デンドリマー-テサグリタザール複合体はミクログリアの表現型変化を誘導し、アミロイド貪食を増強する† パート 1
Jul 15, 2024
ミクログリアを疾患を悪化させる「炎症誘発性」状態から神経保護的な「抗炎症性」表現型に切り替えることは、複数の神経変性疾患に対処するための有望な戦略である。
ミクログリアは中枢神経系の細胞の一種であり、主にニューロンの健康と機能の維持に関与しています。それらは、さまざまな成長因子や神経栄養因子を分泌することができ、ニューロンの周囲の老廃物を除去することによってニューロンの正常な代謝活動を維持することができます。近年の研究では、ミクログリアが記憶と密接に関係していることが示されています。一緒に見てみましょう。
まず、ミクログリアはニューロンを刺激し、ニューロンの活性化を促進し、それによって記憶力を高めることができます。グルタミン酸やアラニンなどの一連の神経伝達物質を放出することで、ミクログリアはニューロン間の信号伝達を促進し、シナプス前膜間のグリアニューロン信号共鳴を強化し、ニューロンの興奮性と記憶形成をさらに促進します。
第二に、ミクログリアはニューロンの周囲の老廃物を除去し、ニューロンの正常な代謝活動を維持し、ニューロンの死亡率を低下させ、それによって記憶力の改善を促進することもできます。ニューロンの周囲にゴミが蓄積しすぎると、ニューロンの正常な代謝活動に影響を及ぼし、ニューロンの死滅や機能の低下を引き起こし、その結果、記憶力が低下します。ミクログリアは、周囲の老廃物を飲み込んで分解することでニューロンの正常な代謝環境を維持し、ニューロンの死亡率を低下させ、それによって記憶力を向上させることができます。
要約すると、ミクログリアは記憶と密接に関係しています。ミクログリアはニューロンの興奮を促進し、周囲の老廃物を除去することで、記憶力をさらに向上させ、私たちの脳を健康で活発に保つことができます。より良い記憶力を実現するには、ミクログリアの健康を守ることに注意を払う必要があります。私たちは記憶力を改善する必要があることが分かります。カンザスは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であり、そのうちの 1 つが記憶力の向上であるため、カンザスは記憶力を大幅に向上させることができます。シスタンケの効能は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体などを含む、含まれるさまざまな有効成分によるものです。これらの成分は、さまざまな方法で脳の健康を促進します。
炎症誘発性ミクログリアは、神経毒性物質を放出し、病原性タンパク質の蓄積を加速することにより、疾患の進行に寄与します。 PPARとPPARアゴニストはどちらも、ミクログリアを炎症促進性（「M1-様」）表現型から代替活性化（「M2-様」）表現型に移行させることが示されています。このような戦略は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経疾患の臨床試験で検討されてきたが、血液脳関門（BBB）の透過性が低いために失敗した可能性が高い。
ヒドロキシル末端ポリアミドアミンデンドリマー（ターゲティングリガンドが結合していない）は、神経炎症部位の障害のあるBBBを通過し、活性化されたミクログリアに蓄積することが示されています。
したがって、PPAR/デュアルアゴニストのデンドリマー結合により、活性化ミクログリアの標的表現型スイッチングが可能になる可能性があります。ここでは、新規デンドリマー PPAR / デュアル アゴニスト複合体 (D-テサグリタザール) の合成と特性評価を紹介します。
インビトロで、D-テサグリタザールは「M1からM2」表現型の変化を誘導し、活性酸素種の分泌を減少させ、食作用および病原性タンパク質（例えば、アミロイド、シヌクレイン）の酵素分解のための遺伝子の発現を増加させ、アミロイド食作用を増加させる。
これらの結果は、複数の神経変性疾患、特にアルツハイマー病やパーキンソン病の翻訳に向けた D-テサグリタザールのさらなる開発を裏付けるものです。
導入
米国だけでも、現在アルツハイマー病 (AD) 患者が 530 万人以上、パーキンソン病 (PD) 患者が 100 万人以上います 1。 多くの神経変性疾患の最大のリスク要因は加齢であるため、これらの疾患の有病率と治療費は増加傾向にあります。人口の高齢化が進むにつれて、今後も増加し続けるでしょう。
さらに、これらの疾患を治療するための新薬の開発が最近成功していないことから、革新的な治療法の開発の必要性が浮き彫りになっています。 2,3 これらの臨床的失敗は、有効性を得るために十分な濃度の薬剤を脳に送達することを含め、薬剤開発の難しさを浮き彫りにしています。有害な副作用を引き起こします。
AD や PD などの神経変性疾患は、神経炎症、病原性タンパク質の蓄積、神経細胞死という 3 つの主要な神経病理学的要素を共有しています。 4-7 健康でない人では、脳の自然免疫細胞 (ミクログリア) がミスフォールドしたタンパク質 (アミロイド、シヌクレインなど) を常に貪食します。 ）生成時にニューロン死を引き起こし、特徴的な凝集体の形成を妨げます。
