ジアミンオキシダーゼノックアウトマウスは、経口または皮下投与されたヒスタミンに対して過敏症ではない
Jun 26, 2023
概要
1. 目的
外因性ヒスタミンの不活化における内因性ジアミンオキシダーゼ (DAO) の寄与を評価し、ヒスタミン感受性が増加したマウス系統を見つけ、ヒスタミン負荷モデルにおける rhDAO の有効性をテストする。
2. 方法
ジアミンオキシダーゼノックアウト（KO）マウスに、急性腎障害を模倣するために、アドレナリン遮断薬プロプラノロール、2つのヒスタミン-N-メチルトランスフェラーゼ（HNMT）阻害剤メトプレンおよびタクリン、葉酸と組み合わせたヒスタミンを経口および皮下投与してチャレンジし、治療した。組換えヒトDAOを使用。 中核体温は皮下に埋め込まれたマイクロチップを使用して測定され、ヒスタミン血漿レベルは均一時間分解蛍光アッセイを使用して定量されました。
3. 結果
中核体温および血漿ヒスタミンレベルは、急性腎損傷またはHNMT阻害剤の投与の有無にかかわらず、経口および皮下ヒスタミンチャレンジ後の野生型(WT)マウスとDAO KOマウスの間で有意な差はなかった。 組換えヒト DAO による治療により、深部体温低下の平均曲線下面積 (AUC) が 63 パーセント (p=0.002) 減少し、臨床スコアが 88 パーセント (p<0.001). The AUC of the histamine concentration was reduced by 81%.
4. 結論
外因性ヒスタミンの不活化は、酵素分解や腎臓の濾過によって引き起こされるものではありません。 組換えヒト DAO による治療は、ヒスタミン誘発性の中核体温低下とヒスタミン濃度を大幅に低下させ、重篤な臨床症状の発現を防止しました。
キーワード
アミンオキシダーゼ（銅含有）・ヒスタミンN-メチルトランスフェラーゼ・急性腎障害・代謝・タクリン・メトプリン・体温
序章
人間の全ヒスタミンの 95 パーセント以上は肥満細胞と好塩基球に貯蔵されています。 同じことが多くの哺乳類にも当てはまると思われます。 ヒトでは、マスト細胞密度は消化管、皮膚、肺で最も高く[1]、その結果、これらの臓器はマスト細胞の活性化が明らかに関係する疾患においてヒスタミン誘発性の症状を示します。 急性脱顆粒後のヒスタミンの局所間質濃度は 10 ～ 1000 μM に達する可能性があります [2、3、オンライン リソースを参照]。 ヒトでは、イヌやブタと同様に、正常な血漿ヒスタミン濃度は 1 ng/ml (9 nM) 未満であり、症状は 1 ミリリットルあたり数ナノグラムで発症し始めます [4-7]。 心拍数の上昇を伴う重大な低血圧は 5 ng/ml から測定でき、レベルが 10 ng/ml を超えると、気管支けいれん、不整脈、重度の低血圧、冠動脈けいれんの発症が生命を脅かす多系統機能不全につながる可能性があります [8, 9]。 ヒスタミンは、血管拡張、血管透過性の増加、低酸素症、血管浮腫の発症に関与するだけでなく、免疫エフェクター細胞の動員、成熟、活性化を介して獲得免疫系に影響を与える炎症促進性の関与も示しています。 さらに、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球と相互作用することで自然免疫系でも役割を果たします[10、11]。
マウスとラットのベースラインヒスタミン濃度は、信頼できる方法を使用して測定すると 20 ～ 100 ng/ml であるため、ヒトで見られる濃度よりも何倍も高くなります [6、7]。 これらの高いヒスタミンレベルが何らかの生理学的役割を果たしているかどうかは明らかではありません。 齧歯動物はヒスタミンに対して耐性があり、経口投与後、静脈内投与後、異なるマウス系統で致死量（LD50）がそれぞれ 3000 ～ 4000 mg/kg、400 ～ 500 mg/kg に達することで知られています [12、13]。 20 g のマウスに 400 mg/kg をボーラス投与した後のピーク血漿ヒスタミン濃度は、血漿量を 1 ml と仮定すると約 8 mg/ml となります。 制御されたスズメバチ刺し攻撃によってヒトにアナフィラキシーが誘発された場合、140 ng/ml のヒスタミン濃度は重度の生命を脅かす低血圧と関連していました [14]。 ヒスタミンはどのように代謝され、不活化されるのでしょうか?
