Cistancheエキナコシドは内皮細胞を介してアンドロゲンをどのように増加させますか？
Mar 09, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
概要。
エキナコシド（ECH）は、内皮依存性の血管拡張作用を持つ天然化合物です。 一酸化窒素（NO）は、内皮細胞から放出される重要な血管弛緩薬です。 内皮細胞におけるECH誘発性NO産生の分子メカニズムを調べるために、本研究では、アンドロゲン受容体（AR）とホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）/プロテインキナーゼB（Akt）経路の関与を調査しました。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）における内皮型一酸化窒素シンターゼ（eNOS）のリン酸化。 蛍光プローブDAF‑FMを使用すると、NOの生成が大幅に増加することがわかり、eNOSはHUVECでの0。01-10 µMECH処理下で濃度依存的にSer1177でリン酸化されました。 さらに、ECHによって誘導されるNO産生およびeNOSリン酸化は、ARアンタゴニストであるニルタミドで前処理した場合、またはAR低分子干渉RNAでトランスフェクトした場合に減少しました。 さらに、Ser473でのAktのECH誘導リン酸化は、5 µMワートマニン（PI3K阻害剤）によって抑制されました。 これらのデータは、ECHがHUVECにおけるeNOSのAR依存性活性化を介してNO産生を刺激し、PI3K/Akt経路がECHによって誘導されるeNOSリン酸化に関与している可能性があることを示しています。
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序章
Cistanche Hoffman。 Et Linkは、ハマウツボ科の属の多年生の寄生虫ハーブです。 ハーブCistanche、の語幹ニクジュヨウYCMAおよびカンカニクジュヨウ（シェンク）。 Cistancheは治療に使用されていた強壮ハーブです腎臓の欠乏、インポテンス、病的白帯下、および老人性便秘（1）、これはアンドロゲン様または性ホルモン調節効果（2）が原因である可能性があります。 エキナコシド（ECH; C35H46O20;分子量、786.73;図1）は、ハーブの茎から分離されたフェニルエタノイド配糖体（PhG）の1つです。Cistanche抗酸化作用、老化防止作用、抗炎症作用、肝保護作用、神経保護作用など、複数の生物学的特性を示します（3）。 現代の薬理学の調査は、ハーブのさまざまな成分がCistanche、ECHを含む、アクテオシド、カンカノセ、スリランカサイドF、シスタノサイドF、血管弛緩作用を示す（4）。
内皮は血管系の重要な調節因子であり、一酸化窒素（NO）は内皮細胞。NOは平滑筋細胞に拡散することにより、グアニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリックグアノシン一リン酸（cGMP）のレベルを上昇させ、次にcGMP依存性プロテインキナーゼ（PKG）を活性化して平滑筋弛緩を促進します（5）。 350-400 µMのECHは血管平滑筋に直接作用し、ラット肺動脈平滑筋細胞の低酸素誘発性増殖を阻害することが以前に示されました（6）が、30-300 µMECHは内皮の急性血管弛緩を引き起こしました-濃度依存的に無傷のリング、およびフェニレフリンによって収縮した大動脈リングの海綿体平滑筋におけるcGMP産生の増強（7）。 平滑筋細胞のNO-cGMP-PKG-BKCaチャネルを開くことにより、100または300 µMのECHは、ラットの肺動脈、特に内皮が露出したリングでのノルアドレナリン誘発性収縮を抑制しました（8）。内皮細胞は心血管機能の重要な調節因子であり、いくつかのケースでは、内皮依存性弛緩は、内皮から放出されるNOなどの移動性物質によるものであることがわかっています（9）。 ただし、血管におけるECH誘発性NO産生の上流分子メカニズム内皮細胞さらなる調査が必要です。 血管内皮では、NOの生成は主に内皮型NO合成酵素（eNOS）によって媒介されます。 いくつかのグループは、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）経路がセリン-スレオニンプロテインキナーゼB（Akt）を活性化し、セリン1177（Ser1177）で直接eNOSリン酸化を引き起こすことを示しました（10）。 アンドロゲン受容体（AR）は、核内受容体サブファミリーs3のメンバーであり、遺伝子発現を標準的に変更します。 