乳癌担持マウスの移植腫瘍の増殖と転移に対するルニングIIの効果とその機序
Mar 13, 2023
目的：
Runing II (乳癌用の漢方製剤) が移植された乳癌 MA-891- TA2 マウスの腫瘍の成長と転移に及ぼす影響とそのメカニズムを研究すること。 方法:肺転移を有するTA2マウスの乳癌MA-891細胞株移植腫瘍のモデルを開発し,移植腫瘍の増殖および転移に対するRuning IIの効果を観察した。 血管内皮増殖因子 (VEGF)、血管内皮増殖因子受容体 (VEGFR)、微小血管数 (MVC)、および微小血管面積 (MVA) のレベルを検出するために、免疫組織化学的方法と画像解析が採用されました。
結果：Running II群では、腫瘍重量抑制率と肺転移抑制率はそれぞれ37.3%と65.4%で、腫瘍増殖と肺転移は明らかに抑制された。 また、VEGF と VEGFR、MVC、および MVA のレベルは、担癌対照群と比較して有意に減少しました (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.
また、研究と同時にカンカに含まれるエキナセアに抗腫瘍効果があることも発見しました。 エキナコシドを抗腫瘍薬に適用するために、本発明は、最初に、MTH1、無機ピロホスファターゼ、および dGTP を反応溶液 (100 mM pH8.0 Tris-酢酸、40 mM NaCl、10 mM酢酸マグネシウム、０．００５パーセントのＴｗｅｅｎ２０および１ｍＭＤＴＴ）この方法では、酵素および基質を室温で１時間インキュベートし、次いで２５μｌのマラカイトグリーン溶液を添加して反応を停止させた。 吸光度は、BIO‑RAD iMark マイクロプレート リーダーを使用して 630 nm で検出されました。 結果は、エキナコシドが MTH1 の酵素活性に対して有意な阻害効果を有することを示しました。 第二に、細胞レベルでの腫瘍細胞に対するエキナコシドの効果がMTTアッセイによって検出され、結果は、エキナコシドがSW480結腸癌細胞およびU2OSヒト骨肉腫細胞の増殖を有意に阻害できることを示し、本発明はエキナコシドの増殖を阻害した。腫瘍細胞の生存を維持する特定の酵素である MTH1 は、酸化されたヌクレオチドの DNA への取り込みを引き起こし、癌細胞で致死的な DNA 二本鎖切断を引き起こし、それによって抗腫瘍効果を生み出します。 新しい医療への応用は、将来の新しい抗腫瘍薬の開発の基盤となります。
キーワード:
乳腺腫瘍; 血管新生; 血管内皮増殖因子 (VEGF); ランニングⅡ（乳癌用漢方製剤）
乳癌は女性の健康を著しく脅かす悪性腫瘍であり、その罹患率は女性の悪性腫瘍の中で第1位であり、年々増加傾向にあります。 その治療法はいくつかの進歩を遂げましたが、乳癌患者の長期生存率は、腫瘍の浸潤性増殖および転移のために上昇していません。 腫瘍の血管新生は、腫瘍の成長、浸潤、および転移の基本的な条件です。
したがって、腫瘍の血管新生を阻害することは、腫瘍の産生と発達を予防し、患者の寿命を延ばすための効果的な方法です.肺転移を伴う TA2 マウスの乳癌 MA-891 の移植腫瘍における血管新生とその調節因子から、大通りと受胎血管の調節、質量の解決、および腫瘍と抗転移の阻害における解毒が研究されました。
材料
6-8 週齢の体重 (20±2) g の 60 匹の SPF メス TA2 マウスを、天津医科大学の実験動物学科から購入しました。 マウスの乳癌 MA-891 細胞株は、中国医学科学院腫瘍研究所病理学研究室の Luo Liqin 教授から提供されました。