ヒスタミンは平均 13% の血漿タンパク質結合を示し、腎臓で自由に濾過されます [15]。 糸球体濾過率 (GFR) は理論的には、健康なボランティアで見られる 3 ～ 4 分の半減期に約 15 ～ 20% 寄与している可能性があります [5、オンライン リソースを参照]。 通常の GFR が 100 ml/分、血漿量が 3000 ml の場合、ヒスタミンの半減期は 20 分になります。 マウスでは、通常の GFR が 10 µl/min/g であれば、ヒスタミンの半減期は 3 分になります [16、オンライン リソースを参照]。 それにもかかわらず、ヒスタミンは腎臓で高い抽出率を示し、GFR に基づく率を超えており、この抽出は有機カチオントランスポーター 2 (OCT2) を介した近位尿細管細胞への取り込みと再吸収、その後の酵素の不活化によるものと考えられています [17、参照下に]。 ヒトでは、注射された放射性ヒスタミンの 1 パーセント未満が最初の 6 時間以内に尿中に検出されました [18]。 人間のヒスタミン排泄率が低いことは、犬や猫にも見られますが、他の研究者によっても確認されています[19]。 マウスおよびラットの組織では、注射された放射能の 50 パーセント以上が腎臓で検出され、静脈内投与 30 分後にはヒスタミンとして 2 パーセント未満が検出されます [20]。 腎臓は、ラットに高用量のヒスタミンを投与した後に最も高い放射能を示す臓器でもあった[21]。 OCT2 トランスポーターはヒトおよびげっ歯類の腎臓で高度に発現しており、血漿コンパートメントからのヒスタミンの抽出と、一次尿濾液中のヒスタミンの近位尿細管細胞への再吸収の両方に関与している可能性があります [22、下記を参照]。
マスト細胞または血漿から内皮細胞から離れた他の区画へ放出された後、細胞外ヒスタミンが間質液から急速に輸送されることは、ヒスタミンを不活化するもう一つの可能性である。 これは、内皮の一酸化窒素合成酵素 (NOS) シグナル伝達とヒスタミン受容体への結合を介して媒介される重度の低血圧と血管漏出の誘発を阻害する可能性がある [23-25]。 しかし、体循環から内皮細胞または実質細胞へのヒスタミンの輸送速度を研究した生体内動物データは入手できない。 いくつかの in vitro 研究では、ヒスタミンは、低親和性、高容量の OCT2 および OCT3 を使用して双方向に輸送されます [22、26、27]。 ヒスタミンはラット OCT2 および OCT3 トランスポーターの優れた基質であり、同等のヒト OCT タンパク質と比較して高い輸送効率を示します [26]。
ヘルバ・シスタンケ
低濃度の放射性ヒスタミンがマウスに使用される場合、ヒスタミン-N-メチルトランスフェラーゼ (HNMT) を介したメチル化が不活化の主な経路であると思われます。 しかし、マウスに高用量のヒスタミンを投与すると、代謝はイミダゾール酢酸（IMAA）とリボシド結合体に移行し、メチル化誘導体は少量しか検出されない[28-30]。 HNMT ノックアウトマウスのベースライン血清ヒスタミン濃度が 5 倍増加したことは、これらのデータを裏付けています [31]。 イミダゾール酢酸は、ジアミンオキシダーゼ (DAO) によるヒスタミンの酸化を介して生成され、イミダゾール アセトアルデヒドが放出され、主に肝臓で IMAA とリボシド誘導体に変換されます。 DAOを介したヒスタミンの酸化は、マウスの経口チャレンジ後のヒスタミン異化においてより大きな役割を果たしているようだが、マウスではDAO発現が消化管でのみ高いことを考慮すると驚くべきことではない[30]。 経口ヒスタミン攻撃がヒトで行われる場合、DAO を介した酸化的脱アミノ化が主要な異化経路であり、主な尿代謝産物として IMAA が含まれます [18]。
ジアミンオキシダーゼは銅含有アミンオキシダーゼであり、ヒスタミンを不活性化できる 2 つの酵素のうちの 1 つです [32]。 選択された組織、主に小腸および腎臓近位尿細管細胞では、DAO は不明確な細胞内顆粒構造に位置し、細胞外でヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合していますが、HNMT は細胞質にのみ存在します [33、34]。 HNMT の発現は体全体に広がっており、中枢神経系、膀胱、心臓、腎臓、肝臓、肺、脂肪組織で高レベルで見られます。
