エキナコシド、ニクジュヨウの有効成分、膵臓腺癌細胞の成長はどのようになっていますか？
Mar 13, 2022
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com
エキナコシドは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路を介してアポトーシスを誘導することにより、膵臓腺癌細胞の増殖を抑制します
WEI WANG、JINBIN LUO、YINGHUI LIANG、XINFENG LI
概要。
伝統的な漢方薬に由来する天然物の臨床応用は、癌化学療法において注目を集めています。エキナコシド（ECH）、の茎から分離されたフェニルエタノイドの1つCistancheサルサ（中国の漢方薬）は、中枢神経系に組織保護および抗アポトーシス効果をもたらします。 しかし、それはほとんどとらえどころのないままですエキナコシド 腫瘍抑制作用を持っています。 本研究では、エキナコシド活性酸素種の産生とミトコンドリア膜電位の摂動を誘発し、それにより誘発することにより、膵臓腺癌細胞の増殖を著しく阻害することができますアポトーシス。 さらに、エキナコシドMAPK活性を調節することにより腫瘍細胞の成長を抑制します。 結論として、この研究は、癌の発生を予防する上でのECHの新しい機能を明らかにし、エキナコシド 癌の潜在的な化学療法戦略である可能性があります。
序章
癌は生命を脅かす病気であり、世界中の主要な死亡原因の1つです。 癌細胞は抑制された特徴がありますアポトーシス、制御されていない成長と増殖、および転移（1）。 多くの場合、遺伝子の変化によって開始される癌の発症は、発癌性タンパク質と腫瘍抑制因子との間の相互作用が複雑なシグナル伝達ネットワークを形成することを含む複雑なプロセスです。 たとえば、癌遺伝子Mycはさまざまな種類の癌で増幅または過剰発現することがわかっており、Mycにコードされた癌タンパク質は、細胞周期の進行を促進し、細胞増殖を刺激し、血管新生を誘導することによって腫瘍形成を促進できます（2）。 ただし、Mycによってトリガーされる発癌性シグナルは、発癌性E 3-リガーゼマウス二重微小染色体（MDM）2-を介したp53分解を軽減する腫瘍抑制因子ARFの誘導を介して、p53腫瘍抑制因子経路を活性化できます（ 3）。 これは、細胞が悪性形質転換するのを防ぐ自動調節された自己保護メカニズムです。 特に、p53は、例えば、翻訳サイレンシングのためにMyc mRNAを標的とするmiR-145を転写的に活性化することにより、Myc活性を抑制し（4,5）、負のフィードバック調節ループを形成します。
癌を治療するための最も簡単で効果的な戦略は、癌細胞を殺すことです。 シスプラチン（6）、アクチノマイシンD（7）、アドリアマイシン（8）などの一般的に使用される抗がん剤は、アポトーシスを促進することによって腫瘍の成長を阻害することが示されています。 最近、植物、特に伝統的な漢方薬（TCM）で使用される薬用植物からの多くの天然産物および誘導体が、癌細胞のアポトーシスを誘導することによって腫瘍抑制機能を示し、臨床応用の可能性があることを示す証拠が増えています。癌治療において（9）。 たとえば、TCMから分離された天然のアントラキノンエモジンであるRadix rhizome Rheiは、さまざまな種類の癌細胞の増殖を抑制することができます（10,11）。 中国の「幸せな木」であるCamptothecaacuminateに由来するカンプトテシンは、トポIを介した鎖切断後のDNAのライゲーションを阻害する貴重な天然物です（12）。 進行性乳がんの合計729人の患者を対象とした別の遡及的集団ベースのコホート研究では、TCM療法ががん治療に寄与する可能性があることが示唆されました。 このコホートのうち、115人の患者がTCMユーザーであり、614人の患者がTCMを使用していませんでした。 多変量解析は、非使用者と比較して、TCMの使用がすべての原因による死亡のリスクの大幅な減少と関連していることを示しました（13）。 前述のすべての調査結果は、TCMが癌の治療に使用できる重要な補完代替医療であることを示しています。
エキナコシド（ECH）はの茎から分離されたフェニルエタノイドですホンオニクサルサは、抗血清および抗疲労剤として使用される重要な生薬である漢方薬です（14）。 いくつかのフェニルエタノイドはフリーラジカル捕捉特性を持ち、酸化ストレスによって誘発される有毒な傷害から保護することがわかっています（15）。 さらに、より多くの生物学的特性エキナコシドそれ以来解明されてきました。 たとえば、ECHは炎症性サイトカインのレベルの上昇を救い、急性肺損傷のあるマウスの肺の組織病理学的異常を改善することができます（16,17）。 また、エキナコシド パーキンソン病のマウスモデルにおいて、神経組織を保護し、行動障害を改善することが示されています（18）。 特に、ECHは細胞増殖を促進し、阻害することがわかっていますアポトーシスマウス腸上皮MODE-K細胞で（19）。 しかし、これまでのところ、癌予防におけるECHの潜在的な役割にはあまり注意が払われていません。