Runing II は、Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici)、Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae)、Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae)、Gou Qi Zi (Fructus Lycii)、E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis)、Yi Yi Ren (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis) で構成されています。 Semen Coicis)、Yin Yang Huo (Herba Epimedii)、Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis) などを、用量比 1.67: 1.67: 1.33: 1.33: 1.33: 1.33: 1.33: 1 で調製した。龍華医院の薬学部門では、伝統的な技法に従って、使用のために 4° に保管されています。 シクロホスファミド (CTX、200 mg/アンプル、分岐番号: 981104) およびタモキシフェン (TAM) は、Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd. によって製造されました。 通常の生理食塩水は、上海富民製薬会社によって製造されました。
血管内皮増殖因子 (VEGF) ポリクローナル抗体 (作業希釈 1:25 ～ 1:50)、血管内皮増殖因子受容体 (VEGFR、作業希釈 1:30 ～ 1:50)、および FVIIIAg ポリクローナル抗体 (作業希釈 1:50) ）Santa Cruz Biotechnology Incから購入しました。 EnVision 二次抗体、ウサギ抗ラット VEGF 抗体、ヤギ抗ウサギ FVIII Ag 抗体、ヤギ抗ウサギ VEGFR 抗体、および EnVision Kit はデンマークの Dako Co. から購入しました。 3,3- ジアミノベンジジン (DAB) は、Shanghai Huamei Bioengineering Factory から購入しました。
方法
動物モデルの開発
動物モデルは、Luo と Gao らの方法を参考にして開発されました 2,3。 対数生存期にあるマウスのin vitro培養乳癌MA-891細胞を選択し、細胞濃度を1×107 /mlに調整した。 無菌条件下で、哺乳動物癌細胞をTA2マウスの右腋窩皮下に接種した(0.2ml/マウス、すなわち2X106細胞/マウス)。
動物の分類と投与方法
接種の２日後、マウスを各群１５匹の４群に無作為に分けた。 １）担癌対照群：｛｛４｝｝．４ｍｌの生理食塩水を１日１回、１週間に５回胃内投与した。 2) Runing II グループ: Runing II を通常の生理食塩水で希釈し、0.4 ml のこの希釈液は 48 g·kg{{10}}·d-1 に相当します。別表「漢方薬の薬理研究方法論」4の「人体表面積と動物体表面積との換算表」に従って計算された1日1回、週5回胃内投与された。 ３）ＣＴＸ対照群：江波が用いた用量について、５ ＣＴＸを生理食塩水で希釈し、５０ｍｇ・ｋｇに相当する｛｛２１｝｝．４ｍｌ｛｛１８｝｝・ｄ｛｛１９｝｝とした。隔日に 1 回、週に 3 回、胃内に投与します。 ４）ＴＡＭ対照群：ＴＡＭを生理食塩水で希釈し、２．７ｍｇ・ｋｇ｛｛２５｝｝・ｄ｛｛２６｝｝に相当する０．４ｍｌを１日１回、週５回胃内投与した。 薬剤は 4 つのグループすべてで 3 週間投与されました。
サンプリング
投与後２２日目にマウスを頸椎脱臼により屠殺し、体重を測定した。 次に、腫瘍塊と肺を採取し、それぞれ重量を測定しました。 マウスの実際の体重=加重体重 – 腫瘍重量。 肺表面の灰色の結節、すなわち転移巣を肉眼で数えた。 固定のために腫瘍塊を 10% の中性ホルムアルデヒド溶液に入れ、続いてパラフィン包埋、超薄切片、免疫組織化学的エンビジョン 2 段階ストレイン、および VEGF、VEGFR、微小血管数 (MVC)、および微小血管面積 (MVA) の測定を行いました。
