メタボロミクスに基づいた腎臓ヤン欠乏症のラットの生殖機能障害の治療におけるサイスタンチャーの抽出物の有効性とメカニズム
Feb 06, 2025
抽象的なこの研究は調査します生殖保護効果そしてCistanches Herba Extractの潜在的なメカニズム（che）のラットモデル腎臓陽欠乏症アデニンによって誘導されます。ラットは、通常、モデル、低用量CHE（{1}}。 mg・kg -1・d -1）。ラットは、最初の14日間、腎臓ヤン欠乏を誘導するために最初の14日間のgavageによってアデニン（200 mg・kg -1・d -1）を投与されましたが、同時に薬物治療を受けました。 14日後、モデリングは中止されましたが、薬物治療は49日間続きました。 CHEのコンポーネントの含有量は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分析されました。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットを使用して、アデニン誘発性腎臓欠乏症モデルを症状の特性評価とテストステロン（T）レベルの測定により評価しました。精巣および精巣上体への病理学的損傷は、湿重量とヘマトキシリン - エオシン（HE）染色の実行に基づいて評価されました。精子密度と運動性は、コンピューター支援精子分析（CASA）を使用して測定され、精子の生存率は生きている/死んだ精子染色キットを使用して評価され、エオシン染色を使用して精子の形態を評価し、それによってラットの精子の品質を決定しました。メタボロミCSを使用して、血清代謝産物の変化を分析し、関連する代謝経路を濃縮し、ラットの生殖機能損傷の改善におけるCHEのメカニズムを探求しました。腎臓陽欠乏症症候群。通常のグループと比較して、モデルグループは重要なものを示しました腎臓陽欠乏症の症状、Tレベルの低下、精巣および精巣上体の湿重量の減少、および精巣および精巣上体への重大な病理学的損傷。精子密度、運動性、および生存率、精子異常の速度が増加します。対照的に、CHEで治療されたラットは、腎臓ヤン欠乏症の症状の著しい改善、Tレベルの回復、精巣および精巣上体への病理学的損傷を軽減し、さまざまな精子パラメーターを改善しました。メタボロミクスの結果により、正常群とモデルグループの間で286の微分代謝産物が明らかになりました（191の上方制御および95のダウンレギュレート）。モデルと低用量のCHEグループの間で75の微分代謝産物が同定されました（21の上方制御および54のダウンレギュレート）。合計24の一般的な微分代謝産物が3つのグループで特定され、これらの22の代謝物が2つの比較グループ間で反対の調節傾向を示しています。これらの代謝物は、主にリノール酸代謝、エーテル脂質代謝、およびパントテン酸およびコエンザイムA生合成、ならびに13-ヒドロペルオキシルノール酸（13- hpode）、リソホスファチジルコリン酸、およびパンテチンなどの代謝物に関与していました。 CHEは、ラットの腎臓ヤン欠乏症の症状を改善し、生殖器官の損傷を緩和し、精子の質を高めることができます。脂質代謝の調節は、CHEがラットの生殖機能を改善する潜在的なメカニズムである可能性があります腎臓陽欠乏症。 CHEの潜在的な生物活性化合物には含まれますエキナコシド、ベルバスコシド、サリドロシド、ベタイン、シスタノシドA.
