高次の制御の組み合わせを発見し、神経分化のための遺伝子ドライバーを操作するための組み合わせ遺伝学手法
Apr 18, 2023
効果的な細胞分化因子の探索に踏み込む
研究者たちは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病などの神経疾患を回復または進行を遅らせる、より良い治療法を見つけるために今も努力しています。 これらの障害は、脳のさまざまな部分における神経細胞死の結果です。 患者の症状を軽減するために使用される薬物療法や治療法は十分に確立されていません。
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損傷した神経組織は回復せず、望ましくない副作用が生じる可能性があります。 したがって、幹細胞の自己再生能力と、失われた神経組織を回復するために患者に移植するための所望の細胞系統への分化の柔軟性により、幹細胞を有望な治療法として注目する研究が増加している。
しかし、幹細胞が神経疾患の治療に臨床的に使用される前に、その可能性を最大限に引き出すためには、より深い理解が必要な領域がまだあります。 幹細胞は再生可能で順応性があり、分化を促進する因子が適切に組み合わされれば、あらゆる種類の細胞になる傾向があります。 ただし、大規模な要因のネットワークには非常に複雑な要素があります。
胚性幹細胞（ESC）や人工多能性幹細胞などの幹細胞を最速で分化させるための最適な相乗効果を達成するには、転写因子（TF）、小分子、および/または成長因子の組み合わせを決定することが重要です。神経系統の最も純粋な集団の中で。 ただし、よりコスト効率と時間効率の高い方法でこれらの要因をスクリーニングする戦略的な方法がある可能性があります。
これは、まだ手間のかかるすでに確立されたプロトコルの最適化や、中型有棘ニューロン、感覚ニューロン、セロトニン作動性ニューロンなどのニューロンのサブタイプのさらなる特性評価に役立ちます。 神経細胞の運命の推進力を包括的にプロファイルし、これらの要素が制御ネットワーク内でどのように相互作用するかを定義することは依然として課題です。
いくつかのグループは、新しいハイスループットスクリーニングアプローチを使用して細胞運命の制御ネットワークを解明し、ニューロンの変換と生存を促進する要因について有益な洞察を提供しました。 劉ら。 (2018) CRISPR 活性化 (CRISPRa) を使用して、ESC の神経細胞運命を促進する TF または DNA 結合因子を検索しました。 ただし、その研究は単一の因子またはペアごとの組み合わせの研究に限定されていました。
別の系統的なスクリーニングが常本らによって行われた。 （2018）、TF間の関係を調査しました。 彼らが選択した単一TFのほとんどはこの研究では効果を示さなかったが、マウス線維芽細胞の誘導ニューロンへの分化を促進する76のペアワイズTFの組み合わせを同定した。
注目すべきことに、彼らの結果は、おそらく追加の因子を見逃したため、誘導されたニューロンではドーパミン活性輸送体Slc6a3が検出されないなど、以前の研究とある程度の一貫性を欠いていた。 別の研究では、CRISPR干渉（CRISPRi）ベースのスクリーニングを実施することにより、ニューロンの生存を維持または改善するために必須の遺伝子を決定しました（Tian et al.、2019）。 また、それらは単一の sgRNA のスクリーニングに限定されていました。
分化と再プログラミングを効率的に推進するには、さまざまな状況で 2 つ以上の因子のカクテルが必要である可能性があることが示されているため、他の遺伝因子についての公平なスクリーニングと、因子の組み合わせの数を増やすためには、さらなる研究が必要です。
良い例は、ESC の多分化能のための発生シグナル伝達ネットワークを調節するために必要な Oct4、Sox2、Klf4、および c-Myc の組み合わせです (Takabashi and Yamaha、2006)。 このような複雑なシステムでは、高次の遺伝子の組み合わせの機能をハイスループットで包括的に特徴付ける必要があり、Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) 法がそれを可能にする可能性があります。
高スループット、高次、系統的な因子の組み合わせのスクリーニングのための CombiGEM メソッド
CombiGEM は、大規模なプールされたスクリーニングを実行する体系的な方法を提供するだけでなく、高次の組み合わせ遺伝子ライブラリのスケーラブルなアセンブリの機能も備えています (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020)。 ワンポットプロセスにより、ユーザーは多数の遺伝子の組み合わせをスクリーニングすることができます。 1- ウェイ、2- ウェイ、3- ウェイ、理論的には n-way ライブラリ。
これにより、対象となる個々の候補の組み合わせを構築およびテストする従来のプロセスに代わる迅速な代替手段が提供されます。 一方、ペアごとの遺伝子の組み合わせを研究するために、他のいくつかの組み合わせCRISPRスクリーニング戦略も開発されました（Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020） )、CombiGEM は、3 つ以上の遺伝子の組み合わせ間の相互作用を評価するユニークな機会を提供します。