腫瘍重量抑制率
腫瘍抑制率=(治療後の対照群の平均腫瘍重量 – 治療後の投薬群の平均腫瘍重量)/治療後の対照群の平均腫瘍重量 × 100%。
肺転移抑制率
肺転移抑制率=（対照群の平均肺転移節数－投薬群の平均肺転移節数）／対照群の平均肺転移節数×100％。
Immunohistochemical Envision 2 段階染色
4 μm のパラフィン切片を採取し、続いてキシレンによる通常の脱パラフィン、勾配脱水、および PBS による洗浄を 5 分 x 3 回行いました。 0.0 1 mol/L、pH6.0 のクエン酸緩衝液に切片を浸し、抗原修復のため 98℃ の電子レンジに 10 分間入れ、取り出した後、室温で自然冷却しました。電子レンジ; 一次抗体（それぞれ上記の抗体と対応する抗体の希釈液）を滴下、37℃、90分、PBSで洗浄、5分×3回。 Envasion 二次抗体の滴下、室温で 60 分間、PBS での洗浄、5 分 x 3 回。 新しく調製した DAB 発色溶液を滴下し、顕微鏡下で 3 ～ 10 分間発色を制御し、カンピーチーで 45 秒間対比染色し、水道水ですすぎ、ブロワーで乾燥させ、中性ガムでマウントします。 黄褐色または黒褐色の顆粒の細胞質を有する細胞を陽性とみなした。 乳癌の既知の陽性切片を陽性対照として使用し、一次抗体をPBS緩衝液に置き換えたものを陰性対照として使用した。
画像解析
ACEビデオカメラ（解像力930本）とLEICAQ500Wイメージアナライザー、LEICA全自動画像解析システムを使用。 200 倍の顕微鏡下で、各セクションの 2 つの視野を無作為に選択して VEGF を測定するか、3 つの視野を VEGFR と MVA を測定するために選択し、全視野領域に対する陽性領域の割合をすべてのグループで計算しました。 . MVC を決定するために、100 倍の顕微鏡下で各セクションで最も血管が豊富な 5 つの領域を選択し、400 倍で、重複しない 5 つの領域の各視野の微小血管をカウントし、平均値を使用しました。腫瘍の平均微小血管カウンター (MVC) として。
統計的方法
ソフトウェア SPSS8.0 が使用され、率の比較にはカイ 2 乗検定が使用され、平均の比較には t 検定または一元配置 ANOVA が使用されました。
結果
肺転移を伴う乳癌MA-891-担持TA2マウスの移植腫瘍に対するRunning IIの腫瘍抑制および抗転移効果
It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30% 、有意差あり (両方の P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.
MA-891- 担持 TA2 マウスの移植腫瘍における VEGF および VEGFR 発現に対する Running II の効果
表 2 に示すように、Running II グループと CTX コントロール グループの両方の VEGF と VEGFR の発現は、担癌コントロール グループよりも有意に低かった (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0.05)、VEGF 発現は TAM 対照群よりも有意に低かった (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0.05)、VEGFR 発現は担癌対照群よりも低かった (P<0.05).
MA-891- 担持 TA2 マウスの移植腫瘍の MVA および MVC に対する Running II の効果
表 3 に示すように、投薬群の移植癌における MVA および MVC のレベルは、担癌対照群のレベルよりも有意に低かった (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).
