ストレプトゾトシン-ニコチンアミド誘発糖尿病ラットの雄の生殖機能に対するカンカニクジュヨウ抽出物の効果
Jun 17, 2022
キーワード：糖尿病; 不妊;カンカニクジュヨウエキス（CTE）;エキナコシド（ECH）;抗炎症薬アクティビティ;酸化防止剤アクティビティ;ステロイド産生効果
1.はじめに
糖尿病（DM）は、血糖値が上昇している状態です。十分なインスリンを産生する膵臓の非効率性、または体がそれを使用できないこと効果的に。 WHOによると、糖尿病患者数は1980年の1億800万人から増加しました。2014年には4億2200万人に[1]。 4つの主要なカテゴリーがあります：前糖尿病（糖尿病の前の段階）、1型（膵臓がインスリンを産生できない場合）、2型（体がインスリンを使用できない場合）、および妊娠糖尿病（妊娠中に発生します）。 酸化ストレスは、活性酸素種（ROS）と抗酸化剤の生産[2]最終的に糖尿病状態につながります。糖尿病の合併症には、腎臓の機能不全、神経損傷、失明、脳卒中、心臓などがあります。発作、胎児の死、および不妊。 [1]。 研究によると、精子の核、デオキシリボ核酸（DNA）、とミトコンドリアは、男性の糖尿病患者で著しく損傷しました[3]。 中の酸化ストレス精子の輸送は男性の生殖器系のプロセスを変えるでしょう[4,5].
精子形成のプロセスは、視床下部-下垂体-性腺（HPG）によって制御されます軸。 視床下部によって産生されるゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）は、黄体形成ホルモン（LH）と卵胞刺激ホルモン（FSH）の産生。 ライディッヒ細胞が見つかりました精細管に隣接し、LHの制御下でテストステロンを生成します。 FSHトリガー男性ホルモンの通過を助ける抗原結合タンパク質（ABP）の産生。 したがって、不妊症その他の問題は、主にHPG軸で発生する外乱が原因で発生します。 の管理ストレプトゾトシンとニコチンアミドの組み合わせは、実験ラットに糖尿病を誘発します。 ストレプトゾトシンインスリン産生に有毒な化合物です 膵臓とニコチンアミドの細胞はを保護する水溶性ビタミン 完全な損傷からの細胞[6]. カンカニクジュヨウ「RouCong-Rong」としても知られる砂漠の植物種です[7]。 それは主に根に生える非クロロフィル寄生植物Calotropis proceraツリーとは甘粛省、青海省、新疆ウイグル自治区、モンゴル、イラン、インドの乾燥地に広く分布しています。 一般的なの名前カンカニクジュヨウ「デザートヒヤシンス」です。 それは中国の伝統医学で広く受け入れられています「砂漠の高麗人参」という名前が付けられています。 医療分野で広く使用されています病的白帯下、大量の不正出血、慢性腎疾患、便秘、インポテンス、および不妊。 の化学成分カンカニクジュヨウ不揮発性フェニルエタノイド配糖体で構成されています（PHG）、イリドイド、リグナン、揮発性油、アルジトール、オリゴ糖、および多糖類[8]。 研究このハーブからのエキナコシドがROSレベルを調節することによって損傷した線維芽細胞を保護することを示してください[9]. この化合物は、抗酸化作用、血管弛緩作用、および抗炎症作用を一緒に生成します神経保護と骨粗鬆症の予防[10,11]. この研究は、カンカニクジュヨウエキスにECHを含むストレプトゾトシン-ニコチンアミド誘発糖尿病ラットの生殖機能障害。
2。材料と方法
2.1。 材料
