ERKシグナル伝達経路を介したメラニン生成の阻害に対するシュクリエバナナ皮抽出物の効果
Apr 25, 2023
概要
色素沈着過剰症は、メラニン含有量の過剰発現によって引き起こされる一種の色素性疾患であり、肝斑、そばかす、鱗翅目、黒子、および人間の皮膚の他の形態などの深刻な審美的問題を引き起こします。 コウジ酸、アスコルビン酸、ハイドロキノンなど、いくつかの美白剤は副作用や安定性のため使用が制限されており、皮膚炎や皮膚がんに関連する細胞毒性物質として作用する可能性があります。 安全な物質を見つけるために、この研究は、シュクリエ バナナの皮 (SBP) 抽出物に含まれるいくつかの成分が、B16F10 マウス黒色腫細胞の p38 シグナル伝達経路を介してメラニン生成プロセスを阻害する能力を見つけることを目的としました。 チロシナーゼ活性および細胞メラニン含有量は、SBP治療後に用量依存的に減少した。 さらに、SBPは、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)刺激による24時間のインキュベーション後、小眼球症関連転写因子(MITF)としてのメラニン形成関連タンパク質およびチロシナーゼタンパク質の発現を減少させた。 この発見は、SBPがERK経路に影響を与えることなく、p38シグナル伝達経路を介して色素沈着過剰抑制剤に有効な薬剤を含み、その後MITF発現とチロシナーゼ酵素ファミリーの産生を下方制御することを実証した。
関連する研究によると、カンクン「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 その主成分は、シスタノシドなど様々な効果があります。抗酸化物質, 抗炎症薬、 と免疫機能の促進。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。メラニン人間の皮膚では、チロシナーゼによるチロシンの酸化によって生成されますが、その酸化反応には酸素の関与が必要であるため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な因子となります。シスタンケ抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニンの生成を抑制する.
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キーワード:より丈夫なバナナの皮。 フェノール化合物; チロシナーゼ; 小眼球症関連転写因子。 メラニン生成
序章
メラニンは、メラノサイト細胞内の重要な細胞小器官であるメラノソーム内で生成されます。 メラノサイトは皮膚表皮の基底層に位置しています。 製造プロセス後、メラニンは皮膚、髪、目の着色の原因となる色素であり、天然の抗酸化剤、解毒剤、強力なカチオンキレート剤として機能し、また、紫外線ダメージに対する普遍的な保護としても機能します[1]。 異常なメラニン生成は、色素沈着低下や色素沈着過剰などの色素性疾患を引き起こす可能性があります。 色素沈着低下は白斑、白皮症、異常な毛髪の問題を引き起こし、色素沈着過剰はそばかす、肝斑、シミ、炎症後色素沈着過剰を引き起こします。 遺伝的素因、ホルモン変化、特にエストロゲン、肝疾患、腫瘍、癌、栄養失調、下垂体の不規則な機能などのその他の要因が、紫外線曝露などの外的要因を含む内的要因であり、有毒物質が色素沈着過剰の主な原因です[2]。 。
チロシナーゼは、メラニン生成プロセスの刺激と阻害の両方のプロセスを標的とする律速段階酵素です。 メラニン刺激は、日焼け剤や毛髪の色素脱失処理として使用されます。 チロシナーゼの発現は、メラノサイトの分化、増殖、生存を制御するメラノサイト特異的転写因子である小眼球症関連転写因子 (MITF) によって制御されます [3、4]。 メラニン生成に対するMITFの役割は、MiTタンパク質とホモ二量体またはヘテロ二量体の構造でDNAに結合することによってチロシナーゼ発現を増加させることであり、これらの結合部位には、メラニン生成酵素生成への連続ステップを刺激するチミジンヌクレオチドに隣接するE-BoxおよびM-Boxが含まれています。チロシナーゼ関連タンパク質 1 (TRP-1)、チロシナーゼ関連タンパク質 -2 (TRP-2)、ドーパクロム互変異性酵素など。 MITFの調節は、-MSHがセリン/スレオニンキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MARK）を刺激するMC1R受容体に結合した後のシグナル伝達から始まり、細胞外シグナル伝達調節キナーゼ（ERK）やp38も含まれます。 いくつかの研究では、メラニン合成は、ホスファチジリンアシタール-3-キナーゼ（PI3K/AKT）などのいくつかのシグナル伝達経路によって制御されており、B16F10マウス黒色腫細胞のERKシグナル伝達経路を介してポリフェノール基を含む天然物質によって抑制される可能性があることが判明しました[5,6] ]。
