ディーゼル排気への曝露によりゼブラフィッシュの脳の神経変性に関与するネットワークの発現が変化する パート 2
Mar 04, 2024
タンパク質サンプルの調製
タンパク質サンプルを調製するために、80 から 100 匹の麻酔をかけた幼虫 (5 pdf) の頭部を慎重に分離し、PBS で洗浄した後、0.07% ベータメルカプトエタノール (ME) を含む 15% 予冷した TCA/アセトンからなる溶解バッファーに移しました。 ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（製造業者が必要）を総量５００μｌで混合する。
近年、タンパク質サンプルが記憶に及ぼす影響に大きな関心が集まっています。 健康に対する食事の重要性、特に人体におけるタンパク質の重要な役割を認識する人がますます増えています。
タンパク質は人体の基本的な建築材料であり、人体の中で重要な役割を果たしています。 このため、タンパク質サンプルは、健康と美を追求する多くの人々にとって重要なチャネルとなっています。 タンパク質サンプルは、筋肉を増強し、体を形作ることに加えて、人の記憶力を向上させることもできます。
一部の科学者はタンパク質と記憶の関係を研究しています。 彼らは、十分なタンパク質を長期にわたって摂取することが、身体的健康、特に記憶力のあらゆる側面に有益であることを発見しました。 食事によるタンパク質摂取が脳の機能と記憶に重要な影響を与えるという証拠が増えています。
タンパク質は人間の脳のニューロンの重要な構成要素であるため、毎日のタンパク質摂取は人々の記憶力と思考能力に重要な影響を与えます。 長期的なタンパク質の摂取は、体のタンパク質の必要を満たすだけでなく、脳の活動と健康の維持にも役立ちます。
さらに、タンパク質は体が血糖バランスを維持し、安定した気分を維持するのにも役立ちます。 これは記憶力と思考力を維持するために非常に重要です。 したがって、タンパク質を適度に摂取することは、人体のさまざまな認知機能や感情状態の改善に役立ちます。
全体として、タンパク質サンプルと記憶の間には強い関係があります。 タンパク質の摂取量を増やすと、脳と体の健康を維持し、思考力と記憶力が向上します。 記憶力を向上させる必要がある人にとって、適切な量のタンパク質を摂取することは非常に必要です。 健康な体と明晰な心を維持するために、タンパク質食品を適切に摂取し、合理的な食事に注意する必要があります。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサには抗酸化作用、抗炎症作用、および老化防止効果があり、脳内の酸化と炎症反応を軽減し、それによって脳を保護する効果があるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。神経系の健康。 さらに、カンクサは神経細胞の成長と修復を促進し、神経ネットワークの接続と機能を強化します。 これらの効果は、記憶、学習、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発症も防ぐ可能性があります。
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簡単な均質化の後、タンパク質を20度で12時間沈殿させ、続いて12000 rpmで4度で5分間遠心分離した。 上清を除去し、タンパク質ペレットを冷アセトン (0.0 7% ME およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む) で 2 回洗浄しました。最終的なタンパク質ペレットを 7.0 M 尿素を含む溶解バッファーに溶解しました。および２．０Ｍチオ尿素を氷上で超音波処理した。
可溶化タンパク質サンプルを15,000 rpm、4度で10分間遠心分離して不溶性粒子を沈殿させ、最終タンパク質サンプルの濃度をブラッドフォード法を使用して測定した。
TMT ベースのハイスループット プロテオミクス解析
トリプシンおよびlys-Cプロテアーゼを順次添加することにより、サンプルを還元、アルキル化、消化しました。 次に、製造元の指示に従って、10-plexTMT 同重体タグを使用してペプチドを標識しました。 標識サンプルを混合し、高 pH 逆相クロマトグラフィーを使用して細かく分別しました。
次に、オンライン逆相クロマトグラフィーと Thermofsher Fusion Lumos 質量分析計でのタンデム質量分析を使用して、個々の画分を LC-MS/MS によって分析しました。データは、以前に説明されているように、同期前駆体選択ベースの MS3 法を使用して取得されました (McAlister et al. 2014)。 データベース検索とTMTレポーターイオン情報の抽出は、MaxQuantソフトウェアプラットフォームを使用して実行されました(Cox and Mann 2008)。