ECHとCTEは、Sinphar Pharmaceutical Co.、Ltd（Yilan、Taiwan）から購入しました。 高度糖化最終生成物（AGE）は、Biovision（San Francisco、CA、USA）から購入しました。 LC -540およびTM3細胞株は食品産業研究開発研究所から購入しました（新中、台湾）。 5週齢のSprague-Dawley（SD）雄ラットを国立実験動物センター（台湾、台北）。 飼料ラボダイエット® PMIから購入しましたNutrition International、Inc.（台湾、台北）。 2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）が得られたシグマ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から。 メタノールと4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸酸（HEPES）もSigmaから購入しました。 ダルベッコの改良イーグル培地/F12およびトリプシン-EDTAはGIBCO（ニューヨーク、ニューヨーク、米国）から入手しました。 3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）、ジクロロ-ジヒドロ-フルフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）、ジメチルスルホキシド（DMSO）およびニトロブルーテトラゾリウム（NBT）はSigmaから購入しました。 グルコース酵素キットは、東京の極東成薬から入手しました。 インスリンELISAキットを購入しましたMercodia AB Inc.、Sylveniusgatan 8A（スウェーデン、ウプサラ）から。 T-PER組織タンパク質抽出試薬はThermoScientifific（シカゴ、イリノイ、米国）から購入しました。 反人間/マウス/ラット核ファクターカッパBNF-κBポリクローナル抗体はSantaCruzBiotechnology、Santaから購入しました。クルス、カリフォルニア、米国。 終末糖化産物（RAGE）ポリクローナル用の抗マウス/ラット受容体抗体、抗ヒト/マウス/ラットStARポリクローナル抗体、および抗ヒト/マウス/ラットシトクロムP450 17A1モノクローナル抗体は、Gene Tex（Irvine、CA、USA）から購入しました。抗ヒト/マウス/ラットCYP11A1ポリクローナル抗体はCellSignalingから入手しましたテクノロジー（米国ペンシルベニア州ビバリー）。 イージーブルー試薬は、Invitrogen、ThermoFisherから購入しました。科学（カールスバッド、カリフォルニア、米国）。 アガロースとDNAマーカー100bpはPromegaから入手しました。Corporation（米国ウィスコンシン州マディソン）。 RNeasy Lipid TissueMiniKitはQIAGENから購入しました。ヒルデン、ドイツ。
5パーセントのCO2 インキュベーター（CO2 インキュベーター、Napco 5410、台湾）。 TM3細胞株はダルベッコで培養されましたグルコース（4.5 g / L）、ピルビン酸ナトリウム（0 .5 mM）、L-グルタミン（2.5 mM）、重炭酸ナトリウム（1.2 g / L）、4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸酸（HEPES、15 mM）、および37歳のウシ胎児血清（FCS、10パーセント）または馬血清（5パーセント）◦5パーセントのCCO2 インキュベータ。
エキナコシド（ECH）の細胞生存率の測定：3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-臭化ジフェニルテトラゾリウム（MTT）試薬を細胞生存率アッセイに使用しました。 細胞濃度2に調整されました× 10596-ウェルプレートの細胞/mL。 次に、20µECHのL（培地の2％で希釈）を加え、37℃で24時間インキュベートした。◦5パーセントのCOのC2 インキュベータ。 後で、100µMTT試薬のLは添加し、37℃で4時間インキュベートした◦暗い条件下でC。 吸光度は570nmで測定されました（ELISAリーダー、Dynatech MR5000、クローテン、スイス）。相対的な細胞生存率（パーセント）= [（A570nmのサンプル− A570nmでブランク)]/[(A570で制御− A570で空白)] × 100.