たとえば、ユーザーが候補 TF 組み合わせのリストをそれぞれ過剰発現または抑制するために CRISPRa または CRISPRi を使用することを目的としている場合、CombiGEM-CRISPR v2 を使用して TF をターゲットとする sgRNA 組み合わせのバーコード化ライブラリをスクリーニングできます。0 ( Wong et al.、2016; Zhou et al.、2020）を図 1 に示します。
ワンポットライゲーションステップを使用することにより、sgRNA のライブラリーとそのそれぞれのバーコードが、チューブリン 1 などのニューロン細胞タイプ特異的プロモーターの活性化による蛍光タンパク質の発現を報告するレンチウイルスデスティネーションベクターに組み込まれます。 sgRNA と、転写活性化因子またはリプレッサーと融合した酵素欠損 Cas9 を含む別のレンチウイルス ベクターを、目的の開始細胞に送達することができます。
時間の経過とともに、細胞が分化し始めると、誘導されたニューロン様細胞のみが蛍光を発現するようになり、これらの細胞は、蛍光活性化セルソーティングを使用して単離され、バーコードシークエンシングによってそれらの保有するTFの組み合わせを取得できます。
特定の細胞系譜を駆動する組み合わせをより深く理解するために、ユーザーが研究対象として選択した分化段階の好みに基づいて、これらの細胞を既知の細胞系譜レポーターまたはマーカーについてプローブすることもできます。 磁気活性化セルソーティングを使用すると、細胞表面マーカーの発現に応じて目的の細胞を分離できます。
単一細胞 RNA シーケンスは、遺伝子の上方制御または下方制御の種類とレベルをプロファイリングするための読み取り値としてコンビナトリアル CRISPR スクリーニングと組み合わせることができ、標的 TF の組み合わせはバーコード読み取りを介して決定できます (Replogle et al., 2020)。 ハイコンテンツイメージングは、ニューロン発達の初期段階から後期段階までの細胞形態の変化を監視するために使用できます。
誘導されたニューロン様細胞の生理学的関連性または機能性は、NeuN、TUJ1、MAP2 などのニューロン成熟に特異的な免疫細胞化学的標識および電気生理学的測定によって決定できます。 前述したように、細胞運命を操作するために TF と小分子を組み合わせた研究が行われています。
CombiGEM は、幹細胞の自己複製を維持したり、細胞系譜の分化を誘導したり、効率を高めて遺伝因子を置き換えることにより再プログラミングを促進したりできる小分子の組み合わせを同定するためにも使用できます。 CombiGEM は、シグナル伝達経路、エピジェネティック、または細胞プロセス因子の小分子ターゲットを最初に決定することによっても適用できます。
次に、創薬可能な標的を活性化または不活性化するための sgRNA ライブラリーを設計することで、分化または再プログラミングを強化する小分子の効果的な組み合わせを特定できます。 この概念は、癌とパーキンソン病に対する薬物標的の組み合わせを発見するために私たちが以前に実施した研究によく反映されています(Zhou et al., 2020)。
CombiGEM の使用は、CRISPR ベースの摂動に限定されるものではなく、RNA 干渉による機能喪失スクリーニングや発現による機能獲得スクリーニングを研究するために、他の DNA または RNA 調節因子にも適用できます。マイクロRNA（Wong et al., 2015）およびヒトTFomeライブラリーで報告されているものなどの配列検証されたヒトオープンリーディングフレーム（Ng et al., 2020）。
転写因子のハイスループットエンジニアリングのための CombiSEAL メソッド
天然に存在する遺伝因子の理想的な組み合わせを見つけるには、その発現と分化における役割についての事前知識があるゲノムの特徴付けられた TF に限定されるなど、依然として課題が生じる可能性があります。 研究では、TFの操作や人工転写因子の生成が、遺伝子制御ネットワーク内の他の内因性補因子の必須発現の依存性を超え、あるいは完全に代替経路を通じて分化速度を速める新たな選択肢の道を開くことを実証している。自然な TF とより効率的な TF (Jauch、2018)。
これにより、研究者は実験のニーズに応じて必要な要素を調整することができます。 私たちは、異なるドメインを含む TF に対して複数の部位でハイスループットの突然変異誘発を行うことを目的とする場合、CombiSEAL が有用なプラットフォームになる可能性があると提案します (Choi et al., 2019)。 CombiSEAL メソッドは、バーコードで組み合わせてタグ付けされたアミノ酸をコードする DNA フラグメントを組み立てます (図 1)。