サンプル間の TMT データの比較は、MSStats (Choiet al. 2014) を使用して実行されました。トランスクリプトーム分析麻酔をかけた胚 (120 時間) から約 80 ～ 100 個の頭部を単離し、PBS で洗浄し、Trizol (Sigma Aldrich、セントルイス) を使用して全 RNA 抽出を行いました。 、米国）試薬は製造元の指示に従ってください。
RNA の質と量は、NanoDrop2000 分光光度計 (Thermo Scientific、マサチューセッツ州) を使用して評価され、さらに Agilent 2100 Bioanalyzer によって評価され、最小濃度 50 ng/ul および RNA 完全性数 (RIN) が 8 であることが確認されました。 次に、ライブラリーの調製を、Illumina HiSeq4000 を使用して実行しました。プロトコル:「Ribo-Zero Gold を使用した TruSeqStranded Total RNA ライブラリー調製ワークフロー」、サンプルは次の条件で配列決定されました:「ペアエンドラン、R1=75 サイクル (アンチセンス鎖)、インデックス =8 サイクル、 R2=75 サイクル (センス鎖)。」
データ分析
プロテオーム研究とトランスクリプトミクス研究のための両方のデータセットは同時にアップロードされ、オンライン ツール Metascape を使用して分析されました。これにより、Danio rerio を含むさまざまな種の遺伝子アノテーションが可能になります (Zhou et al. 2019)。特定の経路におけるプロテオームまたはトランスクリプトーム プロファイルの変化の寄与を評価するために、データはIngenuity Pathways Analysis (IPA) ソフトウェアを使用して分析しました (Krämer et al. 2014)。
遺伝子またはタンパク質の識別子と対応する発現値を含むデータセットがアプリケーションにアップロードされました。 各識別子は、Ingenuity のナレッジ ベース内の対応するオブジェクトにマッピングされました。
1.3-倍の発現変化カットオフは、発現が差次的に調節される分子を同定するために設定されました。機能分析により、データセットにとって最も重要な生物学的機能および/または疾患が同定されました。 カットオフを満たし、生物学的機能に関連するデータセットからの分子が分析の対象とされました。 Right-tailedFisher の正確検定を使用して、データセットに割り当てられた各生物学的機能および/または疾患が偶然のみによる確率を決定する p 値を計算しました。
経路解析
特定の経路におけるプロテオームまたはトランスクリプトームのプロファイル変化の寄与を評価するために、両方のデータセットを IPA ソフトウェアにアップロードしました (Krämer et al. 2014)。 次に、以下に説明するように、PCR およびウェスタンブロッティングを使用して、上位の重要な変更された標準経路をさらに評価および解釈しました。
ウェスタンブロッティング
合計 25 μg のタンパク質を 12% NuPAGE (Novex, CA) にロードし、記載されているように PVDF メンブレン (Novex, CA) に転写しました (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019)。 膜を、トリス緩衝生理食塩水および０．０１％トゥイーン２０（ＴＢＳＴ緩衝液）中の５％スキムミルクで３０分間室温でブロックし、次いで、ウサギポリクローナル抗Ｃｙｐ１Ａ１（カリフォルニア州アブカム）またはマウスモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ、ＣＡ）のいずれかと４℃で一晩インキュベートした。カリフォルニア州アブカム）、1％スキムミルクを含むTBST緩衝液で希釈。
TBSTで洗浄した後、ブロットをロバ抗ウサギHRP(カリフォルニア州アブカム)またはヤギ抗マウスHRP(カリフォルニア州サンタクルーズ)の二次抗体とともに2時間インキュベートし、続いてPierce™ ECL Plusウェスタンブロッティング基質(サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国)。 バンドは、LI-CORスキャナーを使用して画像化することによって視覚化し、デンシトメトリー(LI_バイオサイエンス、ネブラスカ州)によって分析した。
リアルタイム PCR
メーカーの指示に従って TRIzol 試薬 (Sigma Aldrich、セントルイス、米国) を使用してヘッドから全 RNA を単離し、NanoDrop 2000 分光光度計 (Thermo Scientific、マサチューセッツ州) を使用して測定しました。 1 μg の各 RNA サンプルを iScript™ 逆転写スーパーミックス (Bio-Rad、カリフォルニア州) を使用して逆転写し、SsoAdvancedUniversal SYBR Green スーパーミックス (Bio-Rad、カリフォルニア州) を使用してリアルタイム PCR を実行しました。プライマーはリストにあります。相対発現レベルは2-ΔΔCT法を使用して計算され、統計的T検定を使用して有意差を評価しました。
