TRP-1とMMPの阻害による皮膚の美白としわ防止に対するSargassumThunbergii抽出物の効果
Mar 21, 2022
連絡先：ali.ma@wecistanche.com
Da-Hye Gam 1、Jae-Hyun Park 1、Ji-Woo Hong 1、Seong-Jin Jeon 1、Jun-Hee Kim 1、Jin-Woo Kim 1,2、*
概要： Sargassum thunbergii伝統的に、食用および医薬品の原産国として使用されてきました。 しかし美白としわ防止S.thunbergiiの影響はまだ調査されていません。 この研究は、S。thunbergiiで超音波支援抽出（UAE）を使用して、抗酸化活性と美白および抗しわ効果を備えた生物活性化合物の生成に最適な抽出条件を確立するために実施されました。 抽出時間（5.3 0〜18.7分）、抽出温度（22.4〜79.6°C）、およびエタノール濃度（0。0〜99.5パーセント）。これらは、 UAEは、中央の複合設計を使用して最適化されました。 二次回帰方程式は実験データに基づいて導き出され、高い決定係数（R2> 0。85）を示し、予測への適合性を示しています。 ラジカル消去活性（RSA）、チロシナーゼ阻害活性（TIA）、コラゲナーゼ阻害活性（CIA）など、すべての従属変数を最大化するための最適なUAE条件は、抽出時間12.0分、抽出温度65.2°C、エタノールとして特定されました。 53.5パーセントの。 これらの条件下で、S。thunbergii抽出物のRSA、TIA、およびCIAは、それぞれ86。5パーセント、88.3パーセント、および91.4パーセントでした。 また、S。thunbergii抽出物が、メラニン合成とコラーゲン加水分解の主な遺伝子であるチロシナーゼ関連タンパク質-1、マトリックスメタロプロテイナーゼ-1、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-9のmRNA発現に阻害効果があることを確認しました。 。 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析を使用して、S。thunbergii抽出物中の主要なフェノール化合物を特定し、コーヒー酸を主要なピークとして特定しました。美白としわ防止効果はユキヤナギから生成され、化粧品の開発に使用できます。
キーワード： S. thunbergii; 最適化;美白; しわ防止; TRP -1; MMP -1; MMP -9
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1.はじめに
メラニン生成は、メラニン色素の合成につながる生理学的プロセスです[1]。 メラニンは、表皮の基底層に存在するメラノサイトから分泌される黒色または茶色の色素であり、皮膚、目、髪の色を決定します[2]。ただし、メラニン色素の過剰な生成は、悪性などの色素沈着過剰関連疾患につながる可能性がありますメラノーマ[3]。 テーマラニン生合成経路の主要酵素であるチロシナーゼは、L-チロシンのL-DOPA（L -3、4-ジヒドロキシフェニルアラニン）へのヒドロキシル化を促進し、次にL-DOPAのドーパクロムとドーパキノンへの酸化を促進します。いくつかの段階を経て、チロシナーゼ関連タンパク質（TRP -1および2）による自動酸化プロセスを通じてメラニンを合成します[4–6]。 今日まで、チロシナーゼ関連タンパク質を阻害することによってメラニン形成を阻害する方法は、美白剤の開発のために化粧品業界で広く使用されてきました[7,8]。 ただし、従来使用されていたコウジ酸、アゼライン酸、ハイドロキノン美白成分は、アレルギーを誘発するだけでなく、皮膚毒性や癌を引き起こすことが報告されています[9]。 したがって、天然成分をベースにした、より安全で効果的な美白剤の製造が不可欠であると考えられています[10]。
コラーゲンは細胞外マトリックス（ECM）タンパク質であり、肌に力と緊張を与えることで肌を保護します。 また、しわや水分の損失を防ぐことにより、老化プロセスを遅らせるのに役立ちます。 ECMはマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）によって分解されます[11]。 一般にコラゲナーゼとして知られているMMP-1は、皮膚を構成する1型コラーゲンを部分的に分解しますが、ゼラチナーゼとして知られているMMP -9は、MMP-1[12]によって加水分解されたコラーゲンをさらに解重合します。 さらに、活性酸素種（ROS）によって誘発される酸化ストレスがこれらの酵素の合成を促進し、ECMの分解を引き起こし、最終的にはしわの形成を引き起こすことが報告されています[13]。 したがって、TRPやMMPの発現を抑制し、活性酸素種を除去して皮膚の色素沈着やしわを減らし、皮膚の老化を防ぐことができる酸化防止剤を含む天然成分を見つける必要があります[14]。 最近では、主に陸上植物で化粧品の機能性成分が開発されているため、新種の探索や天然成分の安定供給に限界が出てきています[15]。 その結果、海洋植物由来の天然成分への関心と需要が高まり、海洋資源からさまざまな新しい成分が特定されています[16]。
