パートⅠ：SARS-CoV -2感染は、心臓や腎臓などの組織に影響を及ぼします
Mar 18, 2022
詳細情報：ali.ma@wecistanche.com
パートⅠ：SARS-CoV -2シリアンハムスターモデルの感染は、心臓や腎臓を含む呼吸器組織と非呼吸器組織の両方で炎症とI型インターフェロン調節不全を引き起こします
Magen Ellen Francis、Una Goncin＆etal。
序章
SARS-CoV -2（重度の急性呼吸器COVID -19（コロナウイルス2019）を引き起こすコロナウイルス2）は、2019年後半に出現し、その後、公衆衛生と経済に多大な影響を及ぼしました[1,2]。SARS-CoV -2はコロナウイルス科のベータコロナウイルス属の一本鎖RNAウイルスであり[3]、その出現以来、2021年6月1日現在、世界中で1億7000万件以上の確定症例と350万人の死亡をもたらしています[4]。 人間のコロナウイルス感染は、以前は軽度の冷たいような症状しか引き起こさないと考えられていましたが、最近ではコロナウイルスが出現し、SARS-CoV（重度の急性呼吸器コロナウイルス）およびMERS-CoV（中東）呼吸器症候群コロナウイルス）、さまざまな呼吸器軽度から重度までの非呼吸器症状[5,6]は、臓器不全や死亡につながります[Z. 無症候性の症例も報告されています[8]。 公衆衛生への負担と病気の重症度の範囲を考えると、研究するために動物モデルを開発するSARS-CoV -2病因と対策の特定は非常に重要です。 ウイルス感染に対する宿主の反応のinvivo評価は、重篤な疾患を調節する宿主因子と、患者の支持療法に情報を提供するのに役立つ可能性のあるバイオマーカーを特定するために不可欠です。
に対するホストの応答の評価SARS-CoV -2病気の進行と、重度の病気につながる可能性のある免疫メカニズムについての貴重な洞察をもたらしました。 現在、ヒトにおけるCOVID -19の重症例は、インターロイキン-6（IL -6）、インターロイキン-1などの炎症性遺伝子の発現増加を伴うことが多いことが広く示されています。ベータ（IL -1ベータ）、および腫瘍壊死因子（TNF）[9-11]。 先立ってSARS-CoV -2、コロナウイルスはI型インターフェロン応答を調節できることが知られていました[12,13]。 いくつかの研究では、I型インターフェロン応答がSARS-CoV -2これを示唆する感染症は、COVID-19の結果の悪化にも寄与する可能性があります[14,15]。 これらの臨床データは、さらなる実験的調査のための病因の潜在的なマーカーを示唆している。
シリアのハムスターは、パンデミックの初期に生産的に感染していることが確認された数少ない動物種の1つでした。SARS-CoV -2前臨床開発およびinvivo分析に使用できる可能性があります[16]。 ハムスターはもともとSARS-CoVの影響を受けやすいと判断され[17]、それ以来、ハムスターのモデルであることが示されています。SARS-CoV -2[18]。 ハムスターはサポートすることができますSARS-CoV -2下部内の複製呼吸器ハムスターでは感染の時間経過が短いようですが、人間と同様に感染と病気のダイナミクスにいくつかの類似点があるtract[18-20][21]。 フェレットは、ウイルスが上部でのみ検出されているため、肺内の感染をサポートすることは示されていません呼吸器このモデルが伝達研究に役立つかもしれないことを示唆する道[22]。 さらに、マウスは元の武漢に感受性があることが示されていませんSARS-CoV -2ウイルス。 ハムスターは効果的な抗体反応を示すことも示されており、COVID-19ワクチンと治療研究の両方に利用されています[19,20,23]。 他の非伝統的な動物モデルと同様に、免疫応答と病因のメカニズムを特徴づけるためのハムスター特有の生物学的試薬が不足しています[24]。