この研究は、シュクリエ バナナの皮 (SBP) 抽出物からのメラニン生成阻害の効果を見つけることを目的としていました。 SBPには、カテキン、プロシアニジン、フェルラ酸、没食子酸などのチロシナーゼ阻害剤として作用する数種類のポリフェノール化合物が含まれている可能性があり、これらはTRPなどのメラニン生成酵素の生成に影響を与えるERKシグナル伝達経路の発現によって検出されます-1 TRP-2 [7-10]。
材料および方法
化学薬品および材料
タイ、カンパンペッチ県産のシュクリエ バナナ (ムサ属) の皮をむいたもの (収穫から 7 日後)。 バナナの皮を水で洗浄し、完全に乾燥するまで天日で焼き、ブレンダーで粉砕し、60% メタノールに 24 時間浸漬して抽出し (MW24)、95% エタノールで 4 度 (E4) で 10 分間遠心分離し、DI で沸騰させます。水で 60 度で 20 分間 (W60)、95 パーセントのメタノール中で 60 度で 20 分間沸騰させます (M60)。 次のステップは、40 度のロータリーエバポレーターで体積を減らし、凍結乾燥機 Christ Alpha- 4 LD plus で乾燥することでした。
細胞培養
B16F10 マウス黒色腫細胞を、10% ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 中で 37 度、5% CO2 でインキュベートして培養しました。 24 時間のインキュベーション後、培地を、-MSH 刺激を伴うさまざまな濃度のシュクリエ バナナ皮 (SBP) 抽出物を含む無血清培地に交換しました。 次に、次の実験のためにトリプシン処理によって細胞を収集しました。
細胞生存率アッセイ
SBP抽出物の細胞毒性をMTTアッセイにより測定した。 細胞（5×10 3）を96ウェルプレートに播種し、DMEM中で37度、5パーセントCO2で24時間培養し、その後培地をさまざまな濃度のSBP抽出物を含む無血清培地に交換しました。 48時間。 処理後、培地を捨て、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートし、その後、ＥＬＩＳＡリーダーにより４２０ｎｍで測定した。
メラニン含有量アッセイ
採取した細胞を冷溶解バッファー (20 mM リン酸ナトリウム pH 6.8、1 パーセント トリトン X-100、1 mM PMSF、および 1 mM EDTA) で溶解し、4 度で 1,200 rpm で 10 分間遠心分離して上清を分離し、メラニンペレットを除去しました。 ２００μｌの１Ｎ ＮａＯＨに８０度で６０分間溶解した。 ELISAリーダーを使用して415nmでの吸光度を測定した。 ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質含有量アッセイ (Pierce Biotechnology、米国イリノイ州パックフォード) からのタンパク質含有量と比較して計算されます。
ウェスタンブロット分析
細胞溶解の進行中に分離された上清をSDS-PAGEで分画し、その後Hybond増強化学発光ニトロセルロース膜(Amersham、リトルチャルフォント、英国)に移し、チロシナーゼに対する一次抗体(Santa Cruz、Biotechnology、Santa Cruz)でプローブした。 、カリフォルニア州、米国）、MITF（メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ）、ERK（メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ）、P38（メルクダルムシュタットミリポア、ドイツ）、およびB-アクチンに対するモノクローナル抗体（AC-15、シグマアルドリッチ） ）。 それ以降、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体複合体視覚化で膜をインキュベートし、ImageJ ソフトウェアでシグナルを定量化します。
統計分析 すべての情報は平均±標準偏差 (SD) によって分析されました。 一元配置分散分析検定は、各情報セット間の差異を測定するために使用されます。 0.05 未満の P 値は統計的に有意であるとみなされます。
結果
フェノール化合物