結果と考察
プロテオミクス解析とトランスクリプトーム解析は、疾患プロセスと環境刺激への反応の根底にある分子機構を理解するための 2 つの主要なツールです (Duan et al. 2017; García-Estrada et al.2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al.2012) 。 ここでは、DEPe に曝露されたゼブラフィッシュ胚の頭部におけるトランスクリプトーム レベルとプロテオーム レベルの両方で詳細な発現解析を実行しました。
我々はCNSの固有の病理学的経路を決定することに興味があるため、大部分が脳組織で構成される頭部を単離して他の組織の発現プロファイルを除去した。
ゼブラフィッシュ胚の頭部の発現プロファイル
プロファイル分析により、26 以上の 000 コード遺伝子から 11,172 個の検出タンパク質と 14,748 個の mRNA 標的が得られました (Howe et al. 2013)。 TMT標識サンプルから同定された11,172個のタンパク質（補足表2）のうち、141個のタンパク質が有意に上方制御され、607個が下方制御されました（補足表3および図1a）。 同様に、RNA-seq分析で検出された14,748個の転写物（補足表4）のうち、367個の転写物が上方制御され、149個が下方制御されました（図1bおよび補足表5）。
ほとんどの場合、上方制御されたプロテオミクス分析とトランスクリプトーム分析の結果は一貫していました。 たとえば、高度に上方制御されるタンパク質には、シトクロム P450 Cyp1a、Cyp1c1、グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニット ガンマ、アネキシン、プレキシン B2b ショート アイソフォーム、デヒドロゲナーゼ/レダクターゼ (SDR ファミリー) メンバー 13- のような 1、網膜/松果体の S 抗原が含まれます。 (アレスチン) b、および硫酸転移酵素6B1。
同様に、トランスクリプトーム上方制御が最も高い遺伝子には、シトクロム P450 (Cyp1a)、ケモカイン (C-C モチーフ) リガンド 27a、アリールハイドロカーボン受容体リプレッサー A、シトクロム P450 (Cyp1b)、および Rh ファミリー C 糖タンパク質が含まれます。一方、下方制御されたタンパク質と転写物は、必ずしも相関性が高いわけではありませんでした。
たとえば、コンプレキシン 2、スペクトリン アルファ、心臓ミオシン軽鎖 -1、SEC23 相互作用タンパク質、ATP シンターゼ膜サブユニット EA、シトクロム b、および NAD 依存性タンパク質脱アセチラーゼは、高度にダウンレギュレートされるタンパク質の上位にありますが、レチナ外側セグメント膜タンパク質 1a 、溶質キャリアファミリー 5 (ヨウ化物輸送体)、FBJ マウス骨肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ B、コンプレクシン 4c、FOS 様抗原 1a、オプシン 1、および v-fos は、最も高い転写の下方制御を示します (表 1 および 2)。
ゼブラフィッシュタンパク質を認識する抗体は限られていますが、ウェスタンブロット分析を使用してこれらの変化のサンプルを確認しました。 Cyp1Aタンパク質の上方制御とComplexin 2（CPLX2）の下方制御は、ローディングコントロールとしてGAPDHを使用して確認されました（図2a）。 内部対照としてElf-αを使用したqPCRによっても、より高いレベルのTATおよびUGT1B1転写、およびより低いレベルのCHNRBおよびTH2が確認された（図2b）。
遺伝子アノテーション
遺伝子のアノテーションに関する有用な情報を提供できるオンラインのバイオインフォマティクス ツールとソフトウェアがいくつかあります。 その中で、Danio rerio の遺伝子アノテーション機能を備えた Metascape (Zhouet al. 2019) がこの研究に使用されました。
プロテオミクス研究とトランスクリプトーム研究の両方のデータセットは、このオンライン ツールを使用して同時にアップロードされ、分析されました。ソフトウェアでプロテオミクスとトランスクリプトームの両方の変化の出力を組み合わせた後、生体異物刺激への応答、シトクロム P450 による生体異物の代謝、遺伝子発現の概日制御などのいくつかのプロセスが解析されました。 DEPe処理により誘導されることが判明した（図3a）。
この分析は、「視覚」、「光伝達」、「Gタンパク質共役受容体内部移行」などの生物学的プロセスのレベルが抑制されていることも示唆した。 発達初期におけるDEPe治療により目が小さくなったため、視覚関連の発現プロファイルの変化は予想外ではなかった(データは示さず)。