しかし、最終的に神経変性疾患を発症する人では、ミクログリアがこれらのタンパク質を効果的に除去できなくなり、疾患を悪化させる炎症誘発性表現型（通常は M1 と呼ばれる）に移行します。
ミクログリア活性化の主に炎症促進性/抗炎症性 (M1/M2) 分類は、マクロファージの極性化のスペクトルを過度に単純化したものですが、神経炎症および治療への反応におけるミクログリアの主な表現型を説明する広範な命名法として今でも使用されています。
1- のようなミクログリアは、活性酸素種やその他の炎症性メディエーターを放出し、病原性タンパク質（アミロイド、シヌクレインなど）の産生を増加させることで神経細胞死を誘発し、病状を悪化させます。
さらに、AD発症の主要な遺伝的危険因子（TREM2およびAPOE）はミクログリアで高レベルで発現されており、TREM2/APOE経路はAD、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および多発性硬化症におけるアミクログリアの表現型変化を引き起こすことが示されています。動物モデル.8
これらの発見は、複数のヒト神経変性疾患の病理におけるミクログリアの役割をさらに実証している。ミクログリアの表現型を操作するアプローチにより、研究者は、効果的な治療法となる可能性があるだけでなく、神経変性疾患におけるミクログリアの役割を理解できるようになります。
ミクログリアを M1 表現型から抗炎症性および神経保護性 (M2) 表現型に切り替えることは、複数の神経変性疾患を治療するための治療戦略として提案されています。 5,6 現在 FDA に承認されている 2 つの PPAR アゴニスト、II 型糖尿病薬のロシグリタゾンとピオグリタゾンは、 in vitro および in vivo でのマクロファージおよびミクログリアの M1 から M2 表現型の変化。
PPAR アゴニストは、NF-κB の分解と核からの輸送、およびリガンド依存性のトランス抑制を誘導することで NF-κB の活性を低下させ、LPS によって誘発される活性酸素種の分泌を減少させることが示されています。11
さらに、疫学研究では、ロシグリタゾンまたはピオグリタゾンを服用している糖尿病患者は、ADおよびPDを発症するリスクが低下していることが示されています12。その後、ロシグリタゾンとピオグリタゾンは、ADに対する第III相臨床試験を通じて研究されましたが、失敗しました13。
前述の臨床試験の失敗について考えられる説明の 1 つは、血液脳関門 (BBB) を通過するこれらの薬物の輸送が不十分であり、そのため、これらの臨床試験に登録された患者の脳に到達する薬物の数が制限されていることです。14
実際、BBB はすべての小分子薬剤の約 98% が脳に到達するのを妨げ、脳に進入した薬剤の一部のみがミクログリアに到達すると推定されています。
さらに、PPAR は PPAR ファミリーの別の核受容体です 16。PPAR は脂質恒常性および炎症の調節に役割を示し、PPAR アゴニストはミクログリアで抗炎症効果を示すことも示されています。
神経画像化、死後組織分析、およびCSFバイオマーカーを使用した臨床研究は、ADおよびPD、ならびに他の神経変性疾患においてBBBが障害されるという証拠を提供している。
17 世代の-4ヒドロキシル末端ポリアミドアミン（G4-PAMAM-OH）デンドリマーは、複数の異なる神経炎症疾患モデルでの全身投与後、損傷したBBBを本質的に回避し、標的リガンドを必要とせずに活性化されたミクログリアに蓄積することが示されています。げっ歯類、ウサギ、イヌ、およびヒト以外の霊長類を含む。18-28 重要なことに、G4-PAMAM-OH は、レット症候群などの軽度の BBB 破壊を伴う疾患モデルにおいて全身投与でき、BBB を通過することができる。29
さらに、G4-PAMAM-OH の脳への取り込みの程度は、脳性麻痺のウサギモデルにおける疾患の重症度に直接比例します。ポリεカプロラクトンやPEG、負に帯電したPAMAMデンドリマー、量子ドット、ポリエチレンイミン（PEI）やデキストラン硫酸からなるナノ製剤などの他のナノ粒子を用いた以前の研究で必要とされた頭蓋骨。
さらに、これらのヒドロキシル PAMAM デンドリマーは、その拡張性と忍容性の高い in vivo 安全性プロファイルにより、翻訳に理想的な位置にあります。36-38 前臨床有効性データが肯定的であるため、(G4-PAMAM-OH)-N-アセチル-システイン複合体は現在、小児脳副腎白質ジストロフィー（NCT03500627）および重症コロナウイルス感染症2019（COVID-19）関連炎症（NCT04458298）を対象とした初期臨床試験で評価中です。