細胞膜のカベオラへのAR局在化は、c-Src / PI3K / Aktカスケードをトリガーすることにより、内皮細胞機能または遺伝子発現の非ゲノム調節に関与し、最終的にeNOSリン酸化とNO産生をもたらします（11）。 人間の大動脈では内皮細胞、テストステロンは、心血管系でのARとPI3Kのp85サブユニットの直接相互作用により、PI3K / Aktシグナル伝達を活性化し、NO産生を急速に誘導することが報告されています（12）。 ECHは、テストステロンの代わりにARに競合的に結合するため、ホルモン欠乏症に関連する症状を悪化させ、アンドロゲン様の効果を発揮することが報告されています（2）。 したがって、本研究では、PI3K/Akt経路がECHによって誘導されるAR依存性eNOSリン酸化を介したNO産生に関与している可能性があるとの仮説を立てました。 本研究の目的は、ECHの以下の効果を評価することでした。i）NO産生およびeNOSリン酸化の誘導。 ii）eNOSリン酸化へのARの関与、およびiii）内皮細胞機能および血管新生の調節を研究するためのよく知られた実験モデルであるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）におけるPI3K / Akt経路の活性化（13）。
材料および方法
化学薬品および試薬。 ECH（純度、92.5％）は、National Institute for the Food andDrugControlのNationalDrugReferenceStandardsから取得されました。 p-Akt（Ser473;カタログ番号ab8805）、Akt（カタログ番号ab81283）、p-eNOS（Ser1177;カタログ番号ab184154）、およびeNOS（カタログ番号ab76198）に対する抗体はAbcamから購入しました。 。 ニルタミドおよびICI182780の阻害剤は、Sigma-Aldrichから入手しました。 メルクKGaA。 L-NAMEはAdamas-Beta、Ltd.から購入し、wortmanninはPribolabから購入しました。
細胞培養と薬物治療。
HUVECはScienCellResearchLaboratories Inc.から入手し、内皮細胞培地（ECM; ScienCell Research Laboratories）、5％（v / v）ウシ胎児血清（FBS; Gibco、Thermo Fisher Scientific、Inc.）および1％内皮細胞増殖サプリメント（ECGS）、37℃（5％CO2および湿度95％）（14）。 コンフルエンスに達したら、細胞をトリプシンで消化し、1パーセントのFBSと1パーセントのECGSを含むECMにプレーティングしました。 すべての実験で、HUVECを1x1 0 4 / mlの濃度でプレーティングし、コンフルエンスに達するまで増殖させました。 ECHまたは他の刺激剤で処理する前に、細胞をFBSおよびECGを含まないフェノールレッドを含まないECMで6時間インキュベートして、増殖停止を誘導しました。 阻害実験では、HUVECを、1 0 µMニルタミド、10 µM ICI 182780、0.5 mM L-NAME、または5 µMワートマニンを含むさまざまなアンタゴニストまたは阻害剤と30分間、ECHの有無にかかわらずプレインキュベートしました。 37℃で。 対照を含むすべてのグループで、DMSOを0.001パーセントの等しい濃度で溶媒として使用しました。
細胞内NO産生の測定。
以前に報告されたように（12）、HUVECのサイトゾルNO濃度の相対的変化は、蛍光NOプローブDAF‑FM（Cayman Chemical Company）を使用して監視されました。 簡単に説明すると、細胞に5 µMのDAF‑FMジアセテートを37℃で20分間、黒色のマイクロタイタープレートにロードし、PBS（pH 7.4）で数回リンスしました。 蛍光は、蛍光マイクロプレートリーダー（Biotek Synergy H4; BioTek Instruments、Inc.）とコンパクト倒立顕微鏡（Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation）を使用して、それぞれ495nmと515nmの励起波長と発光波長で測定されました。
ウエスタンブロット分析。