活性酸素種（ROS）の内容分析：
セル数は次のように調整されました2 × 105細胞/mL2パーセントのFBSを含む12-ウェルプレート。 次に、50µL / mLのECH、RES、およびAGEプレートに加え、37℃でインキュベートした。◦24時間C。 24時間後、20 ,70 -ジクロロフルオレセイン-ジアセテート（DCFH-DA）を加え、37℃でインキュベートした。◦Cで30分。 遠心分離後（400× g、 5分）、
AGEsを添加し、37℃でインキュベートしました◦5パーセントのCOのC2 24時間インキュベーター。 後、400µT-PERのL加え、細胞をこすり落とし、125℃で遠心分離しました000× g 20分間（4◦C）。 上澄みで収集され、保存されました−80 ◦C (−80 ◦さらなる分析のためのC冷凍庫、Nuaire、プリマス、ミネソタ州、米国）。
ビシンコニン酸（BCA）キットをタンパク質の定量に使用しました。 次に、10µ標準セル溶液のLと200µL個のBCA試薬を8-ウェルプレートに加え、37℃でインキュベートしました。◦5パーセントのCOのC2 インキュベータ30分間。 吸光度は562nmで測定されました。 タンパク質同定分析を行ったドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）電気泳動による。 サンプルはタンパク質ライセートをタンパク質ローディングバッファーに添加して調製し、ウエスタンブロット分析を行いました特定のタンパク質を検出します。
2.2.2。 インビボ分析
動物モデルの設計：60匹の4-週齢のオスのSprague–Dawley（SD）ラットを国立実験動物センター（台湾、台北）。 各ラットは消毒剤に個別に収容された制御された温度下のステンレス鋼ケージ（23± 1 ◦C）および湿度（40〜60パーセント）、12時間明るい/12時間の暗いサイクル。 食料と水は自由に与えられた。 各ラットは最初に家畜化されました週と主な食事として実験室の齧歯動物の食事5001を与えられました。 すべての手順は標準に従った全国の施設内動物管理使用委員会（IACUC承認番号101026）の台湾海洋大学、台湾。 家畜化後、ラットは2つのグループに分けられました：コントロール実験食5001を与えられたグループ（Con）、および高脂肪食を与えられた糖尿病グループ（HFD、40パーセント）実験全体。 4週間HFDを与えられた後、糖尿病グループラットにストレプトゾトシン（65 mg / kg）（STZ）を注射して、糖尿病（DM）を誘発しました。 内部STZを15分間注射し、ニコチンアミド（230 mg / Kg体重）を注射しました。 注射の1週間後、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）は、糖尿病の誘発の成功を決定するために実施されました糖尿病（DM）。 その後、動物は6つのグループに分けられました：コントロール（実験食を与えられた5 0 01）; DMグループ（DMと45パーセントのHFD）; DMRグループ（DMとロシグリタゾン：0.571 mg / kg BW）と45％のHFD;DME1グループ（DMとCTE：80 mg / kg BW）と45パーセントのHFD。 DME2グループ（DMとCTE：160 mg / kg BW）プラス45パーセントのHFD。 およびDME4グループ（DMとCTE：320 mg / kg BW）と45パーセントのHFD。 ロシグリタゾン（RSG）はポジティブコントロールと見なされます。 CTEの3つの用量（80、160、および320 mg / kg）は、台湾食品衛生管理局（TFDA）の健康食品機能の推奨評価ガイドライン。 実験が終わるまで治療を行った。 すべての実験ラット6週間後に犠牲にされました。 ラットから採血した血液を3000rpmで遠心分離し、4時に15分◦Ｃ．以下の分析のために上澄みを調べた：総ブドウ糖、トリグリセリド、およびコレステロール
決定：
グルコース測定はグルコース酵素キットによって実行されます。 次に、20µ血漿サンプルのLがに追加されました試薬と37で維持◦Cで5分間。 総トリグリセリドと総コレステロール濃度はトリグリセリドとコレステロール酵素キットを使用して決定。 次に、10µ血漿のLは試薬に添加し、製造元の指示に従って実験を行った。吸光度は510nmで測定されました。血漿総グルコース/トリグリセリド/コレステロール（mg / dL）=（Aサンプル− A空欄)/(A標準− A空欄) × 200.サンプル：血液サンプルの吸光度、A空欄：サンプルなしのキットの吸光度値、標準：標準試薬の吸光度、200：濃度の標準試薬200mg/dL。インスリン、レプチン、および恒常性モデルの評価-インスリン抵抗性（HOMA-IR）の決定：インスリンレベルは、インスリンELISAキットによって決定された。 ここで、25µ血漿のLはに加えられました試薬と吸光度を450nmで測定しました。 総レプチン含有量は、レプチン酵素免疫測定アッセイキット。 次に、100µ血漿のLを分析し、吸光度を分析しましたELISAリーダーを使用して450nmで測定した。 実験全体は、製造元の指示。 HOMA-IR値はホメオスタシスモデルから決定されました評価式=空腹時血漿インスリン濃度（mU / mL）× 空腹時血漿グルコース濃度（mmol / L）/22.5。