私たちは、世代-4ヒドロキシル末端PAMAMデンドリマーに結合したテサグリタザール(Tesa)のデンドリマー-薬物複合体を研究しました。テサグリタザールは、PPAR と PPAR アゴニストの有益な効果を組み合わせた強力な PPAR / デュアル アゴニストです。これには、デンドリマーへの共有結合とその後の放出のためのカルボン酸官能基が含まれています。
追加のギターが開発され、臨床的にテストされましたが、PPAR に対する PPAR の活性比が大きいこと、比較的単純な化学構造、および安全性プロファイルにより、Tesa が選択されました。
Tesa は以前、米国で 2 型糖尿病の第 III 相臨床試験に到達しましたが、用量依存性の毒性のため失敗しました。この毒性は、制御されたデンドリマー送達によって必要な投与量を減らすことで防止できる可能性があります。 PPAR/デュアルアゴニストであるため、神経炎症部位の活性化ミクログリアへの標的送達は非常に有益である可能性があります。
本明細書では、デンドリマー-テサグリタザール複合体（D-Tesa）の合成と特性評価を実証し、この化合物がミクログリアの「M1からM2」表現型変化を誘導し、蛍光標識βアミロイドの貪食を増強する能力を実証する。
材料と方法
材料
1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミドメチオジド(EDC)、4(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、CuSO4・5H2O、アスコルビン酸ナトリウム、ヘキシン酸、ウシ血清アルブミン(BSA) は Sigma Aldrich US (ミズーリ州セントルイス) から購入し、受け取ったまま使用しました。
テサグリタザールは、AstaTech Inc. (ペンシルベニア州ブリストル) から入手しました。エチレンジアミンコアＰＡＭＡＭデンドリマー（６４個のヒドロキシル末端基を有する第４世代）は、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（ミシガン州ミッドランド）からメタノール溶液として入手した。
デンドリマーをメタノール中で４℃で保存し、使用前にメタノールを蒸発させた。 １ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する透析膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ニューブランズウィック）から購入した。
他のすべての溶媒は、受け取ったままの無水形態で使用しました。銅(I)、触媒によるアルキン-アジド付加環化反応 (CuAAC) クリック反応を除くすべての反応は、不活性窒素下でオーブンで乾燥させたガラス器具を使用し、有機媒体中で無水条件下で実施しました。雰囲気。
細胞培養用: ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、ウシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン - ストレプトマイシン (P/S)、0.05% トリプシン - EDTA、および MTT 試薬は Invitrogen (カリフォルニア州カールズバッド) から入手しました。 、米国）。
Griess 試薬は Promega (ウィスコンシン州マディソン) から入手し、TNF-ELISA は R&D Systems (ミネソタ州ミネアポリス) から入手しました。分析グレードのメタノールは Sigma-Aldrich から購入しました。トリパンブルーは、Corning (米国バージニア州マナサス) から入手しました。
D-Tesa コンジュゲートの合成手順
テトラエチレン グリコール モノアジド (2) は、以前に公開されたプロトコルを使用して合成されました。45
Tesa-TEG-アジドの合成と精製 (3)。
Tesa(950mg、2.32mmol)を10mlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。この撹拌溶液に、ＤＭＦ（１ｍｌ）中のテトラメチレングリコールモノアジド（２、６６２．１ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ）を滴下した。次いで、ＤＭＡＰ（２５５．４ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５７７．５ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、反応物を窒素パージ下、室温で２４時間撹拌した。
反応は、薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して監視した。反応混合物を１００ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈し、粗反応混合物を分液漏斗に移し、続いて有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で３回、続いて飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し、最後にブラインで洗浄した。