Sargassum thunbergiiは海藻科に属する茶色の大型藻類の一種であり、韓国と中国の海岸に自生しています[17]。 溶存酸素を枯渇させることで海藻や養魚場に被害を与える海洋汚染物質として認識されています[18]。そのうちのいくつかは、従来の治療法の駆虫薬や堆肥として使用されています[19]。 1995年に抽出。 それ以来、新しい生物活性化合物の製造に使用される可能性が高い大型藻類として注目を集めています[20]。 機械的排出、超臨界抽出、マイクロ波抽出、超高圧抽出などの従来のプロセスを使用した生物活性化合物の抽出は、過剰な溶媒を使用する必要性、低い抽出収率、高いエネルギー消費などの制限に関連しています[21]。 新しい抽出方法の開発は、大型藻類から生物活性化合物を確保するための技術革新における主要な課題の1つです[22]。 従来の抽出プロセスの中で、超音波支援抽出（UAE）は、そのシンプルさ、装置コストの低さ、さまざまなマトリックスからの抽出収率の高さ、エネルギー消費量の少なさ、必要な溶媒の量の少なさ、時間の短縮により、特に魅力的です[23]。 UAEは、20〜100kHzの高周波音波を含むことが知られています[24]。 超音波を使用して抽出収率が向上します。これは、植物組織の破壊、粒子サイズの減少、および繰り返しの音響キャビテーションによって生成される気泡の崩壊によって引き起こされる溶媒への抽出物の物質移動の増加に起因します[25,26]。 。 これらの利点により、UAEは、陸生および水生バイオマスから機能性成分を抽出するために食品業界で広く使用されている、安価で再生可能で効率的なプロセスとして認識されています[27]。
したがって、この研究では、UAEを適用してS. thunbergiiから生物活性化合物を抽出し、抗酸化剤の最大抽出を可能にする最適なUAE条件を導き出しました。美白統計に基づいた最適化を使用した抗しわ成分、およびS. thunbergii抽出物によるTRP-1、MMP -1、およびMMP-9遺伝子発現のさまざまな阻害効果を評価して皮膚を検証しました-美白としわ防止誘導された生物活性化合物の効果と機能的な化粧品成分としてS.thunbergii抽出物を利用する可能性を確認します。
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2.結果と考察
2.1。 実験計画法
モデルのフィッティングは、のラジカルスカベンジング活性（RSA）、チロシナーゼ阻害活性（TIA）、およびコラゲナーゼ阻害活性（CIA）を予測するための応答曲面法（RSM）数学モデルの精度を解釈するために重要です。S. thunbergiiエキス。 RSMの中央複合設計（CCD）は、独立して、または応答に影響を与える2つの独立変数の相互作用によって生成された応答曲面を統計的に分析する実験計画法です。 CCDには、中心点と複数の軸点を使用して曲率を効果的に推定し、最適な条件を予測できるという利点があります[28–30]。 この研究では、CCDを適用して、S。thunbergiiextractのRSA、TIA、CIAなどの応答を最大化するための最適なUAE条件を予測しました。 5つのレベル（-、-1、0、1、）がコード化され、CCDのベースとして17回の実験が実行されました（表1）。 以前の研究に基づいて、抽出時間（5.30〜18.7分）、抽出温度（22.4〜79.6°C）、エタノール濃度（0〜99.5パーセント）を含む3つの主要な独立変数を選択して、従属変数の最大レベルを取得しました。 [31]。 二次回帰モデルの開発では、実験変数は次の式に従ってコード化されました。
xi {{0}}（Xi − X0）/ ∆X（1）
ここで、xiisは変数Xiのコード化された値です。 X 0は中心点でのXの値であり、∆Xはステップ変化の値です。
抽出時間、抽出温度、エタノール濃度が異なる17の条件の実験値を表2に示します。
2.2。 RSAに対するUAE条件の影響