血漿脂質過酸化：ここでは、0 .5mLの血漿を1mLの試薬（15％、{{0}}。25N塩酸（HCl）および0.375パーセント中のw / vトリクロロ酢酸、w/v のチオバルビツール酸0。25NHCl）、100℃の水浴（Water Bath、BUCHI 461、チューリッヒ、スイス）に入れます。◦Cの15分。 冷却後、1 mLのn-ブタノールを加え、激しく振とうし、1500で遠心分離しました。× g 10分間。 上清を回収し、532nmで吸光度を測定しました[12]. マロンジアルデヒド（MDA）濃度（nM / mL）= [（サンプル532nmで− A532nmでブランク)/ （標準532nmで− A532nmでブランク)] × 5. 血漿テストステロンおよび黄体形成ホルモン（LH）レベルの測定：テストステロンELISAキットを使用して血漿中のテストステロンのレベルを測定しました。 RIAキットはLH濃度を決定します。 次に、50µ血漿のLが追加され、計算に基づいたホルモンLH-RP-3（標準）の濃度について。 さらなるステップは、製造元の指示に従ってください。腫瘍壊死因子（TNF）の測定- およびインターロイキン-6（IL -6）濃度：捕捉した抗体をコーティングバッファーで250倍に希釈し、96-ウェルプレート（100µL /ウェル）、そして4に保たれました◦一晩C。 上澄みを吸引し、洗浄で15回洗浄した。バッファー（1回PBS、0.05パーセントTween20）。 200とのインキュベーション（1時間）後µアッセイ希釈剤のg、細胞は洗浄バッファーと100で5回洗浄µLのTNF- 標準液または試験サンプルは各ウェルに加え、2時間インキュベートしました。 洗濯後、100µL個のIL-6検出抗体が追加されました室温で1時間インキュベートしました。 上澄みを吸引し、5回洗浄した。 それで、480 µL個の酵素アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を添加し、室温で30分間インキュベートしました。温度。 上澄みを吸引し、洗浄緩衝液で5回洗浄した。 次に、100µL 基質溶液を加え、室温で15分間インキュベートした。 後で、50µストップのL溶液（1Mリン酸）を各ウェルに加え、450nmで吸光度を測定しました。精子と精巣のパラメーターの分析精子サンプル収集：精子サンプル収集は、以前に報告された方法[13]。 精子は上澄みから集められ、さらなる分析。精子の数、精子の運動性、および異常な精子：精子の数は血球計算盤とトリパンブルー溶液を使用して計算。 次に、100µ精子液のLはトリパンブルー溶液と混合し、精子の数、運動性、異常な精子は血球計算盤と顕微鏡を使用して計算[14]. 精子と精巣のニトロブルーテトラゾリウムNBT還元と脂質過酸化：脂質過酸化およびNBT還元は、血漿分析の同じ手順に従って分析されました。
スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ活性の測定：スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性は、RANSELキットを使用して分析しました。 ここでは、0.05mLの精巣ホモジネート1.7 mLの反応溶液（0。0 5 mMキサンチン、0.025 mM 2-（4-ヨードフェニル）-{{0}}（4-ニトロフェノール）-5-フェニルテトラゾリウムクロリド（INT））。 混合後、0.25 mLキサンチンオキシダーゼ（80 U / L）を加え、室温で30秒間室温で反応させた。 吸光度は505nmで測定。 精巣ホモジネートのタンパク質濃度は、Bio-Rad DCタンパク質アッセイキットとその比活性（U / mgタンパク質）を計算しました。 カタラーゼ（CAT）活動は、以前に報告された方法[15]. H＆E（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色精巣を10％のホルマリンに24時間浸し、4℃で保存しました。◦C.組織をスライスしてマイクロサイズで、スライドに取り付けられています。 固定後（95％メタノール+ 5％酢酸）、スライドはヘマトキシリンに3分間浸し、流水で5分間洗浄した後、50パーセント、70パーセント、および90パーセントのアルコールを1分間。 その後、スライドをエオシンで10秒間染色し、それが消えるまで1分間100パーセントアルコールに浸しました。 最後に、スライドをキシレンに浸しました。分。 その後、スライドを風乾して密封しました。 染色されたチューブを逆位相差に置いた。観察する顕微鏡（逆位相差顕微鏡、オリンパスCK -2、東京、日本）形態。視床下部の分析マウスKISS1、Gタンパク質共役型受容体（GPR）54、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー3（SOCS -3）サーチュイン1（SIRT1）遺伝子配列はNCBI（国立バイオテクノロジーセンター）から特定されました情報）遺伝子データベースと特定のプライマーは、プライマー5を使用して設計されました。0 PREMIER Biosoft、米国カリフォルニア州パロアルト）。 実験で使用したプライマーを表に示します。1.