生体異物代謝シグナル伝達
外来の天然または合成化学化合物である生体異物は、細胞のストレス反応を引き起こし、分化、増殖、アポトーシス、または壊死を引き起こす可能性があります。 実際、身体は、生体異物、さらには有毒な内因性化合物とその代謝産物から、それらの除去と解毒に関与する酵素とトランスポーターの発現を介して積極的に身を守る必要があります。
これらの酵素は 3 つのグループに分類されます。フェーズ I 酵素 (CYP、ALDH、FMO) は生体異物に極性を導入します。 硫酸塩、グルクロン酸、グルタチオンなどの親水性分子の生体異物への結合を介して親水性を導入するフェーズ II 酵素 (UGT、GST、SULT)、およびフェーズ II 中に形成された生体異物または結合体を輸送するフェーズ III 酵素 (MDR1、OATP2、MRP)細胞外領域へ。
これらの酵素は、特定の受容体 (CAR、PXR、AHR) および MAPK を介した転写因子の活性化 (NRF2、MAF) が関与するシグナル伝達カスケードを通じて誘導されます (Omiecinski et al. 2011)。
活性化因子が存在しない場合、構成的活性受容体 (CAR) は、CCRP および HSP90 と複合体を形成して細胞質に存在します。 しかし、活性化因子が存在する場合、CARは核に移行し、RXRに結合してヘテロ二量体を形成し、さらにDR3、DR4、ER6、ER8などのリピートモチーフのいくつかの変異体に結合し、遺伝子発現制御に寄与します（補足表2）。
私たちのプロテオミクス分析により、生体異物代謝の活性化が明らかになりました。実際、CYP1A1、CYP3A7、HMOX1 (ヘムオキシゲナーゼ 1)、CAT (カタラーゼ)、CES1 (カルボキシルエステラーゼ 1) の明らかな上方制御はフェーズ I 代謝の誘導を示し、一方、UGT1A1 (UDP グルクロン酸転移酵素ファミリー 1 メンバー A1) および GSTP1 (グルタチオン S 転移酵素 pi 1) の発現増加はフェーズ II 代謝の活性化を示しています。
興味深いことに、SULT1A1 (硫酸転移酵素ファミリー 1A メンバー 1)、SULT1C2 (硫酸転移酵素ファミリー 1C メンバー 2)、および SULT2B1 (硫酸転移酵素ファミリー 2B メンバー 1) などの硫酸転移酵素の下方制御は、第 II 相代謝における親水性の増加が、グルクロン酸およびグルタチオンとの結合を介して起こる傾向があることを示唆しています。 、しかし硫酸塩共役はそうではありません（図4）。
CYP1A、CYP1B、CYP3A7、GSTO1、GSTP1、UGT1A1 はすべて RNA レベルで上方制御されているため、トランスクリプトーム研究の結果は非常に一貫しています。 しかし、SULT2B1 は RNA レベルで上方制御を示します (タンパク質レベルでは過小評価されています)。
これは、DEPe による処理後の硫酸転移酵素の分解または不活化を誘導する他の機構の関与によるものである可能性があります。 特に驚くべきことは、これらの生体異物代謝の変化が魚の頭（おそらく脳）で起こったことである。 哺乳類の神経系における生体異物遺伝子の発現は報告されているが、ゼブラフィッシュの脳における生体異物遺伝子の発現はこれが初めての報告である(McMillan and Tyndale 2018)。
これらの発見は、環境中の多環芳香族炭化水素（PAH）のさまざまなグループが胚の発育に及ぼす影響を試験し、トランスクリプトームプロファイルに対する各治療計画の影響をさらに評価した、Shankarらによって行われた同様の研究と一致している。
彼らは、受精後48時間（hpf）の胚の全身において、転写レベルとタンパク質レベルの両方でCyp1aの上方制御が、生体異物AHR活性化と下流トランスクリプトーム変化の初期の信頼できるバイオマーカーであることを示した（Shankar et al. 2019）。
NRF2-媒介酸化ストレス反応
酸化ストレスはアポトーシスや壊死を引き起こす可能性があり、神経変性に関与すると考えられています(Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015)。酸化ストレスに対する主要な細胞防御反応は、抗酸化酵素と解毒酵素の誘導です。
核因子赤血球関連因子 2(Nrf2) は、プロモーター抗酸化応答エレメント (ARE) に結合し、その転写を活性化します。 不活性な Nrf2 はアクチン結合タンパク質 Keap1 と結合し、細胞質に保持されます。
酸化ストレスによって引き起こされ、Nrf2 はプロテインキナーゼ C、ホスファチジルイノシトール 3- キナーゼ、および MAP キナーゼ経路に応答してリン酸化されます。 その後、リン酸化された Nrf2 は核に移行し、AREs に結合して解毒酵素および抗酸化酵素をトランス活性化します (補足表 3) (Ma 2013)。
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