この研究では、エキナコシド 治療は腫瘍細胞の成長と増殖に影響を及ぼし、エキナコシドアポトーシスを誘発し、活性酸素種（ROS）の生成を高め、ミトコンドリア膜電位（MMP）を低下させ、その結果、腫瘍細胞の成長を抑制します。 さらに、本研究は、ECHを介した細胞増殖阻害の原因となる分子メカニズムを特定することを目的とした。
材料および方法
細胞株、試薬、および抗体。
SW199 0膵臓腺癌細胞（ATCC、マナッサス、バージニア州、米国）は、10％ウシ胎児血清、50 U / mlペニシリン、および0.1 mg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地で37℃で培養しました。 5パーセントのCO2加湿雰囲気。エキナコシドJrdun Biotechnology Corp.（上海、中国）から購入しました。 AKT、P-AKT、ERK、P-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38、およびGAPDHに対する抗体は、Cell Signaling Technology（Danvers、MA、USA）から購入しました。 anti-Baxおよびanti-Bcl-2は、Santa Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz、CA、USA）から購入しました。 抗カスパーゼ-3はアブカム（上海、中国）から購入しました。
細胞生存率アッセイ。
腫瘍細胞の増殖速度を評価するために、Cell Countingキット{{0}}（CCK -8; Dojindo Molecular Technologies、Rockville、MD、USA）を製造元の指示に従って使用しました。 細胞懸濁液をウェルあたり5、000細胞で播種し、96-ウェル培養プレートに0、12、24、48、または72時間ECH処理しました。 細胞増殖阻害は、CCK-8キットのWST -8試薬を各ウェルに最終濃度10％で添加することで測定し、サンプルの吸光度をマイクロプレートリーダー（Multiskan MK3;サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）。
Hoechst33342染色。
細胞（60％コンフルエンス）をHoechst 33342（Beyotime Institute of Biotechnology、海門、中国）で最終濃度1 µg / mlで処理し、37℃のインキュベーターで15分間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、固定しました。 4％パラホルムアルデヒドで30分間、室温でスライドにマウントします。 細胞核の形態学的変化を蛍光顕微鏡（オリンパスBX51、メルビル、ニューヨーク、米国）で観察した。 正常な核は丸くて水色に染色されたが、アポトーシス核は収縮して明るい青色に染色された。
蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析。
の評価のためにアポトーシス、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-アネキシンVアポトーシス検出キット（BD Biosciences、上海、中国）は、製造元の指示に従って使用されました。 簡単に説明すると、5x1 0 4細胞を氷冷PBSで洗浄し、0.1 ml結合バッファー（Beyotime Institute of Biotechnology）に再懸濁し、10 mlのFITC結合アネキシンV（10 mg / ml）と10で染色しました。 mlヨウ化プロピジウム（PI）（50mg / ml）。 暗所で室温で15分間インキュベートし、400 mlの結合バッファーを添加した後、細胞をフローサイトメーター（C6; BD Biosciences、上海、中国）で分析しました。
活性酸素種（ROS）の測定。
ROSの生成を評価するために、製造元の指示に従って、活性酸素種アッセイキット（Vigorous Biotechnology、北京、中国）を使用しました。 簡単に説明すると、細胞（80％コンフルエンス）を回収し、PBSで洗浄してから、ジヒドロエチジウム（DHE）溶液（Beyotime Institute of Biotechnology）で染色しました。 次に、細胞をフローサイトメトリー分析によって分析した。
ミトコンドリア膜電位（MMP）の測定。
テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）アッセイキット（ImmunoChemistry Technologies、米国ミネソタ州ブルーミントン）を使用して、MMPの変化を検出しました。 簡単に説明すると、細胞（80％コンフルエンス）を回収し、PBSで洗浄し、37℃のインキュベーターで15〜20分間TMRMで染色しました。 次に、細胞をPBSで1回洗浄し、フローサイトメトリー分析にかけた。
イムノブロッティング分析。