の抽出に適用される17の条件によるとS. thunbergiiUAEを使用すると、RSAは2.37〜89.9パーセントで、最大値は12。0分の抽出時間、51。0◦Cの抽出温度、および50でした。{{11} }パーセントエタノール濃度および12.0分の抽出時間、51。0◦C抽出温度、および99.5パーセントエタノール濃度での最小値。 これは、エタノール濃度がRSAに最大の影響を及ぼしたことを示しています（表2）。 Design-Expertソフトウェアによって提案されたように、2次回帰方程式が選択され、3つの独立変数と応答すべてに適合されました。 コード化された値に関して、RSA、TIA、およびCIAの予測応答は、重回帰分析による2次回帰方程式を使用して表すことができます（表3）。 CCDモデル係数は、表4に要約されている2次回帰モデルの応答変数の分散分析（ANOVA）を使用して検証されました。実験値と予測値の一致を表す決定係数（R2）が1に近い場合、それは次のようになります。許容できる適合度[32]。 RSAを使用して最適なUAE条件を予測するための2次回帰式のR2は0.8554であり、結果の予測値の85.5％以上を完全に説明できることを確立し、2次回帰式の適合性を認識しています（表3）。
各モデル変数の有意性は、p値を使用して決定されました。 p値の<0.05 indicates="" significance="" whereas="" a="" p-value="" of="">0。05は、RSA[33]での重要性がないことを示します。 最適化研究のANOVAの結果は、モデルが有意であったことを示し（p=0 .0283）、これは設定された有意水準よりも低く、有意性が5％以内で認識されたことを示しています。 したがって、結果は、独立変数がここに示されている範囲内にある場合、モデルがS. thunbergii抽出物のRSA、TIA、およびCIAを効率的に予測できることを示しています。 各独立変数の重要性を確認したところ、エタノール濃度がRSA（p=0。0025）に最も影響を及ぼしたのに対し、抽出時間（p=0。7418）と温度（p=0。1622）は重要ではありませんでした（表4）。
各独立変数の従属変数への影響を評価するために、抽出時間、抽出温度、およびエタノール濃度に応じたRSAの変化を摂動プロットとして表現しました（図1A）。
その結果、最高値は抽出時間の14.1分で現れ、その後減少しました。 最大値は、抽出温度とエタノール濃度でそれぞれ60.7°Cと46.2％で確認されました。 ただし、3次元応答表面曲線を使用して変数間の相互作用によるRSAの変化率を視覚化すると、抽出時間と温度の変化はRSAにほとんど影響しませんでしたが、エタノール濃度は大きな影響を及ぼしました（図2A、B）。
これは、キムらによる研究の結果と同様でした。 アマチャヅル抽出物のRSAに対する溶媒濃度の影響を特定する[34]。 RSAは最大値まで増加し、その後エタノール濃度とともに減少する傾向があり、エタノール濃度の48.1パーセントで最大値を示しました。 蒸留水とエタノールの混合による抽出液の極性変化は、Gの抗酸化作用の増加につながります。 アマチャヅルとユキヤナギの抽出物。 さらに、これは、藻類からの熱水抽出によって生成された水溶性生物活性化合物がより低い抗酸化活性を示し、50％エタノールを使用する抽出物がより高い抗酸化活性を示したことを報告する結果と一致しており、二成分溶媒（水およびエタノール）生物活性化合物を生成することは、抽出収率を高めるのに有益です[35,36]。
2.3。 TIAに対するUAE条件の影響
のTIAS. thunbergii実験に適用された17のUAE条件に従った抽出物を表2に示します。92.6パーセントの最大TIA値は、12。0分、79.6度、および50で特定されました。{{13} }パーセントおよび最小値55.3パーセントは、抽出の12。0分、51。0度、および0。{{20}}パーセントで予測されました。それぞれ、時間、抽出温度、およびエタノール濃度。 その結果、抽出温度とエタノール濃度がTIAに大きな影響を与えることが確認されました。 実験結果に基づいて、CCDを使用して二次回帰式を導き出し、それを使用して最適なUAE条件を予測しました（表3）。 R2は0.8591であり、予測モデルと実験データの値が85.91％一致していることを示しており、2次回帰方程式がTIA予測に適していることを示しています。 RSA、TIA、およびCIAの応答では、計算されたF値が表形式のF値よりも大きく、確率値が低い場合（p <0.001）、モデルは非常に有意でした。 これは、各応答モデルの個々の項が交互作用効果の観点から有意であったことを示しています[37]。="" 二次回帰方程式の有意な効果を統計的に評価するために、anovaが適用されました。="" 実験モデルは有意であり（p="">