以前に報告されたように（15）、細胞のコンフルエントな単層を氷冷PBSで2回洗浄し、RIPAバッファー（P 0 013D; Beyotime Institute of Biotechnology）で溶解しました。 上清中のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ法を使用して測定されました（16）。 続いて、レーンごとに30 µgのタンパク質をロードし、10％ポリアクリルアミドゲルを使用して分離し、ポリフッ化ビニリデンメンブレンに転写しました。 膜は25℃で1時間5％スキムミルクでブロックされました。 Akt（1：1、000希釈）、p-Akt（1：500希釈）、eNOS（1：2、000希釈）、またはp-eNOS（1 ：1、000希釈）4℃で一晩、膜をTBST（0.1パーセントTween -20を含む）で4回、25℃で1回の洗浄につき約15分間洗浄しました。 続いて、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（1：5、000希釈、抗マウス抗体、カタログ番号A0216、または抗ウサギ抗体、カタログ番号A0208、Beyotime Institute）とともにインキュベートしました。 of Biotechnology）を25℃で1時間検出し、強化された化学発光キット（カタログ番号32209、Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用して検出しました。 バンド強度は、Image Jゲル分析ソフトウェアバージョン1.8を使用して定量化されました。0_112（国立衛生研究所）。
低分子干渉（si）RNAの調製とトランスフェクション。
長い二本鎖RNAは、ARのターゲットmRNAとエストロゲン受容体（ER）によって、表Iに示す配列で合成されました。siRNAノックダウンの条件には、非抗菌性で維持された70パーセントのコンフルエンスでHUVECをトランスフェクトすることが含まれます。 60mmのコラーゲンでコーティングされた培養皿の培養培地。 Lipofectamine 3000試薬（Invitrogen; Thermo Fisher Scientific、Inc.）による5nMAR-siRNAまたは10nMER -siRNAのトランスフェクションは、製造元のプロトコルに従って個別に実行しました。 トランスフェクション効率は、以前に報告されたように（17）、逆転写定量PCR分析（RT-qPCR）によって評価されました。 熱サイクル条件は次のとおりです。95℃で10分。 95℃で5秒間、60℃で1分間を40サイクル、95℃で15秒間、60℃で1分間、95℃で15秒間の融解曲線。 各サンプルに対して、3つの独立した生物学的複製が実行されました。 その後の実験は、トランスフェクションの48時間後に実施されました。 プライマーペアは、Primer Premier v5.0ソフトウェア（PREMIER Biosoft）を使用して、次のシーケンスで設計されました。 ER順方向、5'‑CCAGTACCAATGACAAGGGAAG -3'および逆方向、5'-TCACAGGACCAGACTCCATAA -3'; およびGAPDHフォワード、5'‑CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA -3'およびリバース、5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT -3
統計分析。
すべてのデータは、平均±標準偏差として表されます。 グループ間の統計的比較は、クラスカル・ウォリス検定、または多重比較のためのテューキーの事後検定を使用した二元配置分散分析を使用して実行されました。 P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
結果
ECHはNO産生とeNOSリン酸化を誘導します。
図2AおよびBに示すように、1 µM ECHは、陰性対照細胞と比較してHUVECの細胞内NO産生を有意に増加させましたが、ECHの刺激効果は、L-NAMEによる前処理によって対照レベルまで減衰しました。 最適な濃度を得るために、eNOSリン酸化を0、0。0 1、0の濃度のECHで処理してから60分後にテストしました。 1、1、および10 µM。 その結果、0.01〜10 µMの濃度のECHは、濃度依存的にSer 1177でeNOSリン酸化を有意に誘導し、10 µMのECH誘導で最大のeNOSリン酸化が観察されることが明らかになりました（図2CおよびD）。 さらに、Ser1177でのeNOSリン酸化は、1 µM ECHとのインキュベーション後0、5、15、30、60、および120分でウエスタンブロット分析によって調べられました。 eNOSリン酸化は5分でECHによって急速に誘発され、30分のインキュベーションまで増加し続けることが観察されました（図2EおよびF）。 その後、ECH処理にもかかわらず、eNOSリン酸化の相対的な大きさは30分以降安定したままでした。 したがって、ECHは総eNOS発現に影響を与えませんでした（図2CおよびE）。
