カンカ類からのカルコン合成酵素のクローニング、機能同定および発現解析

要約: 目的 Guanhuaroucongrong からのカルコンシンターゼの機能を研究すること (カンクイ）および白、赤、紫の花におけるCtCHS遺伝子の発現パターン。

方法:CtCHS遺伝子をRT‐PCRによってクローニングし,バイオインフォマティクス分析を行った。 pET-28a-CtCHS プラスミドを大腸菌に導入し、IPTG によるタンパク質発現を誘導しました。 CtCHS組換えタンパク質を基質p-クマロイルCoAおよびマロニルCoAとともにインキュベートし,生成物をHPLCおよびMSによって検出した。 pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHSプラスミドをシロイヌナズナのプロトプラストに導入して、CtCHSタンパク質の細胞内局在を観察した。 の花におけるCtCHS遺伝子の発現パターンC. チューブロサqRT-PCR により 3 色の色素が検出されました。

結果 CtCHS 遺伝子がクローニングされました。 オープンリーディングフレーム（ORF）の長さは1173 bpで、390のアミノ酸をコードし、タンパク質の分子量は42 8000でした。CtCHSには、カルコンシンターゼに保存されている触媒残基Cys164、His303、Asn336が含まれていました。 CtCHSタンパク質を大腸菌で発現させ、精製して組換えタンパク質を得た。 CtCHS タンパク質は、p-クマロイル CoA およびマロニル CoA を触媒してナリンゲニン カルコンを生成する可能性があります。 CtCHS タンパク質は主に細胞質に局在していました。 CtCHS遺伝子は紫色と赤色の花で高度に発現し,相対発現レベルは白色の花よりそれぞれ8.44倍と3.21倍高かった。

結論 CtCHS 遺伝子は、花からクローニングされました。C. チューブロサそしてタンパク質が発現した。 CtCHSタンパク質にはカルコンシンターゼ機能があり、CtCHS遺伝子の発現は色が濃い花ほど高くなることから、CtCHS遺伝子がC. tubulosaの花の色を調節している可能性があることが示され、C. tubulosaに関するさらなる研究の基礎が築かれる。C. tubulosaの花色の調節機構.

キーワード:キスタンケ・チューブロサ (シェンク) ワイト; カルコンシンターゼ。 酵素活性分析; 細胞内局在化。 表現分析

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生合成フラボノイドの経路フェニルプロパノイド経路から始まります。フェニルアラニンはまず桂皮酸に変換されます。フェニルアラニンアンモニアリアーゼの作用(PAL)、桂皮酸は4-桂皮酸によって水酸化されます。 酵素（桂皮酸-4-ヒドロキシラーゼ、C4H）と4-クマレートコエンザイムAリガーゼ（4-クマレートコエンザイムAリガーゼ、4CL）は反応を触媒して4-クマロイル-CoA [11] ]。 1 分子の 4- クマロイル CoA と 3 分子のマロニル CoA がカルコン合成酵素 (CHS) によって触媒されて、フラボノイド化合物を含むナリンゲニン カルコンが生成されます。カルコンイソメラーゼ、フラバノン-3- ヒドロキシラーゼ、ジヒドロフラボノール4-レダクターゼなどは、イソフラボン、フラボノール、アントシアニンなどのさまざまなフラボノイドを生成します[12]。 CHS はフラボノイド生合成経路における重要な酵素として、植物のフラボノイド含有量を調節し、植物の花の色の調節にも重要な役割を果たします [13]。 たとえば、Gentiana scabra Bunge CHS の転写後の遺伝子サイレンシングは、アントシアニンの生合成を阻害し、花冠葉の特異的な白化を引き起こす可能性があります [14]。 Actinidia erianthaBenth の CHS 遺伝子サイレンシング。 CHSは花びらのアントシアニン含有量を減少させ、花びらを赤くします。 花びらの色が明るくなります[15]。 そこで本研究では、カンカウの花からCtCHS遺伝子をクローニングし、バイオインフォマティクス解析、原核生物の発現と精製、酵素活性解析、細胞内局在解析、3色の花の発現解析を行って、CtCHSの機能を探索した。 CtCHS タンパク質と CtCHS 遺伝子の発現パターンを使用して、CtCHS とカンクイの花の色の関係を予備的に調査し、これにより、CtCHS の調節機構の研究の基礎が築かれました。カンカンキの花の色.