この実験の目的は、抽出に使用した溶媒の有効性を測定することと、フェノール化合物を可能な限り抽出できる方法を測定することでした。 ほとんどのフェノール化合物は、水、メタノール (MeOH)、エタノール (EtOH)、アセトン、酢酸エチル、プロパノール、酢酸、またはそれらの混合物などの高極性溶液をさまざまな量に分けて抽出すると、非常によく溶解します [11]。 図 1A は、W60 がフェノール化合物を 16.24 μg/ml まで抽出でき、続いて M60、E4、および MW24 が総フェノール 13.89、9.21、および 8.38 μg/ml であることを示しています。 SBPの細胞毒性は、細胞毒性効果にアクセスするためにホルマザン形成を測定することによって生細胞のミトコンドリア機能から還元環境を測定するMTT還元アッセイによって実験されました。 その結果、48時間のインキュベーションで指定された濃度(最大500μg/ml)のSBPが得られることがわかりました。 細胞毒性は、SBP 処理後に有意な影響を示さなかった (図 1B)。
B16F10細胞の酵素活性とメラニン含有量に対するSBPの影響
SBPのメラニン形成抑制を試験するための最初のステップは、市販の美白剤であるコウジ酸と比較したキノコチロシナーゼ酵素阻害能力を試験することであった。 SBP (MW24) は、同じ濃度 (100-500 μg/ml) のコウジ酸や他の抽出物よりも高い有効性を持っています。 図 1C に示すように、MW24 のチロシナーゼ阻害率は最も高く (66.39-77.05 パーセント)、コウジ酸のチロシナーゼ阻害率は 44.68-59.93 パーセントのみです。 それ以降、B16F10 細胞からのメラニン生成による抗メラニン生成測定には、チロシナーゼ阻害率が最も高い MW24 が選択されました。 B16F10 細胞のメラニン含有量は、SBP (MW24) 処理後に減少しました (図 2A)。 B16F10細胞のメラニン含有量は、-MSHで刺激しSBP(MW24)で24時間処理した後、図2Bに示すように用量依存的に大幅に減少した。
チロシナーゼおよびMITFのタンパク質発現レベルに対するSBP（M24）の影響
SBP (MW24) で 24 時間処理した後のタンパク質発現レベルを測定することにより、チロシナーゼおよび MITF 活性についてウェスタンブロット分析を使用しました。 TRP-1、TRP-2などのメラニン生成酵素の制御は、MITFとチロシナーゼタンパク質レベルの転写効果によって生じました。 結果は、図 3 に示すように、SBP (MW24) がチロシナーゼと MITF タンパク質発現の両方を用量依存的に下方制御できることを示しています。
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) シグナル伝達経路を介したメラニン生成阻害に対する SBP (M24) の効果
メラニン生成では、MAPK キナーゼファミリー、特に ERK と p38 がこの手順に直接関係しています [12]。 メラニン生成の発生中に、ERK シグナル伝達は下方制御され、p38 シグナル伝達は上方制御されます。 ただし、ERK と p38 のリン酸化では、メラニン生成とは逆の手順が行われます。 結果は、MAPK シグナル伝達経路に対する免疫ブロッティングによって活性化された -MSH による SBP (MW24) 処理後の明らかな効果を示しました。 SBP (MW24) は、p38 タンパク質発現をわずかに減少させ、p38 のリン酸化を上方制御します。 この結果は、ERKには影響を与えずにp38経路を介してメラニン生成プロセスを阻害する方法を示しましたが、図4に示すように、-MSHおよびSBP（MW24）処理後にERKタンパク質レベルのリン酸化がわずかに減少しました。
議論
シュクリエ バナナの皮は、多くの有効成分物質、特に植物が自己防衛機構のために作り出す二次代謝産物であるフェノール化合物とカロテノイドのグループを豊富に含む農業廃棄物です [7]。 これらの物質は、ほぼすべての植物の葉、樹皮、果実、皮、種子に含まれています。 フェノール化合物とカロテノイドは、人間の健康に良い特性を持つ植物化学物質です。 これらの物質には、抗炎症作用、抗ウイルス作用、鎮痛作用、抗酸化作用、抗発がん性作用などが含まれます[13]。 一般に、フェノール化合物は高極性溶媒によく溶解します。 実験では、Folin-Cicualteu アッセイからの抽出手順により、MW24 の抽出でフェノール化合物を最も多く抽出できるはずです。 手順における溶媒の最終混合比に応じて、低極性化合物が最初に抽出され、次に高極性物質が抽出されます。 結果は、おそらくフェノール化合物を抽出するのに適切な温度である摂氏 60 度の温度のせいで、W60 がフェノール化合物を最も多く抽出できることを示しています [11]。 また、SBP には水によく溶ける高極性物質が含まれている可能性があると考えられます。 図 1A に示すように総フェノール化合物の量を比較すると、W60、M60、E4、および MW24 が物質の溶解性の可能性を顕著に示しました。