アミノグアニジンを使用した DAO 阻害の後、ヒツジは、アミノグアニジン前処理を行わなかった対照と比較して、経口ヒスタミン攻撃後に広範なヒスタミン毒性の臨床症状を示しました [35]。 ブタでの同様の実験では、アミノグアニジンで前治療し、その後経口ヒスタミンを投与した動物では重篤な罹患率と死亡率が生じた[36]。 DAO阻害を受けたブタでは、血漿ヒスタミン濃度の中央値が20-倍増加しました。 ラットをアミノグアニジンで処理し、続いて経口ヒスタミンチャレンジを行うと、尿中IMAAが増加し、ヒスタミン濃度が約5倍減少した[37]。 これらのデータは、DAO が外因性の経口投与されたヒスタミンの分解において重要な役割を果たしていることを示しました。
マウスでは、アミノグアニジン治療により、静脈内ヒスタミン攻撃後の腸内のヒスタミン濃度が大幅に増加しました[30]。 しかし、アミノグアニジンは特異的な DAO 阻害剤ではありませんが、3 つの NOS 酵素すべてもブロックし、血中ヒスタミンの組織への輸送をブロックすると思われます [38、39]。 ヒスタミン受容体 2 拮抗薬であるブリマミドの投与は、ラットの循環性ショックモデルにおいて死亡率の増加を伴う有害な影響を示しました。 しかし、同時に、ブリマミドが強力な DAO 阻害剤であることが発表されました [40、41]。 犬において、ブリマミドは平均血漿ヒスタミン濃度の17-倍の増加と平均動脈圧の大幅な低下を引き起こした[42]。 この効果は、マスト細胞の活性化の可能性によるものと考えられていました。
同様に、HNMT の役割は HNMT 阻害剤としてメチルヒスタミンを使用して研究されましたが、メチルヒスタミンも DAO の優れた基質です [43]。 アモジアキンとキナクリンは強力な HNMT 阻害剤 [44-46] ですが、約 500 nM の 50 パーセント (IC50) の阻害濃度で DAO も阻害します [47、未発表データ]。 したがって、既知および未知のオフターゲット効果が発生する可能性があり、in vivo 研究の生理学的関連性を著しく歪める可能性があるため、高濃度で使用されることが多い阻害剤を使用して得られたデータは注意して解釈する必要があります。
代謝研究は、ヒスタミンの分解における 2 つの酵素の重要性について何らかの指標を提供する可能性がありますが、ヒスタミンの異化作用は生理学的または病態生理学的な影響から切り離される可能性があります。 コンパートメントのヒスタミン濃度が重要であり、代謝が下流にある可能性があります。
そこで、我々は、DAO ノックアウト (KO) マウスを使用して、外因性ヒスタミンの分解における DAO の役割を研究することにしました。 2 番目の重要な目的は、さまざまな遺伝子変異株におけるヒスタミンの役割をよりよく研究し、ヒスタミン負荷モデルにおける組換えヒト DAO の有効性をテストできるようにするために、ヒスタミン感受性が増加したマウス モデルを開発することでした。
キスタンシュカプセル
材料と方法
動物モデル
実験は、10〜18-週齢のC57BL6/J Aoc1tm1b(EUCOMM)Hmgu (DAO) KOマウスと野生型（WT）同腹子を使用して実施されました。 ヘテロ接合胚は、ドイツ、ミュンヘンの European Mouse Mutant Archive から提供され、偽妊娠 C57BL6/N マウスに移植されました。 ヘテロ接合性 C57BL6/J 子孫マウスは PCR を使用して確認され (オンライン リソースを参照)、さらにウィーン医科大学生物医学研究部門で動物プロトコル GZ 66 に従って DAO KO マウスの繁殖に使用されました。009/{ {14}}WF/V/3b/2016。 すべての動物実験はプロトコル GZ 66.009/0258- V/3b/2019 に従って実施されました。 実験プロトコルはオーストリア教育科学研究省によって承認されました。 動物は、22度で12:12時間の昼夜サイクルで飼育され、水と餌は自由に与えられました。 非侵襲的な温度測定のために、実験の 2 週間前に短時間のイソフルラン麻酔を使用してトランスポンダー (IPTT-300、BioMedic Data Systems Inc.、米国) を皮下に埋め込みました。 トランスポンダーは 1 秒以内に 3 回温度を測定し、リーダーを使用してケージの外側からこれらの測定値の平均値を記録します。 