議論
伝統的な中国医学では、腫瘍の発生と発達は、特発性要因と共感性要因の総合的な影響の結果であると考えられていますが、前者にストレスがかかっています。 以前の臨床研究で、Lu 教授と Tang 教授は、内部の生命気の欠乏と大通りと受胎血管の不調和が腫瘍発生の主な原因であり、癌病原体の内部侵入、移動、拡散が癌の主な条件であると考えました。乳癌の成長と転移.6 したがって、治療では、彼らは生命気を養い、塊を取り除くことを提唱しています. ランニングIIは、身体の抵抗力を強化し、次に病原因子を除去するという治療原則に従って、長年の臨床実践を通じてまとめられた漢方処方です。 フォーミュラでは、Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici)、Tai Zi Shen ( Radix Pseudostellariae)、Gou Qi Zi (Fructus Lycii)、Yin Yang Huo (Herba Epimedii) が主要な成分であり、気を補い、陰を養い、調整する効果があります。これは、気と陰の両方の欠乏や大通りと受胎血管の不調和など、乳癌の一般的に見られる特徴に準拠しています。 臨床的には、このフォーミュラは、生存期間の延長、生活の質の向上、腫瘍の病巣の安定化、および癌の転移の防止という明らかな効果を達成します。
本研究では、肺転移を伴う TA2 マウスの乳癌 MA-891 細胞株移植腫瘍のモデルを確立し、固形腫瘍の成長と肺転移に対する Running II の効果を観察し、腫瘍に有意差があることを発見しました。 Running II群と担癌群の間、およびRunning II群とCTX対照群の間の抑制率と肺転移抑制率は、Running IIが腫瘍増殖と抗転移を抑制する明らかな機能を持っていることを示しています。 さらに、タモキシフェン (TAM) は、モデルマウスにおける腫瘍増殖および抗転移を阻害する明らかな機能を持たず、乳癌 MA-891 が ER 細胞株であるという結果および直接作用に関する報告と同様です。海外での TAM の集中度の低さ。
腫瘍は典型的な血管依存性疾患であり、その増殖、浸潤、転移は血管新生に依存しています。 同時に、血管新生は再び腫瘍細胞の転移チャネルを提供し、腫瘍の成長、転移、および拡散に有利な条件を作り出します。 8, 9 VEGF は、血管内皮細胞に対して最も強力で独特かつ特異的な作用を有する血管新生促進因子であり、多くの腫瘍細胞が VEGF を分泌することができます。VEGF は、血管透過性を高め、VEGF 受容体への結合を通じて血管内皮細胞に直接作用します。その分裂と増殖を刺激し、腫瘍の血管新生を誘導し、微小血管数に影響を与えて、腫瘍の成長と転移を促進します.10,11 ほとんどの腫瘍細胞は高いVEGF発現を持っていますが、正常組織では、腎臓、卵巣などでは、VEGF 発現が高くなります。 したがって、一部の学者は、VEGF は腫瘍の代謝と転移のマーカーとして使用でき 12、腫瘍の血管新生をブロックするより理想的な標的部分として使用でき、13 腫瘍の血管調節因子とその作用リンクを妨害し、血管新生因子の発現を調節し、血管新生を阻害すると、腫瘍の増殖と転移が制御される可能性があります。
本研究の結果は、Runing II が VEGF および VEGFR の発現を下方制御して、内皮細胞の VEGF 誘導遊走および増殖のシグナル伝達をおそらくブロックし、腫瘍における血管新生をさらに阻害し、したがって抗腫瘍効果および抗転移効果を発揮することを示しています。 .
以前の研究は、悪性腫瘍の成長過程において、組織の過剰な成長が必然的に局所組織の深刻な無酸素症を誘発し、無酸素症がVEGF mRNAの合成を刺激し、VEGF mRNAの分解を遅らせて、多数の局所的な新しい毛細血管.14,15 免疫組織化学陽性染色細胞の観察において、著者らは、死にかけている壊死性腫瘍細胞の細胞質で明らかなVEGF発現を発見しましたが、逆に、活発な増殖を伴う腫瘍細胞ではVEGFの発現が少ないかまったくないことを発見しました.これは、Talks KLらの報告によると、腫瘍細胞における高レベルの無酸素誘導因子に関連している可能性があります。血行を活性化させ、痰を取り除き、濁りを取り除く働きをするSheng Yi Yi Ren（Semen Coicis）、Shan Ci Gu（Pseudobulbus Cremastrae）など。 それらは、おそらく腫瘍の局所微小循環を改善し、腫瘍細胞への酸素供給を増加させ、したがって腫瘍の成長を阻害して抗転移を行うことにより、VEGFの合成と分泌を阻害します。
参考文献
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