フェノール化合物の総量がわかったら、フラボノイドおよびカロテノイド物質の種類と量を正確に特定することができます。 SBP (MW24) 抽出物にはフェルラ酸が 906.62 mg/100g も含まれていることがわかり、カロテノイド群に分類される少量のルテインとβカロテンもそれぞれ 1.23 mg/100 g と 2.37 mg/100 g 含まれていることがわかりました。 SBD (MW24) は依然として高い割合でチロシナーゼ阻害を示します。 したがって、SBP (MW 24) がさらなる研究のために選択されました。
細胞毒性試験の結果、SBP の使用濃度は 500 μg/ml まででしたが、顕著な細胞毒性は認められませんでした。 おそらく、抽出物に含まれる少量のカロテノイドには細胞を保護する機能があるためと考えられます。 このグループの物質は、シトクロム P-450、特に反応酸素種 (ROS) と相互作用することで免疫機能を刺激する役割を持つカロテンを介して毒を止めることができる抗酸化特性を持っています。 これは、炎症性サイトカインを減少させる ROS 消去効果特性を持つフェノール化合物の有効性を裏付けるものとなります [14]。 したがって、SBD (MW24) には毒性がないだけでなく、細胞を保護する役割もあります。
私たちの研究では、SBP (MW24) が B16F10 細胞のメラニン生成を阻害する能力があることも発見しました。 チロシナーゼおよびMITFの発現は、キノコチロシナーゼおよびウェスタンブロット分析による用量依存的な方法での評価の両方において、SBP（MW24）処理後に減少した。 この試験は、SBP (MW24) が p38 シグナル伝達経路を下方制御し、p38 のリン酸化を上方制御することによってメラニンの生成を抑制し、MITF タンパク質分解を活性化し、その後チロシナーゼなどのメラニン生成酵素ファミリーの発現を減少させる効果があることを示しました。 p38 の抑制は、重要な転写因子である cAMP 応答結合タンパク質 (CREB) の機能を低下させます。CREB は、MITF 遺伝子の M-BOX に結合する PAX3 および SOX10 と連携して、メラニン生成プロセスと細胞の生存活性に影響を与える MITF タンパク質の発現を活性化する重要な転写因子です [15] ]。 一般に、ERK を活性化すると、MITF のセリン 73 がリン酸化され、ユビキチン化が起こり、最終的には分解が起こります。 ほとんどの天然化合物は、ERK シグナル伝達経路の刺激プロセスを通じてメラニン生成を阻害できますが、SBP (MW24) は ERK シグナル伝達経路に大きな影響を与えませんでした [16]。
多くの研究では、ベータカロテンには UVB 光子を吸収する能力があり、同時に脂溶性抗酸化物質の特性もあり、フェノール化合物は Nrf2 を活性化し、ROS 受容体をブロックし、炎症を軽減することができるため、フェノール化合物とカロテノイドがメラニン色素の生成を抑制できることが判明しました。これは私たちの研究を裏付けるものですが、メラニン生成阻害とは異なる方法で行われます[17]。 SBP (MW24) に含まれるフェルラ酸は、血管内皮増殖因子 (VEGF) の発現を調節し、一酸化窒素を誘導するため、抗メラニン形成作用があることがいくつかの研究で確認されたフェノール化合物のグループ内の主要物質であることを除けば、シンターゼは腫瘍抑制遺伝子として機能し、メラニン色素の生成過程にも関係します。 SBP (MW24) 溶液では、水溶性、脂溶性、生物学的利用能が増加し、その結果 B16F10 細胞のメラニン生成阻害が改善されるため、フェルラ酸はカロテノイドまたは他のリン脂質と混合すると有効性を高めることができます [18]。 すべての結果を総合すると、SBP (MW24) はメラニン生成を効果的に減少させることができると結論付けられます。
略語
MITF: 小眼球症関連転写因子。 -MSH: -メラノサイト刺激ホルモン; MC1R: メラノコルチン-1受容体。 TRP1: チロシナーゼ関連タンパク質 1。 TRP2: チロシナーゼ関連タンパク質 2。 MAPK: マイトジェン活性化プロテインキナーゼ。
謝辞
この研究は、Royal Golden Jubilee Ph.D.: RGJPHD からの助成金によって支援されました。 タイ。 (PH.D./0017/2558)。
著者の寄稿
RH、KT、KS、UP が実験を考案し、設計しました。 RHCHL と MC は実験を実施しました。 RH、MC、CHL はデータを分析しました。 RH は試薬/材料/分析ツールを提供しました。 RH と CHL が論文を書きました。
競合する利益
著者らは、競合する利益は存在しないと宣言しています。
参考文献
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