キーワード Cistanches Herba Extract; 腎臓陽欠乏症; oligasthenospermia;アデニン;メタボローム;脂質代謝
腎臓ヤン欠乏症症候群は、腎臓ヤン欠乏症、温暖化機能の失敗、およびQIの変換の失敗によって引き起こされる不足症候群の一種です。現代医学は、それが視床下部 - 下垂体 - ゴナダル（HPG）軸を含む神経内分泌障害によって引き起こされる代謝疾患であると考えています。臨床的男性患者は通常、性欲の低下、精液の容積の低下、精子の運動性の低さ、腰痛などの症状を示します。重度の症状は、不妊症や先天異常につながる可能性があります[1]。腎臓ヤンをウォーミングアップすることは、腎臓ヤン欠乏によって引き起こされる男性の不妊症の伝統的な漢方薬のコア治療法です[2]。 Cistanche Deserticolaは、オロバンチェ科の植物Cistanche Desirticola Ycmaのうろこ状の葉がある乾燥した肉質の茎です。それは、腎臓の陽を調整し、エッセンスと血液に利益をもたらす効果があります。腎臓の陽欠乏症、インポテンス、不妊症の治療によく使用されます[3]。統計によると、Cistanche Destericolaは、年齢を通じて腎臓の栄養と陽の強化処方において最も頻繁に使用される薬でもあります[4]。現代の薬理学的研究では、腎臓軸の総軸の恒常性と腎臓ヤン欠乏症のラットにおけるHPG軸の恒常性と視床下部 - 下垂体 - 副腎軸の恒常性を調節できることが、現代の薬理学的研究により、確認されています[5]。 Cistanche Deserticola Extractは、腎臓ヤン欠乏症のラットの精子形成と性機能障害を改善することもできます[{6-7]。ただし、これらの治療効果の潜在的なメカニズムは深く調査されていません。メタボロミクスは、代謝産物の変化と生物学的プロセスと全体的な方法で動的に組み合わされ、生理学的および疾患プロセスの代謝性、および薬物の薬力学的メカニズムを明らかにします。この全体的かつ動的な特徴は、伝統的な漢方薬の概念と一致しています[8]。したがって、この研究では、メタボロミクス技術を使用して、アデニンによって引き起こされる腎臓ヤン欠乏症のラットの生殖機能損傷に対するサイスチャンデザデュティコラ抽出物の有効性とメカニズムを探求し、腎臓ヤンを調整するシスタンチ砂漠産物の現代の科学的意味合いを説明しました。
1つの材料
1.1動物
50 SPFグレード9-週齢の男性SDラット、重量330-340 gは、Beijing Huafukang Biotechnology Co.、Ltd.、ライセンス番号SCXK（Beijing）2019-0008から購入しました。動物は、中国の中国医療科学アカデミー、中国のマテリアメディア研究所の実験動物センターのSPF動物室に保管され、自然の概日照明、一定の湿度と温度、自由な食事と活動を備えています。動物実験は、中国のマテリアメディカ研究所、中国医学アカデミーの実験的動物福祉の倫理的レビューを可決しました（倫理的承認番号2021B166）。
1.2薬
Cistanche Deserticolaのスライスは、1806016の北京Tongrentang（Chongwenmen Store）から購入され、Chinese Materia Medicaの研究者である中国医学アカデミーの研究者であるZhu Jingjingによって特定されました。 500 gのCistanche Deserticolaを計量して追加します
70％のエタノールの量の10倍逆流抽出物、フィルター、70％のエタノールの8倍を残留物に8倍加え、2.5時間、フィルター、2つのろ液を組み合わせ、粉末に複合抽出物を乾燥させる圧力を減らします。乾燥粉末収量は47％で、乾燥状態に保管してください。
1.3試薬
エキナコシド、ベルバスコシド、サリドロシド、ベタイン、シスチャンサイドA、チューブロシドA、およびカフェ酸は、バッチ番号JOT -10172、{1}}、{1}、{2}、{2 Jot -10165、Jot -11356、Jot11627、およびJot -10196、それぞれ;クロマトグラフィーグレードのアセトニトリル、クロマトグレードのメタノール、および分析グレードのリン酸は、Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co.、Ltd。から購入しました。アデニンは、Shanghai Yuanye Biotechnology Co.、Ltd。からバッチ番号S18009で購入しました。 L-カルニチン（LC）は、Batch Number 210372を搭載したShekharmaceutical Co.、Ltd.から購入しました。