この平均値はその後の計算に使用されます。 これらの皮下トランスポンダーは、動物の過度の操作を回避し、直腸温度プローブの繰り返し挿入による損傷を防ぐために使用されます[48]。 げっ歯類を含むいくつかの動物種では、ヒスタミン投与が体温を下げることが示されており、ヒスタミンの効果に関する最先端の測定値と考えられています[49、50]。 観察期間中、公表されている過敏症スコアに従って、経験豊富な獣医師によって臨床症状が評価されました[51]。 スコアの範囲は、0 (症状なし) から 1 (頭と鼻をこすったりひっかく)、2 (呼吸数の増加および/または活動の低下に伴う活動の低下、口と目の周りの腫れ)、3 (呼吸困難、尾の周りのチアノーゼ)および口、喘鳴）および 4（突いたり震えたりけいれんした後は活動しない）。 スコア 5 は死亡を示します。 時間帯による変動を避けるために、すべての攻撃実験は午前 9 時から 11 時の間に開始されました [52]。
一般的な実験セットアップ
すべての物質は 5 ml/kg の量で適用されました。 ヒスタミンに対する感受性を高めるために、プロプラノロール (P0884、Sigma-Aldrich、オーストリア) を生理食塩水に溶解し、ヒスタミン攻撃の 20 分前に 2 mg/kg の濃度で腹腔内 (ip) 適用しました [53]。 ヒスタミン二塩酸塩 (H7250、Sigma-Aldrich、オーストリア) を再蒸留 (dd) H2O に溶解し、さらに生理食塩水で希釈しました。 記載されているヒスタミン濃度はすべてヒスタミン塩基 (111.15 ダルトン) を指します。
1. ヒスタミンの経口および皮下投与
マウスを合計60分間絶食させた。 40分間の絶食後、プロプラノロールを投与し、20分後に強制経口投与を用いてヒスタミンを30 mg/kgの濃度で経口投与した。 皮下（ｓ．ｃ．）チャレンジモデルでは、プロプラノロールなしで５０ｍｇ／ｋｇの濃度のヒスタミンを投与するか、プロプラノロールありで５ｍｇ／ｋｇの濃度のヒスタミンを投与した。 血漿ヒスタミン濃度を測定するために、10 mg/kg キシラジンおよび 100 mg/kg ケタミンを使用して、ヒスタミン攻撃後のさまざまな時点でマウスのサブセットを麻酔しました。 クエン酸血漿は、心臓穿刺を使用して麻酔をかけたマウスから収集されました。 時点および遺伝子型ごとに 1 ～ 5 匹のマウスを使用しました。
2. ヒスタミン-N-メチルトランスフェラーゼ (HNMT) 阻害の同時発生
メトプリン (M338835、Toronto Research Chemicals、カナダ) を 10% 乳酸 (L1875、Sigma-Aldrich、オーストリア) に溶解し、さらに生理食塩水で希釈し、5 mg/kg ヒスタミンの攻撃 1 時間前に 3 mg/kg で腹腔内投与しました。 タクリン (A79922、Sigma-Aldrich、オーストリア) を ddH2O に溶解し、生理食塩水でさらに希釈し、続いて 10 mg/kg を 1 時間腹腔内投与した後、25 mg/kg ヒスタミン sc および 2 mg/kg プロプラノロールを投与しました。 濃度２ｍｇ／ｋｇのタクリン腹腔内投与を、２ｍｇ／ｋｇのプロプラノロールと組み合わせた３０ｍｇ／ｋｇのヒスタミン経口投与と組み合わせて使用した。
標準化されたシスタンシュ
3. ヒスタミン攻撃前の急性腎障害（AKI）の誘発
Folic acid (F7876, Sigma-Aldrich, Austria) was reconstituted in ddH2O, further diluted in saline, and applied i.p. at a concentration of 100 mg/kg 48 h before challenge with 5 mg/kg s.c. histamine and 2 mg/kg propranolol. The degree of acute kidney injury was estimated using plasma creatinine values. As a cut-off for inclusion, a creatinine value of at least threefold above the mean baseline value was used as described [54]. Baseline plasma creatinine concentrations of 0.11 and 0.17 mg/dl were measured in two mice and therefore an inclusion cut-off of>42 mg/dl が選択されました。 