細胞（8 0パーセントコンフルエンス）を回収し、50 mM Tris-HCl、pH 7.4からなるRIPAバッファー（Jrdun Biotechnology）で溶解しました。 150 mM NaCl、1 mM EDTA、1パーセントNP-40、1パーセントデオキシコール酸ナトリウムおよび0.1パーセントSDS、および新たに添加されたプロテアソーム阻害剤。 以前に記載されているように（20）、等量の明細胞溶解物をイムノブロッティング分析に使用した。
統計分析。
定量的データは、平均±標準偏差として表されます。 統計的差異は、統計的SPSS15.0ソフトウェアを使用した対応のないスチューデントのt検定によって評価されました。 P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
結果
エキナコシド 腫瘍細胞の成長を抑制します。 報告されていますがエキナコシド 阻害することにより保護的な役割を示しますアポトーシス神経細胞や腸上皮細胞（16-19）などの体細胞の炎症シグナルでは、ECHが癌細胞の成長と増殖を制御するかどうかはわかりません。 これをテストするために、グレードIIの膵臓腺癌に由来するSW1990細胞を、図1に示すように滴定された用量のECHで処理することにより、細胞生存アッセイを実施しました。 5-日の培養期間中の依存的な方法（図1）。
エキナコシド アポトーシスを引き起こします。 の喪失としてアポトーシスは膵臓癌細胞の制御されていない増殖の根底にある主要な原因メカニズムの1つであり（21）、本研究はECHがアポトーシスを引き起こすかどうかを決定するために一連の実験を行いました。 まず、腫瘍細胞の核をヘキスト33342で染色することにより、ECHがアポトーシス用量依存的に（図2A）。 さらに、FACS分析は、tyのアポトーシス効果をさらに確認するためにアネキシンV/PI染色を使用して実施されましたエキナコシド （図2B）。 アポトーシス細胞の平均パーセンテージは、通常の培養条件下で1.1パーセントでしたが、このパーセンテージは、用量依存的にECH処理に応答して、10.6、21.4、および51.3パーセントに大幅に増加しました（図2C）。 これらの結果は、図1に示す細胞生存率アッセイとともに、次のことを示しています。エキナコシド治療は、トリガーすることによって腫瘍細胞の増殖を抑制しますアポトーシス.
エキナコシド 活性酸素種（ROS）の生成を促します。 ドキソルビシンやシスプラチンなどのいくつかの癌化学療法薬は、生理学的および病理学的条件下でのアポトーシス誘導に重要な役割を果たすROSの強力なジェネレーターであることが示されています（22）。 したがって、ECH処理がROS産生も調節できるかどうかを調べた。 これをテストするために、酸化してDNAと挿入するエチジウムを生成できるDHEをこの研究で使用して、ROS生成を評価しました。 他の抗がん剤と同様に、エキナコシド また、ECH処理時の蛍光強度の上昇によって示されるように、用量依存的にROS産生を刺激します（図3）。
エキナコシドMMPを減らします。 ミトコンドリアの機能障害は、アポトーシスの誘導に関係していることが示されています。 ミトコンドリア透過性遷移孔の開口部は、膜電位の脱分極とアポトーシス促進因子の放出を誘導することが実証されています（23）。 したがって、エキナコシド TMRM蛍光の強度は膜電位に比例するため、確立されたアプローチであるTMRMアッセイを実行することにより、腫瘍細胞でMMPの喪失を誘発する可能性があります。 実証されたエキナコシド 治療は用量依存的にMMPを有意に低下させます（図4）。
エキナコシド マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）を介して腫瘍細胞の増殖を制御しますが、AKTシグナルは制御しません。 の分子基盤をさらに調査するにはエキナコシド媒介腫瘍細胞死、細胞の生存と死を制御するMAPKやAKT（24,25）などのいくつかの重要なシグナル伝達経路の活性を調べた。 MAPKは、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、c-Jun NH 2-末端キナーゼ（JNK）、および3つを介して活性化されるp38ファミリーメンバーを含む、進化的に保存されたプロリン指向性Ser/Thrプロテインキナーゼです。 -ティアキナーゼシグナル伝達カスケード（26,27）。 この研究では、MAPKとAKTの発現、およびそれらの活性化リン酸化型が評価され、次のことが明らかになりました。エキナコシド JNKおよびERK1/2活性を著しく抑制しますが、p38活性を増強します（図5）。 特に、細胞増殖にも非常に重要なAKT活性は、ECH処理の影響を受けないことが実証されました（図5）。 さらに、ECH処理はBaxとカスパーゼ-3の発現を上昇させる一方で、Bcl -2の発現を低下させることが示されました（図5）。これは図2と一致しています。エキナコシドMAPK経路を介して腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こします。
cistancheエキナコシド抗アポトーシスへ
討論