他の変数の値を固定するときに単一の変数の変化に伴うTIAの変化率を視覚化すると、エタノール濃度によるTIAの変動が最大で、最大TIAは76.8％のエタノール濃度で見つかりました（図1B）。 独立変数の相互作用は、2つの変数を同時に変更することにより、3次元応答面曲線を使用して視覚化されます（図3）。
抽出温度と時間が増加すると、TIAは最初に増加します。 ただし、変動範囲は大きくないため、ANOVAを使用して決定した場合、抽出温度と時間の相互作用効果は重要ではないことを再確認しました（図3A）。 逆に、TIAはエタノール濃度とともに増加および減少し、最大TIAは75.6パーセントのエタノール濃度であると予測されました（図3B）。 この結果は、ワイルドライス抽出物からの生物活性化合物の抽出において、70〜80パーセントのエタノール濃度が水よりも高いTIAをもたらすことを示したParkらによる研究の結果と一致しています[38]。 その研究は、エタノール濃度がTIAの主要な変数であり、エタノール濃度に比例して変化する傾向があることを報告しました。
2.4。 CIAに対するUAE条件の影響
17の条件のそれぞれでCIAを測定したところ、最大CIA値は16。0分、63。0度、および80で92.3パーセントであることがわかりました。{{ 12}}パーセント、最小CIAは12。0分、51。0度、0。0パーセントの抽出時間、抽出温度、それぞれ、エタノール濃度（表2）。 抽出時間、温度、およびエタノール濃度に従って生成された2次回帰方程式のR2は0.9237でした。これは、92.37％のサンプル変動が独立変数に起因することを意味し、全変動の7.63％のみがモデル（表3）。 これは、CIAの予測値と実験値の間に良好な相関関係があることを示しており、実験モデルの予測におけるその適合性を認識しています[39]。 ANOVAは、1％の有意水準を下回る統計的有意性（p=0。0037）を示し、抽出温度（p=0。0030）とエタノール濃度（p=0。0006）を確認しました。線形項の中には、CIAに大きな影響を与える独立変数がありました（表4）。
CIAに対する各独立変数の影響を評価するために、摂動プロットを使用してCIAを1つの変数の変化と比較しました（図1C）。 独立変数が増加すると、CIAは最初に最大値まで増加し、エタノール濃度が最も影響力があることがわかりました。 三次元応答曲面曲線は、独立変数の相互作用効果によるCIAの変化を表しており、抽出時間とエタノール濃度とともに増減する傾向がありました。 CIAは、抽出時間とエタノール濃度の増加とともに増加し、抽出時間の12.1分と73.6パーセントのエタノール濃度で最大CIAを示しました。 一定の抽出時間での抽出温度とエタノール濃度によるCIAの変化も同じ傾向がありました。 ただし、エタノール濃度によるCIAの変動は、より重要であることが確認されました（図4B）。
CCDによって予測されたCIAの最大値は93.8パーセントで、抽出時間は14.5分、抽出温度は65.1℃、エタノール濃度は69.3パーセントでした。 これは、以前の研究で見つかった緑茶と白茶熱水抽出物のCIAの39.4パーセントと40.3パーセントの2倍以上でした[40]。 結論として、S. thunbergii抽出物は、コラゲナーゼの活性を抑制するため、しわを減らすための機能的な化粧品成分として利用できると考えられていました。
2.5。 UAEプロセスの最適化
の抽出に最適なUAE条件を特定するには美白S. thunbergii抽出物からの抗しわ生物活性化合物について、RSA、TIA、およびCIAの個々の応答曲面を重ね合わせることにより、従属変数を最大化するための最適なポイントを取得しました（図5）。
独立変数の範囲が抽出時間5.30〜18.7分、抽出温度22.4〜79.6°C、エタノール濃度0〜99.5％に制限されている場合、最適なUAE条件が予測されました。抽出時間は12.0分、抽出温度は65.2°C、エタノール濃度は53.5％です。 最適なUAE条件は、抽出時間を最小限に抑えるという基準に基づいて導き出されました。これは、プロセス時間が短いことがプロセスコストの削減に役立つためです。 導出された最適なUAE条件の下で、RSA、TIA、およびCIAのそれぞれ86。5パーセント、88.3パーセント、および91.4パーセントが予測されました。 以前の研究では、元等。 S. thunbergiiからの生物活性化合物の抽出に最適な条件は、液体と固体の比率が120 mL / g、抽出時間が210分、抽出温度が97°Cであると報告されています[41]。 元ら。 生物活性化合物の抽出のための熱水抽出条件を最適化し、本研究では、生物活性化合物の抽出のためのUAE条件を最適化しました。 したがって、短い抽出時間と低温下でのUAE条件は、以前の熱水抽出プロセスと比較して、生物活性化合物の効果的な抽出プロセスであることが証明されました。
