在化が、原発性癌細胞株と転移性癌細胞株の両方においてアポトーシスにおける共通の効果であることを示しており、CTE誘導性の細胞死の機構が壊死ではなくアポトーシスによって媒介されることを示唆している。 がん細胞におけるアポトーシスの活性化は修正戦略であり、多くの抗がん剤はがん細胞においてアポトーシス効果を発揮する可能性があります。
したがって、癌細胞においてアポトーシス促進活性を有する化合物または抽出物は、抗癌剤研究において潜在的に有用である(Wong、2011)。 CTE 誘導性アポトーシス促進効果がミトコンドリア誘導性 ROS 機構によって媒介されるかどうかを判断するために、CTE 処理細胞におけるミトコンドリア標的蛍光プローブを使用してスーパーオキシド生成を測定しました。 我々のデータは、CTEがミトコンドリアのスーパーオキシド産生を刺激することを明確に示しており、このことはカンカウ尿管抗がん活性が少なくとも部分的にミトコンドリア誘導性ROS機構を介して媒介されていることを示唆している。
結論
結論として、我々のデータは、砂漠の植物であるキスタンケ・チューブロサの水抽出物が、結腸がんの予防および治療のための他の従来の治療法と組み合わせた抗がんアプローチの有望な候補となる可能性があることを示唆しています。 我々はまた、癌細胞に対する植物抽出物の毒性が、細胞内ROS産生の増加によって、そして少なくとも部分的にはミトコンドリア依存性のアポトーシスによって媒介されることを実証する。 抗がん活性に関与する個々の生物学的に活性な成分を単離し、特徴づけるためのさらなる研究が進行中です。
この抽出物の効果的な化学予防剤としての使用の可能性を評価し、結腸癌細胞に対する作用機序を分子レベルで理解するには、さらなる研究が必要です。 観察された有益な健康効果を確認するには、さらなる前臨床および臨床研究も必要です。ガン予防のためのカンカンケ・チューブロサ.
シスタンケ チューブロサ シスタンケ コーヒーは記憶力を改善します 抗疲労 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