1 材料と器具

1.1 材料

カンクイの花は、2018年5月に新疆ホータン県玉田県で採取されました。サンプリング中にランダム原則に従い、良好な生理学的状態と一貫した草丈を持つカンクイの花が選択されました。 北京大学薬学部の屠鵬飛教授により、白、赤、紫の3色の花を持つカンクの3株が採取され、カンク（シェンク）ワイトであると同定された。 これらは液体窒素で急速冷凍され、ドライアイス保管庫で北京に輸送された。 大腸菌 DH5 化学的コンピテント セルは Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. から購入し、大腸菌 BL21 (DE3) 化学的コンピテント セルは北京泉市金生物技術有限公司から購入しました。 pET-28a、pCAMBIA1300-35S-GFP ベクターは Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. から購入しました。マロニル CoA は Sigma Company から購入しました、4-クマロイル CoA、ナリンゲニン−カルコンはShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.から購入し、ナリンゲニンはShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.から購入しました。

1.2 楽器

Nanodrop 2000C 分光光度計 (Thermo Fisher Company、米国)、グラジエント PCR 装置 (Eppendorf Company、ドイツ)、CFX 96 蛍光定量 PCR 装置、UVP ゲルイメージング装置、ゲル電気泳動装置、タンパク質電気泳動装置 (BioRad Company、米国)、EnSpire

マイクロプレートリーダー (PerkinElmer Company、米国); 恒温恒温器（上海京宏実験設備有限公司）。 DHZ-D 大容量全温度発振器 (太倉実験設備工場); THZ-82ウォーターバス恒温発振器 (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH 超クリーン作業台 (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); 高圧蒸気滅菌器（タカラトミー株式会社、日本）; Milli Q 純水装置 (ミリポア、米国); LC-20高効率液相クロマトグラフ (島津製作所、日本); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap 高分解能質量分析 (Thermo Fisher Company、米国); FV1200 レーザー共焦点顕微鏡 (オリンパス社、日本)。

2 実験方法

2.1 RNA 抽出と cDNA 合成。

カンクイの花を液体窒素中で粉砕し、RNA 抽出アッセイに供しました。

キット (Norgen、Cat 17200) を使用して全 RNA を抽出し、RNA の濃度と品質を NanoDrop 2000C で検出し、A260/A280 比が 1.8 ～ 2.1 の RNA サンプルを逆転写用に選択して cDNA を合成しました。 M-MLV 逆転写酵素 (Promega、M170B) を使用して、適格な全 RNA を cDNA に逆転写しました。 実験操作は指示に従って実行されました。

2.2 CtCHS遺伝子のクローニング

私たちの研究グループ[16]のCistanche tubulosaの花トランスクリプトームデータに基づいて、完全なオープンリーディングフレームを持つCtCHSをスクリーニングし、SnapGeneソフトウェアを使用して遺伝子配列に基づいて特異的なプライマーを設計しました（表1）。 カンカンキの花cDNAを鋳型としてPCR増幅を行った。 増幅系は、2×Phanta Max Buffer 25 μL、dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL、上流および下流プライマー (10 μmol/L) 各 2 μL、cDNA 2 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、 ddH2O 17μL。 反応条件は次のとおりです。95 度で 3 分間予備変性。 95度で15秒間の変性、55度で15秒間のアニーリング、72度で1分間の伸長を25サイクル。 72度で5分間反応を延長。 PCR産物を1%アガロースゲル電気泳動で検出し、DNA精製キット(Novizan、Cat DC301-01)を使用してゲル回収し、回収したDNAをラピッドクローニングキット(Novizan、Cat DC301-01)で精製しました。 C601-01)。 DNA断片をpCE2TA/Blunt-Zeroベクターに連結し、大腸菌DH5コンピテントセルに形質転換し、37℃で一晩培養した後、単一クローン株を選択し、配列決定のために会社に送った。

表 1 プライマー配列

2.3 バイオインフォマティクス解析

ProtParam オンライン ソフトウェアを使用してタンパク質の物理的および化学的特性を分析します。 Prot Scale オンライン ツールを使用してタンパク質の親水性/疎水性を分析します。 オンラインツールSOPMAを使用してタンパク質の二次構造を予測します。 オンライン解析ソフトウェア SWISS-MODEL を使用してタンパク質の立体構造を予測します。 オンライン ソフトウェア TMHMM を使用して、タンパク質の膜貫通構造を予測します。 DNAMAN ソフトウェアを使用して、CtCHS の相同性を他の種の CHS アミノ酸配列と比較します。 MEGA-X ソフトウェアを使用して、近隣結合 (NJ) とポアソン補正を使用して系統樹を構築します。進化距離はブートストラップ法を使用して計算され、ブートストラップの繰り返し回数は 1000 回です。