結果を検証するために、CCDモデルによって予測された最適条件で3回の繰り返しで確認実験を実施しました。 RSA、TIA、CIAの実験値を最適な条件で評価したところ、それぞれ88.9％±3.11％、85.1％±2.76％、89.7％±4。0 9％であり、予測モデル値との強い一致（p> 0.05）。 したがって、実験値は予測値とよく一致しており、UAE最適化結果の信頼性が証明されています。
2.6。 TRP -1、MMP -1、およびMMP-9のmRNA発現
TRP -1は5、6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸オキシダーゼとして機能します。これは、上皮細胞におけるチロシナーゼ刺激とユーメラニン合成によって作用する皮膚色素沈着の主な原因であることが知られています[42]。 対照的に、MMP-1とMMP-9は、真皮層の90％を占めるタイプ1コラーゲンを分解し、それによってコラーゲンの分解、弾力性の喪失、皮膚の老化を引き起こします[43]。
この研究では、S. thunbergii抽出物は、統計に基づいた最適化によって確立された最適なUAE条件を使用して生成され、抽出物はB{{0}}F0細胞株でテストされて評価されました。美白としわ防止TRP {{0}}、MMP -1、およびMMP-9のRNA発現レベルを比較することによるプロパティ。 メラニン合成に関連する主要な遺伝子であるTRP-1の発現レベルは、濃度依存性であることがわかった。 thunbergii抽出物であり、1および2 mg / mLの抽出物で処理した後、対照群と比較して有意に減少しました（p <>
また、MMP{{{{1 0}}}}およびMMP-9の発現は、ユキヤナギ抽出物の濃度に比例して減少することもわかりました（図6B、C）。 特に、MMP-1とMMP-9の発現レベルは、対照群と比較して、2 mg / mLのユキヤナギ抽出物で処理した群でそれぞれ58.6％と78.8％阻害されました（p < 0.05）。="" 上記の結果から、最適なuae条件下で生産されたs.="" thunbergii抽出物は、trp="" -1、mmp="" -1、およびmmp="" -9inb16-のmrna発現を効果的に阻害できることが確認されました。="">
2.7。 S.thunbergii抽出物中のコーヒー酸の同定
以前の実験では、UAEは抗酸化物質、美白、およびしわ防止S.thunbergii抽出物の効果が最適化されました。 ただし、抽出物中の生物活性成分を調査するには、さらなる研究が必要でした。 したがって、からのフェノール化合物S. thunbergii抽出物は、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS / MS）を使用して同定されました。これは、このテクノロジーにより、構造特性を備えたフェノール化合物の正確な同定と、天然源中の小分子の検出が可能になるためです。 ピークの同定は、リテンションタイム（RT）、プリカーサーイオン、および標準の関連するフラグメントイオンに基づいていました。 LC-MS / MSシステムでは、コーヒー酸はRTの1.95分にピークを示しました（図7）。
負イオンモードでは、マススペクトルの2つのイオンピークの1つを示したm / z 179.10イオンは、コーヒー酸の分子式に対応し、m /z135.56のフラグメントイオンを分離します。 一般に、衝突によって誘発された解離後、フェノール化合物は、カルボン酸基からのCO2（44 Da）の損失を特徴とするフラグメントイオンを生成します。 この損失のために、m /z179.10でのイオンからの44-DaCO2のその後の開裂により、m /z135.56でイオンが得られました。 コーヒー酸は、二次代謝のシキミ酸経路を介して植物によってフェニルアラニンまたはチロシンから生成されるC 6- C3フェノール化合物であり、桂皮酸（またはフェニルプロパノイド）クラスの代表的なものです。 それはいくつかの野菜や果物を通して人間の食事に入ります[44]。 近年、多くの研究により、コーヒー酸の摂取は、酸化ストレスに関連するさまざまな病気の予防に役立つ抗酸化作用により、多くの健康上の利点があることが示されています[45]。 したがって、フェノール化合物に関するこの研究は非常に有用であり、品質管理プロセスおよび将来のS.thunbergiiasの成分の探索において重要な役割を果たす可能性があります。美白としわ防止プロパティ。
3.材料と方法
3.1。 材料と試薬