ここでは、免疫応答と病因を調査しましたSARS-CoV -2ハムスターの感染症は、病気のメカニズムと肺などの特定の臓器の関与を決定するために、心臓、 と肝臓COVID-19は多系統性疾患であるため。SARS-CoV -2接種されたシリアのハムスターは、qRT-PCR、トランスクリプトーム分析、ウイルス滴定アッセイ、および免疫組織化学（IHC）によるウイルス学的および免疫学的分析のために、15-日の時間経過にわたってサンプリングされました。 The呼吸器管は、I型インターフェロン応答の特異的な鈍化を伴う上部および下部領域の両方でウイルスを複製するという高い負担を持っていました。 外で感染性ウイルスの証拠はほとんど見つかりませんでしたが呼吸器管、ウイルスRNAはを含むいくつかの臓器に存在していた腎臓, 心臓、リンパ節、およびIL -6、TNF、IL-1ベータなどの炎症性メディエーターの同時発現を伴う肝臓。 肺および肺外臓器は、組織の損傷につながる炎症性細胞浸潤の兆候を示しました。 まとめると、COVID -19のコンテキストで免疫病原性のハムスターモデルを定義しました。これは、医療対策の評価のために、防御と疾患の相関関係を特定するために使用できます。
結果
SARS-CoV -2-接種されたハムスターは、ウイルス量、感染性ウイルスと相関する体重減少があります呼吸器管、および非呼吸組織のウイルスRNA
シリアのハムスターは感染しやすいSARS-CoV -2それらが免疫病理学および疾患のメカニズムの調査に価値があるかもしれないことを示唆している[20]。 ハムスターは6-8週齢で鼻腔内に接種されましたSARS-CoV -2 at 10° TCIDs0. The animals were monitored for temperature and weight throughout the course of the infection. As typical during viral infection in small animals, hamsters began showing a decrease in temperature by day 1 post-inoculation(pi)(S1A Fig)which returned to baseline between day 3 and 7 (S1B Fig). Inoculated hamsters began losing weight on day 2 pi, with weights being significantly different from baseline on days 3 to 7. Weight loss was most severe on day 6 pi where the average body weight of the inoculated animals was 88.26% of the original weight (Fig 1A). After day 6, there was a steady increase in weight over the remaining time course on average recovering to baseline by day 12. Individual animals showed two different trajectories of weight loss: mild (~4%weight loss) and severe(>15パーセントの体重減少）（図1B）。 元の体重の20％以上を失い、研究中の方法で定義された人道的エンドポイントの他の基準に達した動物はいませんでした。 サンプル収集のために所定の終了日に動物を研究から除外したため、すべての動物の個々の体重は示されていない。
COVID -19は、人間のいくつかの臓器系に影響を及ぼします。心臓, 腎臓、肝臓、脾臓、および大腸[25,26]。 したがって、感染したハムスターの体全体のウイルスの向性と関連する免疫病理学を決定して、病気への洞察を得ることに興味がありました。 剖検および免疫病理学の分析のための組織特異的応答を評価するために、動物を0、2、5、8、12および15pi日に研究から除外した。 血液、鼻洗浄、および組織（呼吸器および非呼吸器）が収集されました。 ウイルス指向性は、qRT-PCRによって評価されました。SARS-CoV -2組織培養感染量50（TCIDs0）アッセイによるエンベロープ遺伝子（E）およびウイルス滴定（図2）。 E遺伝子発現分析はグラフ上の茶色の円で表されます。 の分析呼吸器管は、鼻甲介、気管、および2、5、および8 pi日目にテストされた4つの肺葉すべて（右頭蓋、右中、右尾、および付属品）に存在するvRNAを明らかにしました。 