次いで、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、ロータリーエバポレーターを使用して有機層中の溶媒を除去し、溶液を３ｍｌのＤＣＭに再溶解し、シリカゲルに吸収させて、溶媒として酢酸エチル／ヘキサンを用いた勾配法を使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィーシステムで精製して、透明な３を生成した。 -黄色のオイル。
目的の純粋な生成物は、約 30 ～ 40% 酢酸エチルで溶出されます。 (収率: 70%。) 1H NMR (500 MHz、CDCl3) δ 7.27 (d, J=8.6 Hz, 2H)、7.15(d, J=1.9 Hz、2H)、 7.08 (d, J=8.6 Hz, 2H)、6.73 (d, J=8.6 Hz,2H)、4.25 ～ 4.14 (m, 2H)、4.07 (t, J {{ 33}}.8 Hz、2H)、3.94 (dd、J =7.8、5.2 Hz、1H)、3.67 ～ 3.47 (m、14H)、3.30 (dd、J=8.7) 、3.8 Hz、2H)、3.06 (s、3H)、3.02 (t、J=6.7 Hz、2H)、2.91 ～ 2.84 (m、2H)、1.08 (t、J=7 .0 Hz、3H)。ESI-MS: 理論値 C28H39N3O10S: 609.24、実測値 (M + 1): 610.13。
D-YNE の合成と精製 (5)。
(480 mg、4.22 mmol)を、20 mlの無水DMF中のG4-PAMAM-OH (2.5 g、0.176 mmol)の撹拌溶液に加えた。この混合物に、ＤＭＡＰ（４３０ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１ｇ、５．２８ｍｍｏｌ）を加えた。
反応混合物を窒素パージ下、室温で２４時間撹拌した。反応が完了したら、反応混合物を１０００ＭＷＣＯ透析チューブに移し、ＤＭＦ透析を２４時間実施し、ＤＭＦを約６時間ごとに交換した。
次いで、水を約６時間ごとに交換しながら、脱イオン（ＤＩ）水による透析を２４時間実施した。最後に、得られた透析チューブの内容物を 48 時間凍結乾燥し、白色のふわふわした粉末を得ました。(収率: 61%) 1H NMR (500 MHz、DMSO) δ 8.10-7.67 (m、デンドリマー内部アミド H)、4.72 (s、デンドリマー表面 OH)、4.01 (t、エステル –CH2)、3.32 (m、デンドリマー –CH2)、3.06 (m、デンドリマーおよびリンカー –CH2)、2.85–2.58 (m、デンドリマー –CH2)、2.56–1.89(m、デンドリマーとリンカー –CH2)、1.78–1.61 (m、リンカー –CH2)。D-Tesa の合成と精製 (6)。
Tesa-TEG-アジド (3,177.8 mg、0.3{{10}}3 mmol) を D-YNE(5, 35{{2{{27}) の撹拌混合物に加えた}}} mg、0.023 mmol) を、マイクロ波反応器対応の 20 ml バイアル中で、テトラヒドロフラン (THF) と水と 0.5 ml の DMF の 1:1 混合物 5 ml に溶解します。 CuAAC クリック反応では、硫酸銅五水和物 (11.6 mg、0.0467 mmol) および (+)-ラスコルビン酸ナトリウム (9.3 mg、0.0467 mmol) を反応混合物に加えました。
バイアルを密封し、次いで反応容器をBiotage（登録商標）Initiatorマイクロ波反応器に置き、50℃で8時間撹拌しながら20Wのマイクロ波照射下で反応させた。反応混合物を１０００ＭＷＣＯ透析チューブに移し、約４時間ごとにＤＭＦを新しい溶媒と交換しながら、ＤＭＦ透析を２４時間実施した。
次に、透析チューブの内容物をアファルコンチューブに移し、等量の脱イオン水を加えた。さらに、200μlのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液をファルコンチューブの内容物に加えた。
次いで、この混合物を新しい１０００ＭＷＣＯ透析管に入れ、ＥＤＴＡ溶液を添加した１０００ｍｌのＤＩ水中で１２時間透析を実施し、続いて１２時間水透析を行った。
次いで、混合物を48時間凍結乾燥し、白色のふわふわした粉末を得た。 (収率: 64%。) 1H NMR (500 MHz、DMSO) δ 8.2-7.6 (m、デンドリマー内部アミド H)、7.36 (d、Tesa ArH)、7.21 (d、Tesa ArH)、7.03 (d、TesaArH)、6.76 (d、Tesa ArH)、4.37 (s、Tesa H)、4.18–4.04 (m、リンカー H)、3.96 (dd、Tesa およびリンカー H)、3.70 (m、Tesa およびリンカー H) ,3.58–3.14 (m、デンドリマー –CH2)、3.14–2.86 (m、デンドリマー –CH2)、2.87–2.49 (m、デンドリマーおよびリンカー –CH2)、2.25 (m、デンドリマー –CH2) 、1.82–1.67 (m、リンカー –CH2)、0.97 (t、Tesa –CH3)。