心臓穿刺によって採取されたクエン酸血漿を使用して、Cobas 分析装置 (Cobas C311 分析装置、Roche、スイス) を使用してクレアチニンを測定しました。 急性腎損傷におけるプロプラノロールによる皮下ヒスタミン攻撃中のさまざまな時点での血漿ヒスタミン濃度を測定するために、各時点で2～4匹のマウスに麻酔をかけ、心臓穿刺によってクエン酸血漿を採取した。
4. ヒスタミン投与後のDAO救済
変異ヘパリン結合モチーフを持つ組換えヒト (rh)DAO (Gludovacz et al. [55] に記載) を、2 mg/kg プロプラノロールおよび 60 mg/kg の投与の 40 分前に 4 mg/kg の濃度で静脈内 (iv) 投与しました。 ５ｍｇ／ｋｇの皮下ヒスタミンによるチャレンジの分前。
血漿中のヒスタミンおよびＤＡＯ濃度を測定するために、２ｍｇ／ｋｇのプロプラノロールと組み合わせた５ｍｇ／ｋｇの皮下ヒスタミンによるチャレンジの６０分前に、マウスを４ｍｇ／ｋｇのＤＡＯまたは緩衝液のいずれかで静脈内投与した。 マウスを異なる時点で麻酔した。 クエン酸血漿は、各時点で 2 ～ 3 匹のマウスから心臓穿刺を使用して収集されました。 血液を 3.8 パーセントのクエン酸ナトリウムで採取し、その一部を直ちにジミナゼン酢酸塩 (D7770、Sigma-Aldrich、オーストリア) と混合し、rhDAO によるヒスタミン分解を阻害する最終濃度 10 μM になりました。
遺伝子発現解析
組織サンプルを液体窒素中で急速凍結し、溶解チューブ (Lysing Matrix E、MP Biomedicals、ドイツ) を使用して組織を均質化した後、FavorPrep Tissue Total RNA Kit (FATRK001、Favorgen、台湾) を使用して全 RNA を取得しました。 Precellys 24 (Bertin Instruments、フランス) で。 逆転写は、OneScript Plus cDNA 合成キット (G236、ABM Good、カナダ) を使用して実行されました。 定量的 PCR には、BrightGreen Express 2x Mastermix (MasterMix-EL、ABM Good、カナダ) を使用しました。 DAO、HNMT、およびヒスチジンデカルボキシラーゼ (HDC) のエクソンスパニングプライマーは、Primer3 ソフトウェアを使用して設計されました (オンラインリソース表 1)。 ハウスキーピング遺伝子 RPLP0 を正規化に使用しました [56]。
ウエスタンブロット
ウェスタンブロット分析では、Precellys 24 (Bertin Instruments、フランス) 上の溶解チューブ (Lysing Matrix E チューブ、MP Biomedicals、ドイツ) を使用して、凍結組織サンプルを 20 mM リン酸 K 緩衝液 (pH 7.2) で溶解しました。 。 総タンパク質濃度は、QuantiPro BCA アッセイ キット (QPBCA-1KT、Sigma、オーストリア) を使用して測定しました。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、総タンパク質 40 μg と組換えマウス DAO 40 ng (オーストリア、ウィーンの天然資源生命科学大学 EG より提供、[57] に記載の方法を使用) を 12 パーセント トリスグリシン ゲル ( 4561043、Bio-Rad、米国）。 モノクローナル ABP1 抗体 (sc-515908、サンタクルーズ、米国) を 0.4 μg/ml の濃度で DAO 検出に使用し、モノクローナル GAPDH 抗体 (2118、Cell Signal Technology、米国) をローディングとして使用しました。 1:2000の希釈でコントロール。 モノクローナル抗マウス IgG-HRP 抗体 (A2554、Sigma Aldrich、オーストリア) および抗ウサギ IgG-HRP 抗体 (A0545、Sigma Aldrich、オーストリア) を 1:40,000 の希釈で検出抗体として使用しました。 画像は、ChemiDoc Imaging System (17001401、Bio-Rad、米国) で Clarity Max Western ECL Substrate (1705062、BioRad、米国) を使用して取得しました。