ウイルスRNAは、12日目のpiで、1匹の動物の右中肺葉と副肺葉でまだ検出されました。 灰色の円で表される生ウイルス力価分析は、感染性ウイルスが2日目（7.5 TCID 0 / mL（Logl 0））および5日目（6 TCID {{ 11}} / mL（Logl 0））pi。 感染性ウイルスは2日目に肺でピークに達し、右中肺で約9 TCIDs / mL（Log10）であり、5日目まで存在していました。気管はすべてのウイルスレベルの中で最も低いウイルスレベルでした。呼吸器2日目にのみ存在した組織（〜3 TCIDso / mL（Logl 0））。vRNAは、心臓, 肝臓、大腸、および低から中程度のレベルの縦隔リンパ節。 縦隔リンパ節は最高レベルのvRNA、〜5 TCID（Log10）を持ち、感染性ウイルスに陽性である唯一の非呼吸組織でした。
図1.ハムスターの鼻腔内SARS-CoV-2感染は、大幅な体重減少につながります。シリアのハムスターに重度の急性の鼻腔内接種を行った呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV -2）105TCID50で。 接種後15日間の体重（AおよびB）を記録した。 平均結果（A）は平均を示しています。 個々の結果は各動物を表しています（B）。 p値を示します<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" standard="" error="">
ウイルスの解決が中和抗体の誘発によるものかどうかを判断するために、次に、感染したハムスターの中和抗体価を経時的に定量化しました（Eig3A）。 血漿は、剖検で収集された血液から分離され、1反応あたり100TCIDで中和アッセイに使用されました。SARS-CoV -2。 中和抗体は、約63（幾何平均）のエンドポイント力価で、早くも8日目に検出されました。 これは、12日目に幾何平均160に増加し、15日目に幾何平均587でピークに達しました。これらの観察結果は、ハムスターがその後、高力価の中和抗体を誘発できることを示唆しました。SARS-CoV -2感染。 鼻洗浄液は、上部からのウイルス排出を決定するために研究全体を通して収集されました呼吸器tract.vRNAは、生ウイルス接種後12日までの鼻洗浄液で検出され、2日目と5日目に観察され、2日目に6 TCID5o / mLをわずかに超えるピークに達しました（Log10）。 5日目のすべての動物の鼻洗浄液で検出された生ウイルス力価を、その日のそれぞれの体重減少と比較しました（図3B）。 正規分布データのピアソン相関をこの分析に使用して、感染動物の体重と、接種後5日目と一部の動物が除去し始める日である5日目の鼻洗浄液のウイルス力価との間に線形関係が存在するかどうかを判断しました。ウイルス。 鼻洗浄液中のウイルス力価が増加するにつれて、動物はより重度の体重減少の可能性が高くなるように、-0 .68のピアソン相関が見つかりました（p値=0。00242）。 さらに、pi5日目の肺ウイルス力価と体重減少の関係を評価しました。 毎日3匹の動物しか収集されなかったため、相関を評価するためのデータセットはサンプルサイズによって制限されます。 このデータセットの数は望ましい測定数を満たしていませんが、ピアソン相関を実行し、有意ではないものの、接種後5日目の肺ウイルス力価と体重減少の間に負の相関があることを発見しました。 動物の体重と比較して評価されたそれぞれの肺葉からのウイルス力価に基づいて、右頭蓋肺のR値は-0。91（p値=0。27）、右中肺でした。 R値は-0。92（p値=0。25）であり、右尾側肺のR値は-0。58（p値{{39 }}。61）（S2図）。 との関係に自信をつけるために、より多くの動物について追加の評価を行う必要がありますSARS-CoV -2肺のウイルス力価と動物全体の体重減少。