特性評価手法
核磁気共鳴 (NMR)。 ＮＭＲスペクトルは、室温でＢｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ分光計で記録した。プロトンの化学シフト (δ) は ppm で報告されます。
1H NMR を使用して、δ 7.6 ～ 8.2 ppm のデンドリマーの内部アミド プロトンのピークと、δ 7.36 ～ 6.76 ppm の Tesa の芳香族プロトンおよびデンドリマーのメチル プロトンのピークを比較することにより、プロトン統合法によって D-Tesa の各分子に結合した Tesa 分子の数を決定しました。脂肪族領域の Tesa。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)。
１５２５バイナリポンプ、インライン脱気装置ＡＦ、７１７プラスオートサンプラー、２９９８フォトダイオードアレイ検出器、およびＷａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアとインターフェースした２４７５マルチλ蛍光検出器を備えたＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用した。
粒径５μｍ、長さ２５ｃｍ、内径４．６ｍｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８逆相カラム（東ソー、日本）を使用した。 PDA 検出器を使用して、化合物を 210 nm および 254 nm でモニタリングしました。
溶媒 A は、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) を含む HPLC グレードの水で、溶媒 B は、5% 水および 0.1% TFA を含むアセトニトリル (ACN) でした。使用したメソッドは 1{ {7}}0 : 0 (ACN: 水)、5 分で 10:90 (水: ACN) に減少、その極性を 15 分間維持し、5 分で 100:0 (ACN: 水) に戻りました。流速は1 ml min-1に維持した。質量分析。
ESI-MS は、溶媒系としてアセトニトリル/水 (9:1) を使用し、BrukermicroTOF-II 質量分析計で実行されました。プロトン化ピーク [M + nH]n+ または付加物 [M + nX]n+ (X=Na、K、または NH4) としての分子イオンを使用して実験式を確認しました。
動的光散乱とゼータ電位。 50 mW He-Ne レーザー (633 nm) を備えた Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd、Worchester、UK) を利用して、粒子サイズと zeta 電位分布を測定しました。 D-Tesa を、DLS については 0.2 mg ml-1 の濃度になるまで脱イオン水に溶解し、ζ 電位については 0.1 mg ml-1 の濃度になるまで 10 mM 塩化ナトリウムに溶解しました。
測定は、前述のように 173 度の散乱角を使用して 25 度で行われました。27,46 薬物放出研究。 Ｄ－Ｔｅｓａを、血漿条件を模倣するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）またはリソソーム条件を模倣するクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）のいずれかに１ｍｇ ｍｌ －１ の濃度で溶解した。
ブタ肝臓由来のエステラーゼ（Sigma Aldrich 製）を放出研究の開始時にクエン酸ナトリウム溶液に添加し、研究中ほぼ 3 日ごとに補充しました。
各バイアルには 15 ml のサンプルが含まれており、実験中は 37 度で継続的に振とうされました。異なる時点で、各 pH から 200 μl のサンプルを 2 つずつ収集し、その後 200 μl のメタノールを加えることによってエステラーゼ活性を停止させました。ゼロ時間時点のサンプルは対照として機能しました。
加水分解をさらに避けるために、サンプルは -80 度で保管されました。サンプルを HPLC でさらに分析し、遊離薬物ピークの曲線下面積 (210 nm) を計算しました。既知濃度の遊離テサを２１０ｎｍでＨＰＬＣで分析する検量線を利用することにより、曲線の下の面積を放出された薬物の量と相関させた。
For more information:1950477648nn@gmail.com