2.4 CtCHS 原核生物の発現と精製

CtCHS配列に基づいて制限酵素BamHⅠおよびXhoⅠを含むプライマーを設計し、対応する標的断片をPCR増幅する。pET-28aベクターおよび標的断片は、エンドヌクレアーゼBamHIおよびを使用して消化された。クローン株は配列決定され、正しい配列決定後にプラスミドが抽出される。配列決定によって検証されたpET-28a-CtCHSプラスミドは、大腸菌BL21（DE3）コンピテント細胞に移された。イソプロピルアルコールを用いたDing Ningらの方法[17]を参照。

-D-チオガラクトピラノシド (IPTG) は、低温でタンパク質発現を誘導するために使用され、Ni2+ アフィニティー クロマトグラフィー カラム (Cytiva、カタログ 17531901) によって精製されました。 タンパク質を限外濾過チューブ(Millipore、30 000)内での遠心分離によって濃縮し、脱塩した。 20 mmol/L KPB バッファー (pH 8.0、1 mmol/LEDTA を含む) に保存し、長期保存の場合は -80 度の冷蔵庫に保存します。

2.5 CtCHS酵素活性分析

CtCHS酵素反応系：100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL、1 mmol/L マロニル-CoA 10 μL、5 mmol/L 4-クマロイル-CoA 2 μL、CtCHS recombinantタンパク質２０μＬを３７℃の水浴中で１２時間反応させた後、酢酸エチル８００μＬで３回抽出し、窒素気流で乾燥し、メタノール１００μＬに溶解した。 生成物の検出には高速液体クロマトグラフィーを使用します。 条件は、Ultimate LP-C18カラム(250mm×4.6mm、5μm)、カラム温度30度、サンプル量10μL、流量は水(A)、アセトニトリル(B)です。 相、溶出勾配：0～10

最小、30% B; 10~20分、30%~60%B; 20~25分、60%~70%B; 25~30分、70%~80%B; 30~35分、80%~100%B; 35-40 分、100% B; 40-46 分、100%-30% B. 体積流量は 1 mL/min、検出は 290 nm の波長で行われます。

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS をさらなる検出に使用しました。 液相条件は、Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 カラム (100 mm × 3.0 mm、1.7 μm)、カラム温度 40 度、ナリンゲニン-カルコンとナリンゲニンのコントロール。 生成物のローディングボリュームは4μL、酵素反応生成物のローディングボリュームは7μLである。 移動相として水(A)-アセトニトリル(B)を使用します。 溶出勾配は次のとおりです: 0 ～ 5 分、30% B; 5 ～ 15 分、30 %-60% B; 15-20 分、60%-100% B; 20-25 分、100% B; 25-31 分、100%-30% B. 体積流量は 0.3 mL/分です。 質量分析条件は、エレクトロスプレーイオン源、キャリアガスとして窒素、シースガス圧力３．５ＭＰａ、補助ガス圧力１．０ＭＰａ、スプレー圧力３５００Ｖ、キャピラリー温度３５０度、補助ガス加熱温度２００度、正イオンモードおよび負イオンモード、スキャンである。イオン範囲 m/z は 100-1500、フル MS 分解能は 35 000、dd-MS2 分解能は 17 500、(N)

CE/ステップ nce は 35、60 に設定されます。

2.3 バイオインフォマティクス解析

ProtParam オンライン ソフトウェアを使用してタンパク質の物理的および化学的特性を分析します。 Prot Scale オンライン ツールを使用してタンパク質の親水性/疎水性を分析します。 オンラインツールSOPMAを使用してタンパク質の二次構造を予測します。 オンライン解析ソフトウェア SWISS-MODEL を使用してタンパク質の立体構造を予測します。 オンライン ソフトウェア TMHMM を使用して、タンパク質の膜貫通構造を予測します。 DNAMAN ソフトウェアを使用して、CtCHS の相同性を他の種の CHS アミノ酸配列と比較します。 MEGA-X ソフトウェアを使用して、近隣結合 (NJ) とポアソン補正を使用して系統樹を構築します。進化距離はブートストラップ法を使用して計算され、ブートストラップの繰り返し回数は 1000 回です。

2.4 CtCHS 原核生物の発現と精製

CtCHS 配列に基づいて制限部位 BamHI および XhoI を備えたプライマーを設計し、対応するターゲット フラグメントを PCR で増幅します。 pET-28 ベクターとターゲット フラグメントはエンドヌクレアーゼ BamHI を使用して消化され、クローン株の配列が決定され、正しい配列決定後にプラスミドが抽出されます。 配列決定によって検証された pET-28a-CtCHS プラスミドを大腸菌 BL21 (DE3) コンピテント セルに導入しました。 Ding Ning et al.の方法を参照してください。 [17] イソプロピルと