図2.生きているSARS-CoV-2ウイルスは呼吸器組織と縦隔リンパ節に限定され、ウイルスRNAは肺外臓器に存在します。動物は、感染前の0日、および接種後2、5 8、12、および15日目に研究から除外されました。呼吸器収集された組織には、鼻甲介、気管、および肺（右頭蓋葉、右中葉、右尾葉、副葉）が含まれていました。 分析された肺外臓器には、縦隔リンパ節が含まれていました。心臓, 肝臓、肝臓の脾臓、および大腸。 すべての組織を採取して、ウイルスを定量化するために、SARS-CoV -2のストックから抽出されたRNAを使用したウイルスRNAの標準曲線に基づくTCID50/mL相当のE遺伝子SARS-CoV -2既知の濃度（TCID50 / mL）（ブラウン）。 感染性ウイルスは、組織培養感染量アッセイによって定量化され、TCID50 / mL（灰色）で表されました。 TCID50 / mLは、リードミュンヒ法を使用して計算されました。 点線は、サンプルの最低希釈率に基づく、生ウイルス量アッセイでの検出限界を表しています。 E遺伝子のqPCR検出の検出限界は101TCID50/mLでした。 データポイントは個々の動物を表し、線は平均を表します。
肺炎と肺の病理は、多くの場合、呼吸器ウイルス感染、重大な罹患率と死亡率をもたらします。 の肺への損傷の程度を決定するにはSARS-CoV -2感染したハムスター、およびハムスターが重症を再現する能力呼吸器ヒトCOVID-19患者への関与について、感染過程全体を通してハムスターの左肺内の疾患の病因を調べました（図4）。 H＆E染色の顕微鏡分析は、感染の過程で肺の損傷の増加を示し、最も重篤な病状はpi 8日目に認められ、15日目までに部分的に解消しました（Eig4A）。 感染していないハムスターは、炎症性細胞の浸潤や出血の形跡がなく、明確な肺胞腔を持っていました。 pi 2日目までに、単核細胞浸潤が肺胞および気管支周囲の空間に存在しました（黄色の矢印）。 細胞浸潤は5日目も継続し、浸潤が増加した。 ８日目に、気管支周囲の空間は、炎症性単核細胞の存在によって特徴づけられた。 細気管支の上皮細胞の脱落が認められ（黒い矢印）、組織全体に出血が観察された（赤い矢印）。 過形成は明らかでしたが、出血は12日目までに解消しました（緑色の矢印）。 15日目までに、炎症性細胞浸潤の減少を伴う硝子膜形成（青い矢印）が観察された。
図3.SARS-CoV-2のウイルス排出は、臨床転帰の重症度とともに増加しますが、中和抗体が動物血漿で検出可能であるため減少します。鼻洗浄液を収集して、qPCR検出によりウイルスを定量化しました。SARS-CoV -2E遺伝子（ブラウン）およびTCID50/ml相当で発現。 感染性ウイルスを定量化するために、生ウイルス量アッセイ（灰色）を実施しました。 鼻洗浄液の感染力価は、組織培養感染量滴定アッセイによって決定され、得られたTCID50 / mLは、リードミュンヒ法を使用して計算されました。 LOD=生ウイルス量アッセイの検出限界。 ウイルス中和力価は、経時的に収集された血漿を使用した標準的な中和アッセイによって決定されました（黒）（A）。 鼻洗浄液中の生ウイルス力価は、感染後5日目の体重減少と負の相関がありました。 R値= -0。68（p値= 0。00242）（B）。
肺におけるウイルス量の結果を検証し、ウイルスの位置を視覚化するために、左肺葉のIHC染色を実行して検出しましたSARS-CoV -2スパイクタンパク質。 感染していないハムスターではウイルスタンパク質は検出されず、使用した抗体の特異性が示唆されました。 pi 2日目に、左肺に有意な染色（黒い矢印）があり、SARS-CoV -2スパイク抗原（Eig 4B）。 染色は細気管支の上皮細胞で最も顕著であり、肺胞壁の上皮細胞全体にびまん性の染色が見られた。 ５日目に、気道および肺胞細胞を通して光染色（青い矢印）が存在した。 感染していない細気管支の画像と同様の画像が現れたpi8日目には染色は検出されなかった。
図4.接種されたハムスターは、SARS-CoV-2スパイク抗原染色と一致して肺に重大な炎症を起こします。剖検時に各動物から左肺を採取し、パラフィンブロック包埋およびH＆E染色の前に10％ホルマリンで灌流した。 赤い矢印は出血を示します。 緑の矢印は過形成を示します。 黄色の矢印は単核細胞の浸潤を示します。 黒い矢印は細胞の脱落を表します。 青い矢印は硝子膜形成を表しています（A）。 肺はの存在のために染色されましたSARS-CoV -2抗スパイクウサギモノクローナル抗体を使用したIHCによるスパイクタンパク質。 黒い矢印は大量のウイルス抗原染色を示し、青い矢印は少量のウイルス抗原染色の存在を示します（B）。 剖検時に肺全体の重量を測定し、肺の肉眼的病理を動物の総体重のパーセンテージとして表した（C）。 