S. thunbergii2 0 19年10月に韓国の済州島の南海岸から収集され、パラ済州（韓国の済州）で購入されました。 実験の前に、S。thunbergiiをグラインダー（HMF -3000 S、Hanil Co.、Wonju、Korea）を使用して0。42 mm未満で粉末化し、-5°Cの冷蔵庫に保管しました。 溶媒抽出用のエタノールは、SamchunChemical Co.（95.0 v / vパーセント、Pyungtaek、韓国）から購入しました。 対照試験の標準として使用されるアスコルビン酸（ビタミンC）、アルブチン、およびコジン酸は、Sigma-Aldrich Co.、Ltd.（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 この実験で使用された他のすべての化学物質は分析グレードでした。
3.2。 UAEプロセス
サンプルの乾燥粉末（1 g）を、1 0 mLの溶媒とともに圧力容器（XF1 0 0、AntonPaar Co.、Ltd.、グラーツ、オーストリア）に入れました。ボルテックスミキサー（VM -10、Daihan sci。Co.、Wonju、Korea）を使用して1分間混合しました。 これらのサンプルは、CCDから得られた17の個別のUAE条件下で、抽出時間5.30〜18.7分、抽出温度22.4〜79.6°C、エタノール濃度0.0〜99.5％で抽出されました。 UAEは、デジタルタイマーと温度コントローラーを備えた電力200 W、周波数40 kHzの超音波装置（SD-D250H、城東区、ソウル、韓国）を使用して実施されました。 抽出後、遠心分離機（1236R、Labogene Co.、大田、韓国）を使用して、上清を10、000rpmで10分間分離しました。 次に、溶液を多孔度0.45 µmの酢酸セルロースディスクフィルターでろ過し、RSA、TIA、およびCIA分析に使用しました（図8）。
3.3。 実験計画
Design-Expertソフトウェア（Ver。8. 0、Stat-Ease、ミネソタ州ミネアポリス、米国）を使用して、S. thunbergiiCCDを使用したUAE条件の最適化を通じて。 独立変数として、抽出時間（X1）、抽出温度（X2）、エタノール濃度（X3）などの主要な変数を選択し、5（-1.68、-1、0、1、1.68）レベルにコード化しました。 、表1に示すように、RSA、TIA、およびCIAは、主要な独立変数の影響を受ける従属変数として設定されました。実験値は、CCDによって生成された17の条件下で取得され、各独立変数と従属変数の相関は、2次回帰方程式を使用して定量化されました。 [46]。 次の2次回帰方程式を使用して、独立変数の変化に応じて従属変数の値を計算しました。
Y = β0 + k ∑ i = 1 βiXi + k ∑ i = 1 βiiX 2 i + k ∑ i>1 ijXiXj（2）
ここで、Yは従属変数（RSA、TIA、CIA）を表し、0は定数係数、kはテスト変数です。 i、ii、およびijは、それぞれ線形、2次、および交互作用項の回帰係数です。
独立変数の予測モデルを評価するために、95％の信頼水準で分散分析（ANOVA）を実行して、抽出温度、時間、エタノール濃度などの各変数の効果を評価しました。 さらに、回帰モデルのp値である回帰係数（R2）を使用して、回帰モデルの適合性を決定しました[47]。
3.4。 ラジカルスカベンジング活性（RSA）アッセイ
の抗酸化作用S. thunbergii抽出物は、1、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH、Sigma-Aldrich）フリーラジカルに対する除去活性に基づいて、修正DPPHアッセイを使用して評価されました[48]。 0。1MDPPHをメタノールで溶解してストック溶液を調製し、室温で保存しました。 メタノールで希釈したDPPH溶液は、UV-visspectrophotometer（Optizen 2120UV、Mecasys、Daejeon、Korea）を使用して、517nmで1。0±0。02の吸光度が得られるように調製しました。 。 DPPH溶液の1.25mLアリコートを0.25mLの希釈S.thunbergii抽出物（50〜500 mg / mL）と混合し、室温で暗所で20分間静置しました。 吸光度の変化を517nmでモニターし、RSAを次の式を使用して計算しました。
RSA（パーセント）= {1 −Abs（サンプル）/ Abs（コントロール）}×100（3）
ここで、Abs（コントロール）はコントロールの吸光度であり、Abs（サンプル）は抽出物の吸光度です。 同じ濃度のアスコルビン酸（50〜500 mg / mL）を陽性対照として使用しました。
3.5。 チロシナーゼ阻害活性（TIA）アッセイ