視床下部からのリボ核酸（RNA）の抽出。 からのRNAの抽出脳の視床下部は、RNeasy Lipid TissueMiniKitを使用して実施しました。 得られたmRNAは逆転写（RT）とポリメラーゼ連鎖反応によって定量的に測定されました（PCR）。 RT分析から得られた補体DNAは−20 ◦後で使用するためのC。抽出されたDNAは、Taqポリメラーゼを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析にかけられました。じゃあ5〜10µPCR産物のLを採取し、1.5％寒天での電気泳動により分析しました。コロイド。 画像はUVPBioDoc-Itイメージングシステムで撮影されました。 逆転写相補デオキシリボ核酸（cDNA）を採取し、IQ SYBRGreenSupermixを使用してPCRを実施しました。キット。 その後、iQTM5光学システムソフトウェアで分析しました。 タンパク質は、タンパク質抽出試薬（T-PER）。 次に、20mgの精巣ホモジネートを400に加えたµL T-PERと遠心分離（高速遠心分離機、Hettich CR -12、ドイツ、トゥットリンゲン）◦C (125,000× g）20分間。 次の方法は、「識別と定量化」に類似しています。invitro分析におけるタンパク質の分析」。2.3。 統計分析実験結果は平均として表された± 標準偏差（平均± SD）とデータは、Statistical Product＆Service Solutions（SPSS）11. 0ソフトウェア、IBM、Armonk、ニューヨーク、ニューヨーク、米国。 グループ間の差異は、一元配置分散分析によって分析されました。分散分析（ANOVA）。 異なるグループの多重比較は、ダンカンのテストによって分析されました。の値p < 0.05="" as="" the="" signifificant="">
3.結果
3.1。 インビトロ分析
3.1.1。 ECH、CTE、およびRESの抗酸化活性の比較
糖尿病の主な原因は、長期にわたる高酸化ストレスと慢性炎症です。合併症[16]。 CTEには、エキナコシドなどのさまざまなフェニルエタノイド配糖体が含まれています（ECH）およびアクテオシド、抗酸化活性の可能性がある[17]。 DPPHラジカルスカベンジングECHの抗酸化活性を評価するためにアッセイを行った。 トロロックスとレスベラトロール（3,5,4'-トリヒドロキシスチルベン、RES）をそれぞれ標準対照および陽性対照として採用した。 示されているように図では1、ECHはより優れたラジカル消去活性を示し、その活性は有意に高かったポジティブコントロール（RES）よりも。
3.1.2。 LC-540およびTM3ライディッヒ細胞でのECHの細胞生存率異なる濃度のECHの細胞生存率を評価するためにMTTアッセイを実施しました。LC -540ライディッヒ細胞とTM3ライディッヒ細胞は、で処理した後、生存率の80％以上を示しましたECH（図2）。 他の濃度と比較して、100-µM濃度（100の希釈µM ECHの2％FBS）は、TM3ライディッヒ細胞でより優れた細胞生存率を示しました。 結果は、ECHの濃度の増加は、細胞への重大な毒性には寄与しません。
3.1.3。 LC-540およびTM3でのNBTアッセイによるAGE誘発スーパーオキシド産生に対するECHの効果ライディッヒ細胞