時点ごとに少なくとも3匹の動物を分析した。 p値が少ないことを示します<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" se.="" slides="" were="" visualized="" and="" imaged="" using="" the="" leica="" dmi100="" brightfield="" microscope="" and="" dmc5400="" 20="" mp="" color="" cmos="" camera.="" images="" were="" captured="" and="" 10x="" and="" 40x.="" the="" images="" shown="" are="" representative="" of="" 3="" animals="" per="" group,="" per="" time="">
炎症および炎症性細胞浸潤ならびに肺の浮腫を定量化するために、剖検時の肺の重量を分析した。 壊死時に肺全体の重量を測定し、動物の体重に対する比率を計算して、パーセンテージで表した（図4C）。0日と2 piで、肺はハムスターの体重の1％未満でした。 。 これは、平均して体重の4％弱で、5日目に有意なピークに増加しました。 肺重量は1％に減少し、残りの時間経過を通じてベースラインから統計的に有意なままでした。
宿主遺伝子の発現と免疫病理学のプロファイリングは、I型インターフェロンのシグナル伝達が鈍化した顕著な炎症反応を示しています呼吸器トラクト
人間のデータは血中の全身性サイトカインレベルを調査したので、感染部位や他の影響を受けた臓器での免疫応答を決定することに興味がありました。 I型インターフェロン応答関連（IFN（インターフェロン）-ベータ、STAT（シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子）2、IRF（インターフェロン調節因子）1、IRF3、およびTLR（トール様受容体）3）のレベルを調査しました。 、タイプIIインターフェロン応答関連（IFN-γ、IRF2、STAT1、CXCL10）、および先天性/適応性マーカーおよびメディエーター（CD3、CD4、CD8A、CD19、IL -2、TGF（形質転換成長因子）-ベータ、IL -21、IL -10、IL -4、IL -5、IL -5 R、IL -13、IL -12 、CD14、PKR、CCR3、CCL20、CCL22、IL -1ベータ、IL -6、TNF）。
人間の臨床報告は次のことを示していますSARS-CoV -2感染はインターフェロン反応の調節不全につながります[14]。 I型応答についてはIFN-β、STAT2、IRF1、IRF3、TLR3の発現を評価し、II型応答についてはIFN-γ、IRF2、STAT1、CXCL10の発現を評価することにより、I型およびI型IFN応答を調査しました（図5）。 。 IFN-ベータは、鼻甲介と右頭蓋肺の両方で有意にダウンレギュレートされ、2日目に最大の阻害を示しました。遺伝子発現の増加を示さなかったIRF3およびTLR3と同様に。 また、II型IFN応答、および対応するタンパク質が両方のIFN経路で作用する遺伝子についても調べました。 II型IFNであるIFN-γは、鼻甲介で、そして最も顕著に肺でアップレギュレーションを示しました（図5）。両方の組織で、ピークへの増加があり、その後15日目までに回復しました。 IFN-γの鼻甲介レベルは8日目に12倍の変化でピークに達し、肺のレベルは5日目に17倍の変化でピークに達しました。呼吸器組織、I型IFNアンタゴニストIRF2は有意な増加を示し、鼻甲介では8日目に、右頭蓋肺では2日目に、それぞれ24倍と25倍の変化でピークに達しました。 一般的なIFN応答分子も有意な増加を示しました。STAT1は2日目と5日目に両方の組織で強いアップレギュレーションを示しましたが、CXCL10は2日目に鼻甲介で70に近い倍率変化でピークに達しました。肺では、CXCL10は8日目は30倍の変化でしたが、ベースラインに戻ることはなく、12日目と15日目はナイーブ動物と比較して有意に増加したままでした。 このデータから、II型IFN応答は無傷のままであるが、ハムスターに接種されたように見えるSARS-CoV -2調節不全のIIFN型応答を示す呼吸器組織。