TIAは、八木[49]によって報告された方法に従って測定されました。 反応混合物には、0 .4 mLのリン酸ナトリウム緩衝液（67 mM、pH 6.8）、0。2mLの10 mM3、{{10}}が含まれていました。ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA、Sigma-Aldrich）、0.2 mLのキノコチロシナーゼ（125 unit / mL、Sigma-Aldrich）、および0.2mLの抽出液。 反応は25℃で30分間行った。 反応後、475 nmで吸光度を測定し、結果をコントロールと比較しました。 TIAは、次の式に従って計算されました。
TIA（パーセント）= {1 −Abs（サンプル）/ Abs（コントロール）}×100（4）
ここで、Abs（コントロール）はコントロールの吸光度であり、Abs（サンプル）は抽出物の吸光度です。
cistancheはチロシナーゼ活性を低下させます
3.6。 コラーゲン酵素阻害活性（CIA）アッセイ
CIAアッセイは、WünschandHeindrich[50]によって報告された方法に従って実行されました。 コラゲナーゼ（0。2 mg / mL、Sigma-Aldrich）を0。1 M Tris–HCl（pH 7.5）に溶解しました。 基質4-フェニルアゾベンジルオキシカルボニル-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg（0。4 mg / mL、Sigma-Aldrich）を0。1 M Tris–HClに溶解しました。 （pH 7.5）4mMCaCl2を含みます。 コラーゲン加水分解を評価するための反応混合物には、コラゲナーゼ（75 µL）、サンプル（50 µL）、および基質溶液（125 µL）が含まれていました。 対照群では、抽出物の代わりに50 µLの蒸留水を反応混合物に添加しました。 混合物を37℃で30分間インキュベートし、酵素反応を停止させるために0.25mLの25mMクエン酸を添加しました。 酢酸エチルと混合した後、上澄みを分離し、320nmで吸光度を測定した。 阻害のパーセンテージは、以下の式に従って計算された：
CIA（パーセント）= {1-Abs（サンプル）/ Abs（コントロール）}×100（5）
ここで、Abs（コントロール）はコントロールの吸光度であり、Abs（サンプル）は抽出物の吸光度です。
3.7。 モデルの検証
アラブ首長国連邦の最適化された条件（抽出時間、抽出温度、およびエタノール濃度）は、抗酸化活性のinvitro評価で検証されました。美白、およびCCDから得られた値に応じた抗しわ効果（RSA、TIA、およびCIA）。 すべての応答は、UAEの最適化された条件下で再度決定されました。 実験値は、その妥当性を評価するために、モデルによって予測された値と比較されました。 LC-MS / MS分析は、最適な条件下で生成された抽出物に対して実行され、S. thunbergiiエキス。
3.8。 細胞培養
B {{0}} F0メラノーマ細胞は、Korean Cell Line Bank Co.（KCLB、Seoul、Korea）から購入し、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco BRL Co.、Ltd.、Gaithersburg）で培養しました。 、MD、USA）10％ウシ胎児血清、および1％ペニシリン（Thermo Fisher Sci。Inc.、Waltham、MA、USA）を含む含有量。 細胞を37°Cで5％CO2（MCO -5 AC、Sanyo Co.、Ltd.、Tokyo、Japan）とインキュベートし、25cm2の培養フラスコで単層として増殖させました。 細胞株が約80％のコンフルエンスに達したとき、細胞の適切な成長と健康を確保するために、トリプシン-EDTAで処理して単一細胞を得ることにより継代培養を行いました。
3.9。 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