-D-チオガラクトピラノシド (IPTG) は、低温でタンパク質発現を誘導するために使用され、Ni2+ アフィニティー クロマトグラフィー カラム (Cytiva、カタログ 17531901) によって精製されました。 タンパク質を限外濾過チューブ(Millipore、30 000)内での遠心分離によって濃縮し、脱塩した。 20 mmol/L KPB バッファー (pH 8.0、1 mmol/LEDTA を含む) に保存し、長期保存の場合は -80 度の冷蔵庫に保存します。

2.5 CtCHS酵素活性分析

CtCHS酵素反応系：100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL、1 mmol/L マロニル-CoA 10 μL、5 mmol/L 4-クマロイル-CoA 2 μL、CtCHS recombinantタンパク質２０μＬを３７℃の水浴中で１２時間反応させた後、酢酸エチル８００μＬで３回抽出し、窒素気流で乾燥し、メタノール１００μＬに溶解した。 生成物の検出には高速液体クロマトグラフィーを使用します。 条件は、Ultimate LP-C18カラム(250mm×4.6mm、5μm)、カラム温度30度、サンプル量10μL、流量は水(A)、アセトニトリル(B)です。 相、溶出勾配：0～10

最小、30% B; 10~20分、30%~60%B; 20~25分、60%~70%B; 25~30分、70%~80%B; 30~35分、80%~100%B; 35-40 分、100% B; 40-46 分、100%-30% B. 体積流量は 1 mL/min、検出は 290 nm の波長で行われます。

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS をさらなる検出に使用しました。 液相条件は、Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 カラム (100 mm × 3.0 mm、1.7 μm)、カラム温度 40 度、ナリンゲニン-カルコンとナリンゲニンのコントロール。 生成物のローディングボリュームは4μL、酵素反応生成物のローディングボリュームは7μLである。 移動相として水(A)-アセトニトリル(B)を使用します。 溶出勾配は次のとおりです: 0 ～ 5 分、30% B; 5 ～ 15 分、30 %-60% B; 15-20 分、60%-100% B; 20-25 分、100% B; 25-31 分、100%-30% B. 体積流量は 0.3 mL/分です。 質量分析条件は、エレクトロスプレーイオン源、キャリアガスとして窒素、シースガス圧力３．５ＭＰａ、補助ガス圧力１．０ＭＰａ、スプレー圧力３５００Ｖ、キャピラリー温度３５０度、補助ガス加熱温度２００度、正イオンモードおよび負イオンモード、スキャンである。イオン範囲 m/z は 100-1500、フル MS 分解能は 35 000、dd-MS2 分解能は 17 500、(N)

CE/ステップ nce は 35、60 に設定されます。

2.6 CtCHSタンパク質の細胞内局在

CtCHS配列とシームレスクローニングの原理に基づいて、酵素切断部位Kpn ⅠおよびBamH Ⅰを持つプライマーを設計し、対応する標的フラグメントをPCRによって増幅しました。 pCAMBIA1300-35S-GFP プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ Kpn Ⅰおよび BamH Ⅰで消化し、標的フラグメントとベクターをシームレス クローニング キット (Novizan、Cat C115-01) を介して接続し、移入しました。大腸菌 DH5 コンピテントセルに導入します。 、配列決定用の単一クローン株を選択し、正しい株からプラスミドを抽出します。 pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHSおよびpCAMBIA1300-35S-GFPプラスミドをPEG4000を使用してシロイヌナズナプロトプラストに形質転換し、低光下で8〜10時間培養しました。 CtCHS タンパク質の細胞内局在をレーザー共焦点顕微鏡で観察しました。

2.7 CtCHS発現パターン解析

リアルタイム蛍光定量プライマーは、内部参照遺伝子として F-box を使用し、CtCHS 配列に基づく DNAMAN を使用して設計されました。 プライマー配列を表 1 に示します。さまざまな色のカンクイの花における CtCHS の相対発現を、リアルタイム蛍光定量 PCR によって検出しました。 TransStart Green qPCR SuperMix (フルゴールド、AQ101-02) を使用して、SYBRGreen 蛍光色素法で測定します。 反応系：2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL、上流および下流プライマー（10 μmol/L）0 各 2 μL、cDNA テンプレート 0.5 μL、ヌクレオチダーゼフリー水 4.1 μL を使用二段階法による反応の場合。 反応手順は Dong Xianjuan らの方法に基づいています。 [18]。 各サンプルには 3 つの生物学的複製が含まれており、実験は 3 回繰り返されました。 実験データは Excel を使用して分析し、CtCHS の相対発現は 2-ΔΔCt 法を使用して計算し、GraphPadPrism 8 を使用して有意性分析を実行し、ヒストグラムを作成しました。