私たちの知る限りでは、これはそれを示す最初の研究ですエキナコシド トリガーすることにより腫瘍抑制機能を持っていますアポトーシス（図2）、ROS産生を促進し（図3）、ミトコンドリア膜電位の脱分極を誘発し（図4）、その結果、腫瘍細胞の成長を阻害します（図1）。 さらに、ECHを介した腫瘍細胞死の分子基盤は、MAPKシグナル伝達経路を調節することによって発生することが示されました（図5）。 これらの発見は、腫瘍形成の予防におけるECHの新しい機能を示しており、したがって、ECHが癌治療の候補薬剤である可能性があることを示唆しています。
抗がん剤の大部分は、腫瘍細胞のアポトーシス、老化、および/または細胞周期の停止を誘発する可能性があり、これが腫瘍細胞の成長と増殖の阻害につながります。 細胞周期停止は、複製DNA合成または有糸分裂を開始する前に細胞が損傷したDNAを修復できるようにする軽度のストレス信号に対する細胞応答ですが、アポトーシスと老化（永続的な細胞周期停止）は、修復不可能または悪性細胞を排除するストレス信号に応答して発生します（ 28,29）。 したがって、のアポトーシス効果のみエキナコシド 癌性細胞を殺すことは抗癌剤の効力を評価するための主要な基準であるため、腫瘍細胞に対する評価がこの研究で評価されました。 特に、ECHは腫瘍抑制因子p53によって転写的に活性化されるアポトーシス促進遺伝子であるBaxの発現を誘導することが実証されました（図5）（30）。 したがって、テストする価値がありますか？エキナコシド p53シグナル伝達経路を活性化することができます。 もしそうなら、ECHはp 53-依存性の細胞周期停止、老化、アポトーシス、またはオートファジーを誘発することもできるかもしれません。 この研究では、SW1990膵臓腺癌細胞株におけるECHの腫瘍抑制機能が解明されました。 ただし、より多くの膵臓がん細胞株を観察するさらなる研究が必要です。 発癌性タンパク質RASおよび腫瘍抑制因子p53の変異は、膵臓がんの発症に関連していることが示されています（31）。 ただし、IARC p53データベースによると、SW1990細胞株にはp53変異が含まれていないため、次のことを調査することが重要です。エキナコシド 異なるp53変異を持つ他の膵臓癌細胞株の成長と増殖に影響を与える可能性があります。 さらに、ECHがアポトーシスを促進し、他の種類の腫瘍の増殖を阻害できるかどうかを判断することは興味深いでしょう。
ROSの上昇とMMPの低下は、エキナコシド 治療は、で不可欠であることが示されていますアポトーシス誘導（22）。 さらに、ROSは、MMPの破壊により、アポトーシスの中間体であるシトクロムcの放出に寄与するミトコンドリア細孔の酸化を誘発する可能性があることがわかっています（22）。 したがって、ECHがROSの誘導を介して間接的にMMPを破壊するかどうかはまだ決定されていません。 さらに、ROSによって誘発される酸化ストレスは、p53、NF-κB、HIF、PI3Kなどの無数の細胞増殖制御シグナルの調節にも関与していることが示されています（32）。 ECHがこれらの重要なシグナル伝達経路を調節するかどうか、もしそうなら、どのように調節するかはまだ決定されていません。 特に、酸化ストレスは、中枢神経系の高い酸素消費量、弱い抗酸化システム、および終末分化特性のために、さまざまな神経変性疾患を引き起こします（33）。 しかし、いくつかの研究はそれを示していますエキナコシド神経組織に対して保護および抗アポトーシス効果があります。 この点で、ECHが最終分化した神経細胞におけるROS産生を減少させる可能性があるという仮説を立てることは合理的です。 したがって、ECHによるROS産生の調節が細胞分化状態に依存しているかどうかも決定されていない。 したがって、他の研究と合わせた現在の結果は、広く使用されているTCMであるECHが、神経変性疾患だけでなく悪性癌の治療にとっても重要な化学療法戦略となり得ることを明らかにしています。
最近、癌治療におけるTCMの使用がますます注目を集めています。 TCMで使用される薬用植物からの天然物の可能性は、西側世界でも科学界によって認識されています（9）。 これらの天然物の根本的な作用機序を解明するための努力が必要であり、それは最終的には癌治療のための効率的で安全な医薬品の開発につながる可能性があります。
結論として、本研究は、エキナコシド また、の分子基盤を詳しく説明しますエキナコシド媒介腫瘍抑制、したがっての潜在的な臨床応用を示唆するエキナコシド 癌治療において。
エキナコシドホンオニク
謝辞
この研究は、FMUの科学研究の主要プログラム（助成金番号09ZD014）によって資金提供および支援されました。 著者は、原稿の編集に協力してくれたBiomedworld（上海、中国）に感謝します。
からエキナコシド誘導することにより膵臓腺癌細胞の増殖を抑制しますアポトーシスWEI WANG、JINBIN LUO、YING HUI LIANG、XINFENGLIによるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路を介して
---分子医学レポート13：2613-2618、2016 DOI：10.3892 / mmr.2016.4867
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