カンクイ
DAO活性測定
さまざまな組織ホモジネートのジアミンオキシダーゼ活性とメトプレンおよびタクリンによる阻害を、記載されているように測定しました[58]。 Precellys 24 の溶解チューブを使用して、凍結組織サンプルを 20 mM K-リン酸緩衝液 (pH 7.2) で溶解しました。QuantiPro BCA アッセイ キットを使用して総タンパク質濃度を測定し、さまざまな組織の総タンパク質抽出物 500 μg をオルトアミノベンズアルデヒド (oABA) および ddH2O または 200 μM カダベリン (CAD) のいずれか。 DAO による脱アミノ化後の CAD の自己環化生成物であるデルタ-1-ピペリジンは、oABA と縮合して蛍光団を形成し、EX440/30 および EM620/40 nm で測定できます。 DAO阻害を測定するために、rhDAOをさまざまな濃度のメトプレンおよびタクリンとともに30分間プレインキュベートし、上記のように測定した。
DAO 活性を測定するために、タンパク質濃度 200 μg/ml の組織ホモジネートを HRP (最終濃度 1.2 μg/ml、P6782、Sigma-Aldrich、オーストリア) およびアミノグアニジン (最終濃度 10 μM、396494、Sigma-Aldrich) と混合しました。 、オーストリア）またはリン酸カリウム緩衝液（pH 7.2）を添加し、37℃で15分間インキュベートした。 Amplex red™ (最終濃度 100 μM、A12222、Thermo Scientific、米国) を添加し、最終濃度 200 μM のプトレシン (51799、Sigma-Aldrich、オーストリア) の添加により反応を開始しました。 リン酸カリウム緩衝液（pH 7.2）を陰性対照として使用した。 サンプルを 37 度でインキュベートし、EX550 および EM590 nm を使用して 10 分ごとに 120 分間測定しました。 DAO 特異的シグナルは、K-リン酸緩衝液を含むサンプルから、強力かつ不可逆的な DAO 阻害剤であるアミノグアニジンを含むサンプルを差し引くことによって計算されました。
Rhoda を静脈内投与されたマウスの血漿 DAO 活性測定には、クアローニ教授 (コーネル大学、ニューヨーク州イサカ) から提供されたハイブリドーマ細胞株クローン抗 DAO 8/119 からのモノクローナル抗体と Amplex red™ を使用したハイブリッド アッセイを使用しました。 高タンパク質結合黒色蛍光プレート (475,515、Thermo Scientific Nunc、デンマーク) を、50 mM 炭酸-重炭酸緩衝液中の 5 μg/ml 抗 DAO 8/119 100 μl でコーティングしました ( C3041、Sigma-Aldrich、オーストリア）を4℃で一晩インキュベートし、続いて120μlの1パーセントBSA（A4503、Sigma-Aldrich、オーストリア）で室温で50分間ブロックした。 100 μl の血漿サンプルと標準をブロッキングした後、あらかじめ PBS で 1:10 に希釈したものを加え、室温で 1 時間インキュベートしました。 その後、0.1パーセントBSAを含むPBS中の90μlのホースラディッシュペルオキシダーゼ（最終濃度1.2μg/ml）およびAmplex red™（最終濃度100μM）を添加し、10μlのプトレシン（最終濃度200μM）またはPBSを添加することによって反応を開始した。 蛍光は、EX550 および EM590 nm を使用して、37 度で 5 分ごとに 120 分間測定しました。 洗浄溶液は、PBS 中の 0.1 パーセント Tween-20 (P1379、Sigma-Aldrich、オーストリア) でした。 3 ～ 30 ng/ml rhDAO の標準曲線をマウス血漿で作成しました。 すべての測定は 2 回繰り返して実行されました。
ヒスタミン測定