RT-PCRを実行するために、1。0×106セルを24-ウェルプレートのウェルごとにプレーティングしました。 TotalRNAは、AccuPrepユニバーサルRNA抽出キット（BioneerCo。、Daejeon、Korea）を使用して細胞から抽出しました。 amfiRivert cDNA合成プラチナマスターミックス（GenDEPOTCo。、TX、USA）を使用して、0.5 µgのトータルRNAforcDNA合成で逆転写を行いました。 cDNAは、TRP -1、MMP -1、MMP -9、-アクチンなどの各プライマーで増幅されました（表5）。 PCRは、1 µLのcDNA、10 µLTaq Premix（Genet bio、大田、韓国）、および9 µLのジエチルピロカルボナート（DEPC）を含む20 µLの容量で実施しました。 PCR条件は次のとおりです。94°Cで5分間、続いて95°Cで5秒間、60°Cで31秒間（TRP -1の場合）、または55°Cで30秒間（MMP {の場合）25サイクル{26}}）または59◦Cで30秒間（MMP -9の場合）、72◦Cで30秒間の延長。 各PCR産物を1％アガロースゲルで電気泳動し、Gel Doc TM XR plusシステムと数量1ソフトウェア（Bio-Rad Co.、Hercules、CA、USA）を使用して視覚化しました。 ハウスキーピング遺伝子としての-アクチンは、TRP -1、MMP -1、およびMMP-9の発現レベルを正規化するために使用されました。
3.10。 LC-MS/MS分析
S. thunbergii抽出物のクロマトグラフィー分離は、Finni gan Surveyor Plus HPLCシステム（Thermo Electron Corporation、サンノゼ）を使用して実施しました。 分離は、0。1のグラジエント溶出を使用しながら、カラム長15 0 mm、内径3 mm、粒子サイズ3 µmのROC C18カラム（RESTEK Co.、Bellefonte、PA、USA）を使用して達成しました。次のように、0。2 mL / minの流量での水中のパーセントフォルム酸（移動相A）および0。1パーセントのアセトニトリル中のホルミン酸（移動相B）：5パーセントから100％移動相Bで11分間、100％から5％移動相Bで4分間、37％移動相Bで2分間、37％から10％移動相Bで0.1分間、10％移動相Bで2.4分間。 注入量は10µLで、カラムは30°Cに維持されました。 質量分析実験は、Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra EMRトリプル四重極質量分析計（Thermo Fisher Sci。Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して実施しました。 S. thunbergii抽出物は、特にターボイオンスプレーモードを利用したエレクトロスプレーイオン化（ESI）を使用した負イオンエレクトロスプレーイオン化によって分析されました。 ネガティブモードでのS.thunbergii抽出のイオン化のESIソース設定は、次のとおりです。ガス温度、270°C、ガス流量、19 L / min、 シースガス温度、400°C; シースガス流量、10 L / min; キャピラリー電圧、3000 V; ノズル電圧、1000V。質量スペクトルは、衝突ガスとして窒素を使用して、100〜500 m/zの負イオンモードで記録されました。 の主成分の分析S. thunbergii得られたLC-MS/MS結果の分子イオンとフラグメンテーションパターンを、文献のデータおよび標準化合物のマスライブラリと比較することにより、抽出を行いました。
4.結論
この研究では、抗酸化剤を最大化できるUAEプロセスの最適条件を提案しました。美白、 としわ防止ユキヤナギからの付加価値のある生物活性化合物の生産への影響。これは、東南アジアの亜熱帯沿岸に広まり、海洋汚染と生態系の乱れを引き起こします。 UAEの最適化を実行する上で最も影響力のある変数はエタノール濃度でした。これにより、水とエタノールからなる二成分溶媒の使用と濃度決定がUAEで重要な考慮事項であることが確認されました。 RSA、TIA、およびCIAを同時に最適化するために各応答面を重ね合わせると、抽出時間は12. 0分、抽出温度は65.2°C、エタノール濃度は53.5％と予測され、この条件下でRSAが使用されました。 86。5パーセントの値、88.3パーセントのTIA値、および91.4パーセントのCIA値が識別されました。
最適なUAE条件下で生産されたS.thunbergii抽出物を使用して、発現に対するTRP -1、MMP -1、およびMMP -9の効果をmRNAレベルで評価したところ、S。thunbergii抽出物であることが確認されました。 TRP -1、MMP -1、およびMMP -9のmRNAレベルを低下させ、それによってメラニン生成と皮膚コラーゲン分解を防ぐことができます。
したがって、S. thunbergii抽出物は、化粧品、食品、医薬品の機能性成分の製造において、海洋バイオマスからの新たな供給源として広く利用されることが期待されています。さらに、UAEを使用して生物活性化合物を抽出するプロセスは、プロセス開発に関する基本的なデータを提供し、 S.thunbergiiおよび他の大型藻類からの新しい機能性成分の生産における最適な抽出条件の決定。