カルセイン/PI細胞活性と細胞毒性検出キットは、Batch Number HR0444のBeijing Biolab Technology Co.、Ltd.から購入しました。テストステロン（T）酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ELISA）キットは、Wuhan Elaruite Biotechnology Co.、Ltd.、Batch Number e-EL -0155 c;から購入しました。アンモニア水は、バッチ番号10002108のSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。から購入しました。ヘマトキシリン - エオシン（HE）染色溶液は、北京Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.、Ltd.、Batch Number BSBA -4025から購入しました。
2.2 Cistanche Destericola抽出物の化学成分の分析
2.2.1参照ストックソリューションの準備
正確に10.41 mgのサリドロシド、11.19 mgのエキナコシド、10。86 mgのシスチャンサイドA、10.19 mgのチューブロシドA、10.28 mgのベルバスコシド、および10.67 mgのカフェ酸の膨張酸、膨張酸膨張、膨張酸、膨張酸、蒸気膨大酸の膨張酸、10.67 mg得るために。
2.2.2混合参照ソリューションの準備
正確にピペット1 mlの参照ストック溶液サリドロシド、5 mlのエキナコシド、2 mlのシスチャンサイドA、チューブロシド100μl、350μlのヴァバスコシド、100μlのカフェ酸、および同じ25 mlのボリューム測定フラスコに100μlのカフェ酸が、水を拡張します。正確に12.24 mgのベタインを10 mlの体積フラスコにし、50％メタノールを加えてマークに溶解して希釈し、よく振って、ベタイン参照溶液を取得します。
2.2.3試験溶液の準備
正確に310.14 mgのテストサンプルを25 mlの体積フラスコにし、水を加えてマークに溶解して希釈し、よく振ってフィルターします。
2.2.4クロマトグラフィー条件
ベタイン検出方法：Xamideカラム（4.6 mm×250 mm、5μm）;移動相アセトニトリル水（80:20）;列温度30度;流量1 ml・min -1;注入ボリューム10μl。
その他のコンポーネント検出条件：Kromasil 100-5- C18カラム（4.6 mm×250 mm、5μm）;移動相アセトニトリル（A）
および{{0}}}。1％リン酸溶液（b）;列温度30度;流量1 ml・min -1;注入容量10μl、勾配溶出（0〜10分、10％a; 10〜20分、10％〜15％a; 20〜25分、15％a; 25〜40分、15％〜22％a）。
2.3インデックス検出
2.3.1精巣上体精子動的パラメーター
ラットの腹腔は、その左の精巣上体を露出するために解剖されました。左の精巣上体の尾はすぐに切断され、37度の水浴で予熱された2 mLのフェノール赤色のDMEM培地に入れられました。それは眼科ハサミで断片に切断され、わずかに振って、すべての精子が精巣上体から泳ぎ、精子懸濁液を準備できるように、10分間インキュベートするために37度の水浴に入れました。精子カウントスライドに10μLの精子懸濁液を落とし、CASA技術を使用して、精子密度、平均経路速度（VAP）、曲線速度（VCL）、線形性（LIN）、WOBBLE（WOB）、まっすぐ（STR）、および鼓動クロス周波数（BCF）を観察および記録しました。
2.3.2精子の運動性と変形率
ピペット20μlの新たに調製された精子懸濁液懸濁液20μlは、ヨウ化前ヨウ化プロピジウム（PI）（希釈3 000）およびカルセイン-AM（希釈200回）混合染色溶液を37度の水浴で30分間インキュベートし、蛍光微小鏡下で観察します。異なる視野の200の精子ごとに、生き残った精子と移行精子の総数を数えます。生きている精子：精子の頭、体、尾はすべて緑色の蛍光であり、顕微鏡の下で精子の活動が見られます。遷移精子：精子の頭は赤い蛍光であり、体は明らかに緑色の蛍光です。この時点で、精子は移行期にあります。死んだ精子：精子頭のみが赤い蛍光であり、全身には緑色の蛍光がありません。