ARは、ECHによって誘発されるNO産生とeNOSリン酸化を仲介します。
RT-qPCRアッセイは、AR-siRNA-1とER-siRNA-2の干渉効果が、本研究のHUVECにおけるARとERの発現を阻害するのに最も成功したことを示しました（図3 ）。 続いて、AR機能阻害分析用のアンタゴニストおよびAR機能喪失分析用のsiRNAを適用して、ECH誘導性のeNOS活性化およびNO産生におけるARの関与を評価した。 図4Aに示すように、1 µMのECHはHUVECでのNO産生を有意に増加させました（P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">
ECHはPI3K/Akt経路を活性化します。
本研究では、Ser473でのAktリン酸化を、0、0。0 1、0。1の濃度でECHインキュベーションの60分後にテストしました。 、1、および10 µM。 結果は、ECH（0。01-10 µM）がAktリン酸化を有意に誘導する可能性があることを示しました。 p-Aktの相対的な発現レベルは、1および10 µMのECH処理でピークに達しました（図5AおよびB）。 さらに、Aktリン酸化は、HUVEC培養物に1 µM ECHを添加してから0、5、15、30、60、および120分後にウエスタンブロット分析によって調べられました。 図5CおよびDに示すように、ECHは5分間のインキュベーション後にAktリン酸化を急速に増加させ、p-Aktの最大タンパク質レベルは60分で観察されました。 対照的に、ECHは総Akt発現に影響を与えませんでした（図5AおよびC）。 さらに、eNOSリン酸化に対するPI3K経路の潜在的な影響を調査するために、ECHを適用する前にHUVECをPI3K阻害剤ワートマニンで前処理しました。 ワートマニンは、ECHによって誘発されるNO産生をベースラインレベルまで低下させることがわかった（図5E）。 ECHによって誘発されたDAF‑FM蛍光を調べるときに、蛍光顕微鏡を使用して同様の現象が観察されました（図5F）。 さらに、ワートマニンは、HUVECにおける急速なeNOSリン酸化を無効にする能力を持っている可能性があります（図5GおよびH）。 前述の結果は、ECHがPI3K/Akt経路を介してeNOSリン酸化とNO産生を活性化する可能性があることを示唆しています。
討論
ECHはハーブから分離された天然化合物ですCistanche、さまざまな薬理学的特性を備えています。 ECHは、血管平滑筋細胞のNO-cGMP-PKG-BKCachannelsを開くことにより、内皮依存性の血管弛緩効果を発揮することが以前に実証されました（7,8）。 現在の調査結果は、ECHがeNOSのAR依存性活性化を発揮して、血管内のPI3K/Aktシグナル伝達経路の関与によりNO産生を誘導したという証拠を提供しています。内皮細胞.
血管壁の最内層として、内皮は血流の変化を迅速に感知して応答することができ、その結果、血管の緊張を調節するために、下にある平滑筋細胞への信号伝達をもたらします（18）。 複数の内皮由来血管拡張化合物が存在し、最も典型的な物質であることが広く報告されています。
NOであり、eNOSの内皮アイソフォームから形成され、リン酸化を引き起こします（19）。 通常の状態では、eNOSはカベオリンに結合すると非アクティブのままであり、次の一連のイベントでアクティブになります。内皮細胞：i）eNOSはカベオリン-1から解離し、Ca2と/CaMに結合します。 ii）熱ショックタンパク質（HSP）90はeNOSを促進します。
さらに、ARが内皮細胞多くのヒト組織において、これは、ヒト内皮細胞の恒常性の調節において、ARを介したプロセスを介して作用するアンドロゲンおよびその類似体の潜在的な役割を示唆しています（21）。 非古典的なPI3K/Akt経路では、ARはPI3K調節サブユニットp85と直接相互作用することによってPI3Kを活性化する可能性があります（22）。 本研究は、ARアンタゴニストまたはAR siRNAが、HUVECにおいてECHによって誘導されるNO産生およびeNOSリン酸化を減少させることを示した。 エストロゲンは内皮細胞における古典的なER活性化を介してeNOSリン酸化を誘導し、NO産生を刺激することが以前に報告されており（23）、ECHの投与は子宮内でのERの発現を有意に増強します（24）。 