図5.SARS-Cov-2に感染したハムスターの呼吸器組織における遺伝子発現分析は、炎症性および免疫メディエーターの増加を伴う有意なインターフェロン調節不全を明らかにしています。qRT-PCRは、鼻甲介および右頭蓋肺組織から抽出されたRNAに対して実行されました。SARS-CoV -2接種されたハムスター。 サンプルは、I型インターフェロン応答関連（IFN-ベータ、STAT2、IRF1、IRF3、TLR3）、II型インターフェロン応答関連（IFN-γ、IRF2、STAT1、CXCL1 0）、および生得的/について評価されました。適応型メディエーター（CD3、CD4、CD8、CD19、IL -2、TGF-β、IL -21、IL - 10、IL -4、IL -5、 IL -5 R、IL -13、IL -12、CD14、CCR3、PKR、CCL20、CCL22、IL -1ベータ、IL -6、TNF）を使用ハムスター遺伝子に特異的なプライマー（表1）。 倍率変化は、ハウスキーピング遺伝子としてBACTを使用して、ベースライン（0日目）に対するΔΔCtを介して計算されました。 各時点で少なくとも3匹の動物を分析した。
さらに、先天性および適応性の遺伝子調節も評価しました。 全体として、これらの遺伝子は鼻甲介と右頭蓋肺の両方でアップレギュレーションされており、鼻甲介は通常、より高い発現を示しています（図5）。 鼻のタービネートは、IL -2、TGF-ベータ、IL -21、IL -4、IL -5 R、IL -13、およびCCR3のピーク遺伝子発現を示しました。 piの5日目に、97の倍率変化でTGF-betalから最も高い発現が得られ、45.IL-10のIL-13発現は38の倍率変化で2日目にピークに達しました。 5日目と10日目に有意にアップレギュレーションされたままでした。IL-5の発現は12日目に21倍の変化でピークに達しました。肺内では、遺伝子あたりの最高の発現は変化しました：TGF-ベタール、IL { {25}}、およびIL-13は5日目に最も高いアップレギュレーションを示しました。 8日目のIL-10、IL -4、およびIL-5。 12日目のIL-2。IL-4とIL-13は、それぞれのピーク日の25日と18日で、最大のアップレギュレーションを示しました。 T細胞特異的マーカーは鼻甲介で最も高く、12日目にピーク遺伝子発現を示し、15日目に高いままでした。これは、Th2サイトカイン（IL-4のアップレギュレーションによってさらにサポートされた関与するT細胞応答を示唆しています。 、IL -5、およびIL -13）、サイトカイン（以前にIL -12およびIFN-γを示した）、ならびにT調節およびTh17サイトカイン（IL-10およびTGF-betal）、全体的なT細胞応答を指しますSARS-CoV -2感染。 したがって、IHCを実行して、CD3plusおよびCD20plus細胞の存在を確認しました。呼吸器管（S3図）CD3プラス染色は、肺胞腔内の染色なしで、感染していない肺組織の血管（赤い矢印）に集中していました。 CD3プラス細胞（S3A図、黒い矢印）の存在は、時間経過を通して肺胞腔で増加し、接種後8日目に最大染色に達し、今日15日で強度が減少しました。CD20染色は非感染組織では検出されませんでした。 接種後2、5、および8日目に少数のCD20 plus細胞が検出され（S3B図、黒い矢印で示されています）、灰色の矢印で示されているように12日目と15日目に減少しました。
鼻甲介内の炎症マーカーの分析は、12日目と15日目までに解決するすべての炎症性標的の有意な一過性の増加を示しました。IL-1ベータは、4の倍数変化でpi2日目に最大レベルに達しました{{7 }}今日の親戚は感染していない動物です（図5）。IL-6、IL -12、およびTNFは5日目の頂点に達しました（それぞれ66、20、および26の倍数変化）。 対応する重要性はS1表にあります。 対照的に、これらのトランスクリプトは2日目から5日目までの間に頂点に達しましたが、肺と比較して倍率変化は低くなっています。 鼻甲介と肺の両方で、いくつかの炎症性サイトカインは、pi12日目までベースラインと比較して上昇したままでした。 まとめると、感染部位は炎症マーカー、特に鼻甲介のIL-6と肺のTNFの明らかな増加を示しました。