図 1 ｜ 分化の効果的な遺伝的ドライバーをスクリーニングする CombiGEM および CombiSEAL メソッド。 CombiGEM 法の例は、同じ構築物から発現された複数の sgRNA のアセンブリであり、sgRNA の組み合わせはそれらの連結されたバーコードによって表されます。 CombiSEAL 法は、P1、P2、P(n)、および P(n プラス 1) として示される、転写因子などのタンパク質のさまざまな部分に導入された変異で構成されます。 そして、変異の組み合わせは、対応する連結されたバーコードに反映されます。 ユーザーはセットアップを他の DNA 送達システムに適用できます。この図ではレンチウイルス ベクターが使用されています。 スクリーニング戦略はプール形式で実行でき、この例では、特定のニューロン系統に分化する細胞集団の同定は、図で X 蛍光とラベル付けされた蛍光タンパク質発現用のプロモーターの活性化によって検出されます。 細胞プールからのバーコードの次世代シーケンシング (NGS) により、DNA ターゲットまたは転写バリアントが解読されます。 さまざまなニューロンタイプの分化を促進する因子の厳密な分析には、細胞系譜マーカーによる細胞のプローブとそれに続くマルチウェルプレートへの磁気活性化セルソーティング（MACS）などのアレイベースの方法を使用できます。ハイコンテンツイメージング。 あるいは、単一細胞 RNA シークエンシング (RNA-Seq) を使用すると、ユーザーは目的の表現型を持つ細胞の遺伝子発現をプロファイリングすることができ、バーコードを取得して sgRNA の組み合わせや主要なバリアントの変異の組み合わせを特定することができます。 FACS: 蛍光活性化細胞選別。
CombiSEAL は、突然変異誘発が必要なタンパク質の最初の部分を切断することから始まります。 ユーザーはセクションごとに任意の数の変異を生成し、バーコードでタグ付けして変異の位置と組み合わせを識別できます。 次に、切片の各プールは、意図する突然変異誘発の領域で隣接型 IIS 酵素で修飾された野生型タンパク質配列を含むデスティネーション ベクターに挿入することによって、順番に組み立てられます。
タンパク質の複数の部分を結合するこの傷のない融合スキームは、タンパク質への不要なアミノ酸の追加を避けるために重要です。 CombiSEAL メソッドを使用すると、選択した目的のバリアントのプールのアミノ酸配列をより効率的かつコスト効率よく決定でき、突然変異の種類とその位置を特定するためにタンパク質全体にわたるロングリード シーケンスを行う必要がなくなります。タンパク質。
この体系的なセットアップにより、アミノ酸変異の種類と位置の組み合わせ、またはドメインの交換、挿入、欠失などのその他の望ましい修飾を推測する、短い連結バーコードのプールのハイスループットシークエンシングを実行することにより、分析が容易になります。最初に設計され、TF にインストールされました
結論
試行錯誤による方法と比較して、1 つの細胞型からニューロン系統への変換を促進するために必要な必須の因子や組み合わせを決定するための、より体系的なアプローチの採用が進歩しました。 しかし、高次の組み合わせを識別する能力は不足しており、ここで、CombiGEM 手法がそのような制限に対処できる可能性があることを提案します。
CombiGEM は、バーコード付きのワンポット ライゲーション システムを使用して、DNA 結合因子の高次の組み合わせを一度にまとめてターゲット DNA に結合し、複数回のスクリーニング プロセスを回避して、下流の検証で管理可能なサイズにヒット数を絞り込みます。 。 さらに、遺伝子発現をより適切に制御するために、効率の低い天然の TF を人工または操作された TF に置き換えることができます。 我々は、タンパク質変異誘発法である CombiSEAL について説明します。これにより、ユーザーは、タンパク質およびその異なるドメイン内でバーコードでタグ付けされた複数の部位変異を直接組み立てることによって、転写因子変異体の大規模なプールを作成できます。
これにより、対象となる変異体の変異の種類に関する情報を取得するためのスクリーニング手順が高速化され、コストが削減されます。 提案された方法が神経再生促進のさらなる理解と可能性の拡大に役立ち、他の研究分野にも広く適用できることを願っています。
シスタンケ神経保護効果のメカニズム
シスタンケは、いくつかのメカニズムを通じて神経保護効果があることが示されています。
1. 抗炎症作用: シスタンシュには、脳のさまざまな部分の炎症を抑制することが証明されている化合物が含まれており、ニューロンを損傷から保護するのに役立ちます。
2. 抗酸化作用：Cistancheには強力な抗酸化作用を持つ化合物が含まれています。 抗酸化物質は、フリーラジカルや酸化ストレスによって引き起こされる損傷からニューロンを保護するのに役立ちます。
3. 神経伝達物質の調節：Cistanche は、セロトニンやドーパミンなどの特定の神経伝達物質を調節し、ニューロンの保護と認知機能の改善に役立つことが示されています。
4. 神経栄養因子の刺激：Cistanche は、ニューロンの成長と生存を促進する脳由来神経栄養因子 (BDNF) などの神経栄養因子の産生を刺激することが示されています。
全体として、これらのメカニズムは連携してニューロンを損傷から保護し、成長と生存を促進し、認知機能を向上させます。
参考文献
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