AGEsは、ブドウ糖の酸化とOなどのフリーラジカル2-、ヒドロキシルラジカル、およびカルボニル基[18]。 刺激を受けた後50 µg / mLのAGE、LC -540（図3a）およびTM3（図3b）細胞をECHおよびRESで処理した(5 µMと10µMそれぞれ）。 結果は、スーパーオキシドアニオンの生成が増加したことを示した対照群（刺激されたAGEs）では、しかしスーパーオキシドアニオンの生成は後に減少しましたECHおよびRESによる治療。 図から3、ECHとRESがレベルを下げることがわかったスーパーオキシドの生産を促進し、細胞を酸化的損傷から保護します。 LC -540セルの場合、10 µM ECHは、正常群とほぼ同様の活性を示しました。 両方のスーパーオキシド生成細胞は、ECHとRESの両方の濃度の増加とともに減少しました。3.1.4。 Hに対するECHの影響2O2 AGE刺激LC-540ライディッヒ細胞での産生DCFH-DAアッセイは、酸化種の存在を検出するために実行されました。 入った後細胞、FL蛍光色素DCFH-DAは細胞内Hによって酸化されます2O2 そしてジクロロフルオレセインを形成します（DCF）。 図に示すように4、細胞内Hの有意な増加がありました2O2 での生産AGE刺激群（対照）、10の追加µMECHとRESが大幅に削減されましたH2O2 細胞内での生産。 10の管理µMECHの結果はHの約47.1パーセントにすぎませんでした2O2 生産量は、対照群よりも大幅に低い。
3.1.5。 RAGEおよびNF-に対するECHの効果κBAGE刺激LCにおけるタンパク質発現レベル-540ライディッヒ細胞
LC -540ライディッヒにおけるRAGEの存在を確認するために、ウエスタンブロット分析を実施しました。細胞。 RAGEに対するECHの影響（図5a）およびNF-κB（図5b）タンパク質発現レベルAGEsで刺激されたライディッヒ細胞を図に示しました5。 結果は、50µg / mLAGEsの濃度はより高いRAGEとNFを誘発しました-κLC-540ライディッヒ細胞と10 µECHとRESのM濃度は、RAGEとNF-の発現を大幅に減少させました。κB. NF-の発現κBは、RAGE拮抗薬よりもRESおよびECHが有意に低かった。 だから、結果ECHがRAGEとNF-のレベルを下げることによって炎症のレベルを下げることを確認しましたκB.
.1.6。 AGE刺激LC-540ライディッヒ細胞のテストステロン合成経路に対するECHの効果。
精子形成と男性不妊のプロセスは、テストステロンの存在に依存します。図に示すように6、StARの表現（図6a）、CYP11A1（図6b）、CYP17A1（図6c), およびHSD17 3（図6d）AGE刺激LC-540ライディッヒ細胞でタンパク質が有意に減少した細胞（対照群）。 StAR、CYP11A1、CYP17A1、およびHSD17の発現 3つのタンパク質はRAGE拮抗薬、RES、およびECHを追加すると、大幅に増加しました。 増加StARおよびCYP11A1タンパク質の発現は、ECHおよびRES治療群の両方で見られました。CYP17A1の発現レベルは、RESグループとECHグループでほぼ同じでした。 の表現HSD17 ECH処理したライディッヒ細胞の3タンパク質は、RESおよびRAGEのタンパク質よりもはるかに高かった。アンタゴニスト処理細胞。 StAR、CYP11A1、CYP17A1、およびHSD17の発現増加 3つのタンパク質テストステロンの正常な生産を示した。
5細胞/mLおよびRESおよびECHによる処理(10µM）24時間投与した。 -アクチンは内部対照として採用されました。 通常のグループ（Nor）培地で処理し、対照群（Con）はAGEs（50µg / mL）。
結果平均として示されました±SD （n = 3）。 重要な違い（p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">ダンカンの多重範囲検定によって分析されます。