100μlの精子懸濁液を摂取し、60度の水浴に10分間不活性化してから5μlを描き、スライドに落とし、均等に広げてメタノールで固定し、エオシン染料で染色し、流水ですすぎ、耐えて乾燥させ、キシルンと透明にします。顕微鏡下で異なる畑の200の精子ごとに異常な精子の数を数え、比率を計算します。
2.3.3精巣上体および精巣の病理学的染色
室温で4％パラホルムアルデヒドに48時間固定した後、エピディミスと精巣組織を埋め込み箱に入れ、段階的エタノールで脱水し、パラフィンに埋め込み、スライスしました。脱ワックスと水分補給の後、彼は染色を行い、精巣顕微鏡下で精巣および精巣上体組織の病理学的変化が観察され、精巣性細管の構造、精巣上体の内腔の病変、および精子密度を決定しました。
2.3.4血清T含有量
軌道採血後、室温で2.5時間放置し、3 000 r・min -1で20分間遠心分離し、Tキットの指示に従って血清Tレベルを検出するために上清を採取しました。
2.4メタボロミクス分析
2.4.1血清サンプル調製
サンプリングの日に、ラットを麻酔し、腹部大動脈を介して全血を集めました。血液を室温で2.5時間保持し、3 000 r・min -1で2 0 minで遠心分離しました。上清を対応する数値を持つ2 mL遠心管に分割し、-80程度に保存されました。テストの前に4度で解凍し、渦はサンプルを混合し、5 0μlの血清サンプルを0.5 mL EPチューブに正確に転送し、20％アセトニトリルメタノール内部標準抽出物、渦混合、次に4度の中心であり、{15}} R. {15}} {15}} {15}} {15}} {15}}を使用します。上清を入れて、別のクリーンな0.5 mL EPチューブに入れ、30分間-20程度に立ち、4度で遠心分離します。
2.4.2クロマトグラフィー条件
Waters Acquity UPLC HSS T3 C18カラム（2.1 mm×1 0 0 mm、1.8μm）。携帯電話は0。水中（a）および0.1％の形成酸アセトニトリル溶液（b）、勾配溶出（0-11 min、5％-90％b; 11-12 min、90％b; {17}} {17}} 1分} 11-12 min、90％b; b; 1-14 min、5％b）。カラム温度は40度で、流量は0.40 ml・min -1でした。
2.4.3質量分析条件
エレクトロスプレーイオン源は、正および負のイオンモードでスキャンされました。スプレーガスは50 psi（1psi≈6.895kpa）、補助加熱ガスは60 psi、カーテンガスは35 psi、イオン源温度は550度でした。正のイオンモードでは、イオン化電圧は5 500 Vで、高感度モードが採用され、崩壊する電圧は60 V、衝突エネルギーは30 Vでした。負のイオンモードでは、イオン化電圧は-4 500 v、{11} {11}} {11} {11}} Vは{11} {11}} Vでした。半定量データの感度スキャンモードが採用されました。
2.4.4データ処理と分析
LC-MS検出の生データは、ProteowizardソフトウェアによってMZML形式に変換され、XCMSソフトウェアパッケージはピーク抽出、アライメント、保持時間補正に使用されました。サポートベクトル回帰分析（SVR）を使用してピーク領域を修正し、5 0％を超える速度が欠落しているピークがフィルタリングされました。スクリーニング後のピークは、公共図書館、Wuhan Metwell Biotechnology Co.、Ltd。によって構築されたデータベース、およびMetDNAアルゴリズムに統合され、代謝産物の構造情報を特定しました。その後、Rパッケージを使用して、それぞれ学生のt検定法と直交部分最小二乗識別分析（OPLS-DA）を使用して、単変量統計分析と多変量統計分析を実行しました。微分代謝産物スクリーニング条件は、投影（VIP）> 1、両面検定p <0 .05、およびこの状態で得られた微分代謝産物が、遺伝子とゲノム（KEGG）化合物データベースの京都百科事典（kEGG/kegg.jp/kegg/kegg.jp/kegg/kegg/kegg/kegg/kegg/kegg/kegg/kegg/kegg.jp.phund）を使用して注釈を付けたように設定されました。取得したcpd _ idはメタボアナリスト6.0ウェブサイトに入力されました
（https://www.metaboanalyst.ca/）濃縮分析のため。高幾何学テストのPを使用して、重要な濃縮を伴う重要な経路を特定しました。
2.5統計分析
±Sは平均±標準偏差（𝑥̅±S）として表され、一元配置分散分析を使用して、複数のグループ間でデータを比較しました。 p<0.05 was considered statistically significant.