10 μM ジミナゼン酢酸塩を含むクエン酸血漿 (D7770、Sigma-Aldrich、オーストリア) を使用して、ヒスタミン均一時間分解蛍光 (HTRF) ダイナミック キット (62HTMDPET、Cisbio、フランス) を使用してヒスタミン濃度を測定しました。 キットは、製造元が提供する説明書に従って使用されました。 C57Bl/6J マウスのプール血漿中のヒスタミン標準曲線を定量化に使用しました。 すべてのヒスタミン濃度はヒスタミン塩基を指し、すべての測定は二重に実行されました。
統計分析
統計分析は、GraphPad Prism バージョン 8.4.0 を使用して実行されました。 (GraphPad Software Inc.、サンディエゴ)。 組織ホモジネート中の DAO 活性の差の統計的有意性は、ガイサー-グリーンハウス補正を備えた反復測定 ANOVA を使用して計算されました。 実験中の個々の中核体温測定値と臨床スコアからの曲線下面積 (AUC) は、ウェルチ補正を行わない両側対応のない t 検定を使用して比較されました。 グループ間の血漿ヒスタミン濃度を二元配置分散分析で比較しました。 急性腎損傷の有無にかかわらず、DAO または緩衝液のいずれかを投与された、異なる遺伝子型のマウス間の皮下攻撃後の血漿ヒスタミン濃度を比較するために、データを間隔ごとにグループ化し、個々のサブグループの欠損値を考慮しました (遺伝子型: 5、1{{ 14}}、20、30、40、45、60 分、急性腎障害: 0、10 ～ 15、20 ～ 30、40 ～ 45 および 60 分、DAO: 0、10、30、および 45分）。 両側対応のない t 検定を使用して、100 mg/kg 葉酸を投与したマウスと投与しないマウスの血漿クレアチニン濃度の違いを検定しました。 統計的有意性は p として定義されました。<0.05 in all tests.
カンカンキエキス
結論
DAO KO マウスは、外因性の経口および皮下ヒスタミン攻撃では WT マウスと本質的に区別できませんでした。 症状の軽減につながるヒスタミンの不活化における HNMT の関与は、よく見ても中程度ですが、薬理学的阻害の結果は予備的であると考えられるかもしれません。 メトプレンによる HNMT の阻害を使用したデータは、ヒスタミンの不活化に内因性 DAO が関与する傾向を示しました。 腎臓は循環からのヒスタミンの迅速な抽出に関与していますが、7倍に上昇した509ジアミンオキシダーゼノックアウトマウスは、経口投与または皮下投与に対して過敏症ではありません…1 3のヒスタミン濃度は、中枢温度を使用して測定された誇張された表現型には変換されませんでした表現型の読み出しとしての損失。 組換えヒトまたはマウス DAO の使用は、急速かつ大量のヒスタミン放出を伴うマスト細胞の脱顆粒、またはヒスチジン脱炭酸酵素の誘導の強化とそれに続く新たに合成されたヒスタミンの放出を伴うさまざまな動物モデルにおけるヒスタミンの関与を支持または否定するのに役立つ可能性があります。数時間にわたるヒスタミン。 DAO 遺伝子と HNMT 遺伝子の両方の不活性コピーを持つ真の二重 KO マウスの繁殖が可能であれば、研究する価値があるかもしれません。 DAO または HNMT のいずれかの単一 KO マウスは、明らかな表現型を示しません。 [未発表データ、31] 同様に、ヒスタミン誘発性の表現型変化における 2 つの主要なヒスタミン輸送体、OCT2 と OCT3 の関与をテストすることで、げっ歯類や動物におけるヒスタミン媒介症状の発症の背後にあるメカニズムをより深く理解できる可能性があります。したがって、人間にも感染する可能性があります。 発見以来 100 年以上にわたり多大な研究努力が行われてきたにもかかわらず、ヒスタミン異化作用を真に理解するにはまだ道半ばです。
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マティアス・カーラー1 · マレーネ・レイガー・レシュ1 · テレサ・ハイダー2 · カリン・ペトロツィ1 · エリザベート・グルドヴァッツ3 · ニコール・ボース3 · ベルント・ジルマ1 · トーマス・ベーム1
1 ウィーン医科大学臨床薬理学部、Waehringer Guertel 18-20、1090 ウィーン、オーストリア
2 ウィーン医科大学脳研究センター神経生理学部門、ウィーン、オーストリア
3 オーストリア、ウィーンの天然資源生命科学大学バイオテクノロジー学部