ただし、本研究では、ARの効果はECHによって誘発されるeNOSの活性化とNOの生成に対するERの効果と比較してより顕著でした。 さらに、ECHはHUVECでARが関与するeNOS活性化を介して数分以内に急性NO産生を引き起こすことが観察されました。これは、内皮細胞における応答の非ゲノム的性質と一致しています。 ARは、細胞質内のHSP90、HSP70、キナーゼSrcなどの足場タンパク質と関連しており、テストステロン処理から5分以内にAR複合体から膜に輸送されます（23）。 「ターゲットフィッシング」戦略に基づいて、HSP90はPhGs結合ターゲットとして識別されました。これは、ECHが足場タンパク質からのARの解離を促進する可能性があることを示しています（25）。 別の研究では、視床下部では、ECHがアミノ酸Met-894およびVal-713でARポケットと結合し、細胞質ARの核への輸送を阻害する可能性があることが示唆されました（26）。 ただし、ECHが細胞質ARの膜への移行を仲介する根本的なメカニズムについては、さらに調査が必要です。 したがって、ECHがAR依存性eNOS活性化を達成するメカニズムと、それが血管内皮細胞のHSP90への結合とどのように関連しているのかを解明するには、さらなる研究が必要です。
PI3K / Akt経路は、最も重要なシグナル伝達カスケードの1つであり、その活性化は、ホスファチジルイノシトール-3、4、5-三リン酸を生成してSer/のN末端プレクストリン相同ドメインに結合することによって誘導されます。 ThrキナーゼAkt。 これにより、原形質膜へのAktの動員が促進されます（27）。 PI3K / Akt経路は、ECHによって誘発されるNO依存性弛緩の制御に重要な役割を果たす可能性があります。 本研究では、細胞をPI3K阻害剤であるワートマニンとインキュベートすると、ECHが誘導するNO産生が大幅に減少することが明らかになりました。 以前の報告では、15 mg /kgECHが5-フルオロウラシル抑制骨髄細胞のPI3K/Aktシグナル伝達経路を活性化することが示されました（28）。 本研究では、PI3K阻害剤はSer1177でのECH誘発性eNOSリン酸化を有意に減少させました。 さらに、Akt活性は主に上流の調節経路、特にSer473でのPI3K依存性リン酸化によって調節されていました（20）。 本研究では、ECHはSer473で用量依存的にAktリン酸化を誘導しました。 同様に、以前の研究では、5、10、または20 µMのECHが、p-AktおよびSLC8A3を潜在的にアップレギュレートすることにより、無酸素/再灌流治療に対して心臓保護効果を発揮することが示されました（29）。 Akt遺伝子の転写調節はほとんど知られていないままです（30）。 したがって、本研究は、Aktに対するECHの転写後調節効果に焦点を合わせた。 前述の発見を考慮に入れると、HUVECへのECHの適用は、eNOSをリン酸化し、続いてNO産生を増加させるPI3K/Akt経路の活性化につながる可能性があると推測されました。
結論として、ECHは主にから分離されている天然物ですハーブシスタンチェ。 ECHによって誘発されるNO産生の根底にある潜在的なメカニズム内皮細胞以下が含まれる場合があります（図6）。i）ECHは、細胞膜のカベオラに局在するARの機能的リガンドとして機能します。 ii）PI3KはSer473でAktの疎水性ドメインに結合し、細胞膜へのAktの動員を促進します。 iii）PI3K / Aktカスケードの動員は、AR依存性のeNOSリン酸化を引き起こし、iv）NOの生成はeNOSによって媒介されます。内皮細胞。 ECHがPI3K/Akt経路の関与を伴うeNOSのAR依存性リン酸化を介してNO産生を誘導するという観察は、ECHの血管弛緩作用のさらなる理解に貢献する可能性があります。 さらに、内皮由来のNO経路を標的とするECHは、非ゲノム効果が原因である可能性があります。 したがって、本研究は、ECHが心血管疾患を予防するためにその薬理学的効果を発揮するメカニズムを解明するのに役立つ可能性があります。
著者：
LI GU、DANHONG LIAN、YIMEI ZHENG、WEI ZHOU、JINLEI GU、XIN LIU
国家教育省食品健康工学研究センター、生命科学部、
Sun Yat-sen University、広州、広東510275、PR中国
2019年5月1日受領。 2019年12月10日受理
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